蘇　暢，周海生，郭淑玲，蘇銳鋒，付笑笑，譚小波，李　偉

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院眼科，河北 承德 067000)

視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷(retinal ischemia-reperfusion injury,RIRI)是臨床常見視網(wǎng)膜病變眼科疾病，繼發(fā)于視網(wǎng)膜中央動脈阻塞、青光眼和眼外傷等，常常導(dǎo)致視網(wǎng)膜細(xì)胞死亡，對患者視功能造成不可逆損害，是目前國內(nèi)外臨床眼科研究的重點[1]。RIRI病理機制十分復(fù)雜，包括氧化應(yīng)激、炎癥及神經(jīng)元細(xì)胞凋亡壞死等[2]。研究[3]顯示氧化應(yīng)激及炎癥損傷在RIRI機制中占據(jù)重要地位。白藜蘆醇是一種多酚化合物，存在于葡萄、紅酒等多種食材中，臨床上對許多眼科疾病具有一定的治療作用[4-5]。大量研究[6-7]顯示：白藜蘆醇具有很強的多酚抗氧化能力，可以保護細(xì)胞的DNA，修復(fù)受損細(xì)胞，在腦缺血灌注損傷、小鼠視網(wǎng)膜血管退行性損傷及體外視神經(jīng)病變中均起到神經(jīng)保護作用。但目前關(guān)于白藜蘆醇對RIRI引起的視網(wǎng)膜神經(jīng)損傷作用報道尚不多見。本實驗對RIRI大鼠進行治療后，研究白藜蘆醇對視網(wǎng)膜組織中Caspase-3和Bcl-2表達的影響及作用機制，為其臨床應(yīng)用提供實驗數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實驗動物、藥物、主要試劑和儀器SPF級SD大鼠90只，雄性，體質(zhì)量為(200±20) g，購自河北省實驗動物中心，動物合格證號：SCXK(冀)2013-1-003。白藜蘆醇(美國Sigma-Aldrich公司)，水合氯醛(廣州中鏡科儀技術(shù)有限公司)，復(fù)方托吡卡胺滴眼液(北京華潤雙鶴藥業(yè)股份有限公司)，鼠抗地高辛抗體和生物素化過氧化物酶(北京中山生物公司)，兔抗大鼠Claudin-3、Bcl-2和β-actin抗體(美國Invitrogen公司)，DAB 顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司) 。20號留置針和微量注射器(上海上醫(yī)康鴿醫(yī)用器材有限責(zé)任公司)，倒置顯微鏡(日本日立公司)，蛋白垂直電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-rad公司)。

1.2建立大鼠RIRI模型參照參考文獻[8-9]，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，選取大鼠右眼，使用復(fù)方托吡卡胺滴眼液散瞳。沿大鼠顳側(cè)角鞏膜緣，將連接生理鹽水輸液管的20號留置針穿刺入大鼠前房。緩慢調(diào)整生理鹽水瓶液面高度150 cm，此時眼內(nèi)眼壓達到110 mmHg，眼底血管斷流，視網(wǎng)膜水腫呈蒼白色。前房加壓持續(xù)1 h后緩慢降低輸液瓶至大鼠眼水平，恢復(fù)血液供應(yīng)，視網(wǎng)膜呈橘紅色，拔出針頭。假手術(shù)組僅用20號留置針穿刺入大鼠前房，不升高眼壓。

1.3實驗動物分組和藥物干預(yù)取90只SD大鼠，隨機分為假手術(shù)組、模型組和治療組，每組30只。造模前0.5 h，治療組大鼠用微量注射器于大鼠玻璃體腔內(nèi)注射0.5 nmol·L-1的白藜蘆醇5 μL，用電灼筆電凝扎針部位。假手術(shù)組與模型組大鼠分別給予等體積0.5%乙醇。

