丁振東，張玉影，張　宇，鐘　越，溫　娜，于洪泉，齊　玲

(1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)外科, 吉林 長春 130021; 2. 吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)教研室,吉林 長春 130021;3. 吉林醫(yī)藥學(xué)院病理教研室, 吉林 吉林 132013)

腦腫瘤因位于顱內(nèi)，所處位置極為特殊，一旦發(fā)生腫瘤就會對患者的生命產(chǎn)生嚴(yán)重的威脅，同時，也使患者的生活質(zhì)量明顯下降，更給家庭帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。近年腫瘤生物學(xué)研究[2-3]顯示：腦腫瘤中存在的一小群干細(xì)胞是其發(fā)生、復(fù)發(fā)及耐藥的源頭，目前對其仍缺乏有效的治療藥物。本課題組此前研究[4]發(fā)現(xiàn)：五味子多糖(Schisandra chinensis polysaccharide, SCP)和五味子木脂素均能明顯抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長，且SCP作用于腦腫瘤干細(xì)胞(brain tumor stem cells，BTSCs)的機(jī)制尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報道。因此本文作者觀察SCP對BTSCs生長的作用，且初步闡明其作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1主要試劑和儀器SCP(中國藥品生物制品檢定所)，DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液、神經(jīng)培養(yǎng)基、B27和小牛血清(美國Gibco公司)，CD133免疫磁珠(美國Miltenyi Biotec公司)，堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)和表皮生長因子(EGF)(英國PeproTech公司)，木瓜蛋白酶(美國Worthington DBA公司)，二甲基亞楓(DMSO)和四甲基偶氮唑(MTT)(美國Sigma公司)，Bax、Bcl-2和Caspase-3抗體(北京中杉公司)。CB150型CO2培養(yǎng)箱(德國Binder公司)，PLUS 384型全自動酶標(biāo)儀(美國MDC公司)，Ⅸ-70型倒置顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)和觀察人腦腫瘤組織由吉林大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)外科提供，病理診斷均為Ⅲ-Ⅳ級腦膠質(zhì)瘤。將瘤組織剪成1 mm×1 mm×1 mm組織塊，置入15 mL離心管中，加木瓜蛋白酶10 mL混勻，置37℃水浴45 min，其間不時振蕩，3 mL卵類黏蛋白液終止反應(yīng)。反復(fù)吹打，300 g離心5 min，再加入紅細(xì)胞去除液振蕩10 min。再次離心后將細(xì)胞用無血清培養(yǎng)液洗滌(神經(jīng)培養(yǎng)基加入B27、EGF和bFGF均為20 μg·L-1)，離心后重懸細(xì)胞，臺盼藍(lán)計數(shù)后將細(xì)胞以2×106·25 cm2密度種于培養(yǎng)瓶中，5% CO2、37℃、飽和濕度下培養(yǎng)過夜。

1.3 CD133免疫磁珠篩選BTSCs次日收集細(xì)胞將其吹打成單細(xì)胞后用70 μm濾器過濾，計數(shù)活細(xì)胞。用分選緩沖液進(jìn)行細(xì)胞洗滌，800 g離心3 min，將細(xì)胞用300 μL分選緩沖液重新混勻后加入CD133免疫磁珠100 μL，4℃避光孵育30 min，緩沖液再次洗滌，800 g離心10 min，棄上清后緩沖液進(jìn)行細(xì)胞重懸。500 μL緩沖液進(jìn)行分選柱沖洗，細(xì)胞懸液壓力過柱，反復(fù)用緩沖液沖洗分選柱3次，移分選柱出磁場，最后用1 mL緩沖液洗先選柱，用泵加壓，收集的洗液為CD133+細(xì)胞，即BTSCs。

1.4檢測干細(xì)胞表面抗原收集生長的神經(jīng)球，800 g低速離心3 min，PBS液洗滌沉淀，將神經(jīng)球轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，4% 多聚甲醛固定，0.3% Triton X-100通透細(xì)胞。5%驢血清室溫封閉1 h，一抗(Nestin 1∶200；CD133 1∶100)4℃過夜，加入相應(yīng)的二抗(Tex-Red或FITC 1∶200)，室溫下避光孵育1 h。DAPI染核后封片，次日用熒光顯微鏡觀察，拍照。