1.4各組大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)觀察和內(nèi)層厚度測定分別于術(shù)后1、6、12、24和48 h取各組大鼠6只，腹腔注射麻醉處死大鼠摘取眼球，置于4%甲醛溶液中固定24 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透化，石蠟包埋，切片。行HE染色，利用倒置顯微鏡觀察視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)。采用圖像分析系統(tǒng)采集數(shù)碼圖像，應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0專業(yè)圖像分析軟件系統(tǒng)，測定各組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度，隨機選取4點測定，取其平均數(shù)。按試劑盒說明書，采用TUNEL法檢測視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡的表達，凋亡陽性細(xì)胞主要在細(xì)胞核表達，細(xì)胞核染成黃色或棕黃色，從圖像分析儀上取樣，利用計算機分別計算出凋亡陽性細(xì)胞數(shù)目，取其平均值。

1.5免疫組織化學(xué)法檢測凋亡基因Caspase-3和Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)取切片脫蠟，梯度酒精復(fù)水，蒸餾水沖洗3 min，置于3%過氧化氫甲醇溶液中浸泡30 min，蒸餾水沖洗3 min。將切片浸入修復(fù)液(0.01 mol·L-1枸掾酸鈉緩沖液)中，加熱至80℃， 加入修復(fù)液，140℃保持2 min，冷卻至室溫，PBS沖洗3次，滴加山羊血清封閉液，室溫20 min， 棄去多余液體，滴加稀釋度為1∶600的一抗Caspase-3和Bcl-2各30 μL，4℃孵育過夜。PBS沖洗3次，滴加二抗PV6001，37℃孵育0.5 h，PBS沖洗3次。加DAB 顯色，水沖洗0.5 h，蘇木素復(fù)染，光鏡下觀察控制顯色反應(yīng)時間5～10 min,終止顯色反應(yīng)。蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片，封片，置于光學(xué)顯微鏡下觀察，以細(xì)胞漿染成黃色或棕黃色為Caspase-3和Bcl-2陽性表達，采用多功能真彩色細(xì)胞圖像分析管理系統(tǒng)進行分析，計數(shù)每個視野陽性細(xì)胞數(shù)，相加取其平均值。

1.6Western blotting法檢測視網(wǎng)膜組織中Caspase-3和Bcl-2蛋白表達水平取視網(wǎng)膜組織，剪碎勻漿，加入組織裂解液提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度，采用Western blotting試劑盒進行蛋白定量。每組取50 μg蛋白上樣量進行電泳，經(jīng)轉(zhuǎn)印后分別檢測Caspase-3和Bcl-2蛋白表達，結(jié)果采用凝膠成像分析儀進行灰度分析，以目的條帶和β-actin條帶蛋白吸光度(A)值比值表示蛋白的相對表達水平。

2　結(jié)　果

2.1各組大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)假手術(shù)組大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)完整，鞏膜面向玻璃體依次為外核層、內(nèi)核層和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層，細(xì)胞核排列整齊。模型組大鼠造模后1 h視網(wǎng)膜組織水腫，可見神經(jīng)節(jié)細(xì)胞空泡樣變性；造模后6 h，細(xì)胞層排列呈現(xiàn)疏松狀；造模12 h后，視網(wǎng)膜組織水腫明顯，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞排列較稀疏；造模后24 h，視網(wǎng)膜水腫減輕，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)目大量減少，邊界模糊，神經(jīng)纖維層明顯變?。辉炷?8 h后，視網(wǎng)膜組織水腫消退，視網(wǎng)膜內(nèi)層明顯變薄萎縮，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)減少。與模型組比較，治療組大鼠各時間點視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)、損傷程度及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞變性程度均減輕。見圖1(插頁五)。

2.2各組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度與假手術(shù)組比較，模型組大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注后1、6、12、24和48 h視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度均明顯減小(P<0.05)；與模型組比較，治療組各時間點大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度均明顯增加(P<0.05)。見表1。

表1各組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度

GroupThicknessofretina(t/h)　　16122448Shamoperation106．13±5．26104．98±4．92105．52±5．29106．71±5．81105．01±4．85Model143．76±7．48?83．36±3．47?77．31±3．71?61．62±3．80?66．87±3．23?Treatment120．84±5．54△88．85±4．4184．58±4．04△91．49±5．18△92．61±5．20△

*P<0.05 compared with sham operation group；△P<0.05 compared with model group.

2.3各組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況與假手術(shù)組比較，模型組大鼠各時間點視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)明顯增加(P<0.01)；模型組內(nèi)不同時間點之間凋亡細(xì)胞數(shù)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，治療組大鼠各時間點視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)明顯減少(P<0.05)；治療組內(nèi)不同時間點之間凋亡細(xì)胞數(shù)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.4各組大鼠視網(wǎng)膜組織中Caspase-3和Bcl-2表達與假手術(shù)組比較，模型組大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注后1、6、12、24和48 h視網(wǎng)膜組織中Caspase-3和Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)明顯升高(P<0.05)；模型組組內(nèi)不同時間點間陽性細(xì)胞數(shù)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，治療組大鼠各時間點視網(wǎng)膜組織中Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)明顯降低(P<0.05)，而大鼠視網(wǎng)膜組織中Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加(P<0.05)。見表3。

表2各組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)

GroupNumberofapoptoticcells(t/h)　　16122448Shamoperation0．11±0．010．09±0．010．10±0．010．08±0．010．12±0．01Model14．47±1．28?22．40±1．49?30．11±1．93?20．24±1．87?8．41±0．91?Treatment12．71±1．33△14．03±1．75△19．37±2．01△15．11±1．02△5．64±0．83△

*P<0.01 compared with sham operation group；△P<0.05 compared with model group.

表3各組大鼠視網(wǎng)膜組織中Caspase-3和Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)

GroupNumberofCaspase?3positivecells(t/h)　　16122448Shamoperation0．52±0．010．65±0．020．56±0．010．60±0．010．56±0．03Model8．55±0．71?10．71±1．20?15．96±1．11?17．43±2．48?4．73±0．87?Treatment2．70±0．64△3．29±0．97△3．79±0．83△4．04±0．57△2．38±0．41△GroupNumberofBcl?2positivecells(t/h)　　16122448Shamoperation1．34±0．141．47±0．321．31±0．371．54±0．291．48±0．36Model15．39±1．59?17．81±2．43?22．54±3．79?28．85±5．76?20．01±4．44?Treatment20．44±4．31△25．75±6．13△30．11±5．66△40．03±8．91△27．93±4．18△

*P<0.05 compared with sham operation group；△P<0.05 compared with model group.

2.5各組大鼠視網(wǎng)膜組織中Caspase-3和Bcl-2蛋白表達水平Western blotting法檢測結(jié)果顯示：Caspase-3和Bcl-2蛋白在目的條帶處出現(xiàn)灰色條帶，假手術(shù)組蛋白表達水平正常，模型組表達水平明顯升高(P<0.05或P<0.01)。與模型組比較，治療組各時間點大鼠視網(wǎng)膜組織中Bcl-2蛋白表達水平均升高；24和48 h時治療組Bcl-2蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)；而1、6和12 h時差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。治療組各時間點Caspase-3蛋白表達水平均低于模型組(P<0.05)。見圖2和3。

Lane 1：Sham operation group； Lane 2-5：Model group(1，12，24， and 48 h)；Lane 6-9：Treatment group(1，12，24， and 48 h).

圖2各組大鼠視網(wǎng)膜組織中Caspase-3和Bcl-2蛋白表達電泳圖

Fig.2Electrophoregram of expressions of Caspase-3 and Bcl-2 proteins in retina tissue of rats in various groups

*P<0.05 compared with sham operation group；△P<0.05 compared with model group.