1.5細(xì)胞生長能力分析將BTSCs制成單細(xì)胞懸液，按細(xì)胞密度為5×103個/孔接種于96孔板，置于37℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)過夜。次日，加入SCP(用含5%小牛血清的培養(yǎng)基配制，濃度分別為0、200、400和800 μg·L-1)，每組設(shè)5個復(fù)孔，加藥24 h，每孔加入MTT 20 μL，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育4 h，棄上清后每孔加入150 μL DMSO，振蕩混勻后酶標(biāo)儀檢測各孔490 nm處吸光度(A)值，計算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率=(用藥組A值/對照組A值)×100%。

1.6細(xì)胞凋亡率測定將BTSCs機(jī)械分離成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞以5×105個/孔密度種于6孔板中，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中過夜。實驗分為對照組(0 μg·L-1)和SCP組(藥物濃度為800 μg·L-1)，作用24 h后離心收集細(xì)胞。PBS 洗滌細(xì)胞后，用1∶4 binding buffer 緩沖液190 μL重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，加入FITC標(biāo)記的Annexin Ⅴ FITC 5 μL和20 mg·L-1PI 10 μL，置冰上10 min，流式細(xì)胞儀檢測各樣品中每10 000個細(xì)胞中的凋亡細(xì)胞，計算細(xì)胞凋亡率，軟件分析得出結(jié)果。

1.7各組BTSCs中Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達(dá)各劑量SCP作用于BTSCs，留取上清液，將包被液與上清1∶1比例包被，4℃過夜，次日封閉后加入Bax、Caspase-3、Bcl-2(1∶1 000)，4℃過夜。加入二抗(1∶1 000)，37℃水浴1 h，顯色自動酶標(biāo)儀490 nm處測定A值。以A值表示Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達(dá)水平。

2　結(jié)　果

2.1神經(jīng)球CD133和Nestin表達(dá)情況CD133免疫磁珠分選后的細(xì)胞在培養(yǎng)液中呈懸浮生長，約6 h開始形成小神經(jīng)球，隨培養(yǎng)時間延長神經(jīng)球逐漸增大，約3 d形成典型的神經(jīng)球。免疫熒光染色法檢測CD133和Nestin表達(dá)顯示：神經(jīng)球中CD133和Nestin均呈明顯陽性表達(dá)。見圖1(插頁五)。

2.2各組BTSCs的增殖率與對照組比較，200、400和800 mg·L-1SCP組SCP作用于BTSCs 24 h時，BTSCs的增殖率下降，尤其400和800 mg·L-1SCP組細(xì)胞增殖率明顯下降(P<0.05)。見表1。

表1各組 BTSCs的增殖率

GroupDose(mg·L-1)ProliferationrateControl0100．00±3．77SCP20086．79±9．2040077．35±7．43?80073．58±7．41?

*P<0.05 compared with control group.

2.3各組BTSCs的凋亡率800 mg·L-1SCP組SCP作用BTSCs 24 h時，細(xì)胞凋亡率為(9.28±2.35)%，與對照組(0.00%±0.27%)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

A:Control group;B:800 mg·L-1 SCP group.

Fig.2Apoptotic rates of BTSCs in various groups detected by flow cytometry

2.4各組BTSCs中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平ELISA法檢測結(jié)果顯示：與對照組比較，各劑量SCP組BTSCs中Bax蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)，800 mg·L-1SCP組Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)，各劑量SCP組Bax/Bcl-2比值明顯升高(P<0.05)。與對照組比較，各劑量SCP組Caspase-3蛋白表達(dá)水平升高，800 mg·L-1SCP組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

表2各組BTSCs中Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達(dá)水平

GroupDose(mg·L-1)BaxBcl?2Bax/Bcl?2Caspase?3Control　00．71±0．062．34±0．100．31±0．061．60±0．48SCP2001．26±0．04?2．20±0．020．57±1．28?1．73±0．494001．41±0．09?2．18±0．260．64±0．03?1．75±0．258001．42±0．07?1．55±0．01?0．91±0．05?2．05±0．48??