圖3各組大鼠視網(wǎng)膜組織中Caspase-3(A)和Bcl-2(B)蛋白表達水平

Fig.3Expression levels of Caspase-3(A) and Bcl-2(B) proteins in retina tissue of rats in various groups

3　討　論

RIRI是指當(dāng)視網(wǎng)膜組織缺血缺氧、恢復(fù)血液供氧后，加重視網(wǎng)膜形成不可逆性損傷，是臨床上比較常見的一種眼部疾病[10]，多見于閉角型青光眼急性發(fā)作、視網(wǎng)膜中央動脈阻塞、糖尿病視網(wǎng)膜病變以及眼科手術(shù)等[11]。目前基礎(chǔ)研究主要利用RIRI動物模型，合適的動物模型是基礎(chǔ)實驗成功的前提條件。本實驗采用前方內(nèi)灌注生理鹽水和升高眼壓法[12-13]建立RIRI模型，該模型可操作性強，可完全阻斷視網(wǎng)膜血流，過程穩(wěn)定，成功率高，對視網(wǎng)膜其他組織損傷較小。造模后RIRI模型大鼠視網(wǎng)膜組織水腫，可見神經(jīng)節(jié)細(xì)胞空泡樣變性，細(xì)胞層排列呈疏松狀，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)目大量減少，邊界模糊，神經(jīng)纖維層明顯萎縮變薄，提示造模成功。

RIRI的發(fā)病機制較為復(fù)雜，目前的研究水平還無法完全闡明其作用機制，研究[14-15]顯示：RIRI的機制包括氧自由基產(chǎn)生過多、白細(xì)胞和炎癥因子的大量浸潤等多因素介導(dǎo)的復(fù)雜病理生理過程。細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是RIRI后神經(jīng)細(xì)胞損傷的主要方式，而炎癥反應(yīng)機制參與RIRI發(fā)病起始和整個疾病過程。Bcl-2是一種凋亡抑制基因，而Caspase-3則是凋亡執(zhí)行基因，兩者與細(xì)胞凋亡的關(guān)系非常密切[16-17]。研究[18-19]顯示：Bcl-2和Caspase-3是非常重要的凋亡基因，是評價細(xì)胞凋亡程度的指標(biāo)，在眼科相關(guān)疾病的發(fā)病機制中占有重要的地位。

本研究通過觀察RIRI大鼠視網(wǎng)膜顯微結(jié)構(gòu)的變化發(fā)現(xiàn)：白藜蘆醇可以有效保護 RIRI 大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)，改善損傷程度及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞變性程度，明顯減輕大鼠視網(wǎng)膜組織水腫，抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。研究[20-21]顯示：缺血區(qū)出現(xiàn)炎癥細(xì)胞因子的積聚是缺血再灌注最早期的反應(yīng)，炎癥反應(yīng)在RIRI發(fā)病機制中同樣起著重要作用。有學(xué)者[22-23]將Caspases抑制因子應(yīng)用于RIRI模型中發(fā)現(xiàn)：Caspases抑制因子可減少RIRI視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞死亡,且Caspase-3與RIRI神經(jīng)元凋亡有關(guān)。本研究結(jié)果顯示：視網(wǎng)膜組織形態(tài)上，治療組均較模型組明顯改善，說明白藜蘆醇可以減輕RIRI。Western blotting檢測結(jié)果提示：與模型組比較，治療組不同時間點大鼠視網(wǎng)膜組織中Bcl-2蛋白表達水平明顯升高，尤其是術(shù)后24和48 h，而治療組Caspase-3蛋白表達水平均明顯低于模型組。說明白藜蘆醇能夠降低RIRI視網(wǎng)膜組織中相關(guān)蛋白Caspase-3表達水平及升高組織中Bcl-2的表達水平。

綜上所述，白藜蘆醇對RIRI大鼠的視網(wǎng)膜神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)有改善作用，其作用機制可能與其能降低RIRI大鼠視網(wǎng)膜組織中Caspase-3蛋白水平表達水平及增加Bcl-2蛋白的表達水平有關(guān)，且可抑制大鼠RIRI時視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。

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