*P<0.05,**P<0.01 compared with control group.

3　討　論

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最為常見的原發(fā)性腫瘤，惡性程度極高[5]。近年來，惡性腫瘤發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，在腦腫瘤中以惡性膠質(zhì)瘤發(fā)病率的升高最為明顯[6]。一項多中心進(jìn)行的分類調(diào)查[7]表明：中國的原發(fā)性腦腫瘤發(fā)病率為22.52/10萬。其中，腦膠質(zhì)瘤占29.78%。因此，如何有效地控制甚至治愈膠質(zhì)瘤是亟待解決的難題。

五味子是一種五味俱全、五行相生的果實，其能對人體五臟——心、肝、脾、肺及腎發(fā)揮平衡作用。有研究[8]顯示：五味子抗腫瘤活性主要集中在木脂素和多糖成分。20世紀(jì)90年代，眾多學(xué)者從五味子水溶液中分離得到SCP，并對其藥理活性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其在保肝、提高免疫力、抗疲勞和抗腫瘤等[9-13]方面有廣泛的應(yīng)用前景。黃玲等[9]研究SCP抑瘤率及其對免疫器官的影響發(fā)現(xiàn)：SCP能抑制S180荷瘤的增長，并且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，抑瘤率可以達(dá)到74.5%。雖然已有SCP抗腫瘤的相關(guān)報道，但尚未見有關(guān)SCP對BTSCs生長的作用和機(jī)制的研究報道。

本課題組分離、提取原代腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞，利用CD133免疫磁珠分選法獲得CD133+細(xì)胞，并進(jìn)行神經(jīng)球干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD133和Nestin檢測，證實所用細(xì)胞為BTSCs。不同劑量SCP作用BTSCs時：200、400和800 mg·L-1SCP均可以抑制細(xì)胞的生長，尤其400和800 mg·L-1SCP組BTSCs的增殖率明顯下降。以上結(jié)果表明：不同劑量SCP均可抑制BTSCs的生長，并且呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)。

細(xì)胞凋亡是廣泛存在于生理和病理狀態(tài)下的有序的受一系列基因嚴(yán)格控制的程序化死亡，是級聯(lián)式基因表達(dá)的結(jié)果，腫瘤的發(fā)生可能是腫瘤細(xì)胞凋亡受阻所致[15-16]。本課題組采用Annexin Ⅴ-PI分析BTSCs凋亡率發(fā)現(xiàn)：與對照組比較，800 mg·L-1SCP組細(xì)胞凋亡率明顯升高；表明SCP可以誘導(dǎo)BTSCs發(fā)生凋亡。目前，在細(xì)胞凋亡研究中占主要地位的有2個信號途徑，即線粒體途徑和死亡受體途徑[14]。在線粒體途徑中Bax與Bcl-2始終倍受關(guān)注，兩者的比值決定了細(xì)胞是否發(fā)生凋亡[17-19]。而Caspases家族是凋亡的主要執(zhí)行者，其中，Caspases-3是其中最為關(guān)鍵的因子之一，其負(fù)責(zé)對凋亡最后階段的關(guān)鍵性蛋白的酶切[20-22]。本實驗結(jié)果顯示：隨著SCP劑量的升高，各劑量SCP組細(xì)胞中Bax蛋白和Caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯升高，Bcl-2蛋白表達(dá)水平減少，Bax/Bcl-2比值升高。因此SCP通過上調(diào)Bax/Bcl-2的比值促使BTSCs促凋亡因子占優(yōu)勢，活化Caspase-3增加，引起B(yǎng)TSCs發(fā)生凋亡，從而抑制了BTSCs的生長。

本實驗針對五味子中抗癌多糖成分，研究SCP對BTSCs生長的抑制作用。通過研究發(fā)現(xiàn)其可劑量依賴性地抑制BTSCs的增殖。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)：SCP誘導(dǎo)BTSCs凋亡可能是原因之一。但SCP抑制BTSCs的機(jī)制還需要深入研究。

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