鐘莉莉，趙銀龍，李炳錦，鄒曉晗，程子倩，崔然吉

(1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院研究中心 吉林省重大疾病分子與化學(xué)遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130041；2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，吉林 長(zhǎng)春 130041)

卵巢癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一,其發(fā)病率僅次于子宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌，居?jì)D科惡性腫瘤的第3位，但其病死率卻高居?jì)D科腫瘤的首位[1-2]。放射治療是卵巢癌治療中常用的一種局部治療手段，特別是在晚期卵巢癌治療中起著越來越重要的作用，其機(jī)制是通過放射線的電離作用抑制和殺滅腫瘤細(xì)胞[3]。但在實(shí)際治療過程中，經(jīng)常遇到輻射不敏感或輻射抵抗的現(xiàn)象[4]，其機(jī)制尚不完全明確。

MicroRNA(miRNA)是一組由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度為20～24個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子[5]。近年來研究[6-7]表明: miRNA表達(dá)水平與腫瘤的形成、腫瘤細(xì)胞的增殖和治療均有著密切的聯(lián)系。與其他類型腫瘤一樣，卵巢癌miRNA表達(dá)也有其特殊的異常，已有研究[8-9]顯示：miR-16、 miR-96、 miR-141和miR-200等miRNA在卵巢癌組織中異常高表達(dá), miR-140、miR-145和miR-199a等miRNA在卵巢癌組織中異常低表達(dá)，與卵巢癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展有關(guān)；另有研究[10]顯示：miR-210與卵巢癌的化療耐藥有關(guān)，但miR-210與卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和放射治療的關(guān)聯(lián)性目前尚無相關(guān)報(bào)道。本研究探討miR-210對(duì)卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響及其與放射治療敏感性的關(guān)系，并進(jìn)一步闡明miR-210在卵巢癌發(fā)展和治療中的作用及其可能的分子機(jī)制，為卵巢癌的放射治療提出新的觀點(diǎn)，為臨床卵巢癌早期診斷、治療效果預(yù)測(cè)提供可能的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞株﹑主要試劑與儀器人卵巢癌細(xì)胞株OVCAR3和SKOV3購(gòu)于美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞培養(yǎng)用的RPMI-1640培養(yǎng)基﹑胎牛血清、青鏈霉素抗生素試劑和胰蛋白酶，miR-210 mimic、anti-miR-210抑制劑，Lipofectamine 2000，BCA Protein Assay Kit，TaqMan MicroRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和Super Singal West Dura發(fā)光試劑盒(美國(guó) Invitrogen公司)；MTT和DMSO(美國(guó) Amresco公司)；一抗和二抗(美國(guó)CST公司)。細(xì)胞培養(yǎng)箱﹑PCR儀和酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(美國(guó)Thermo公司)，倒置顯微鏡(日本 Olympus公司)，核酸電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-rad公司)，細(xì)胞照射設(shè)備(美國(guó)Varian 23Ex醫(yī)用高能電子直線加速器)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)卵巢癌細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，放置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)80%時(shí),用0.25%胰蛋白酶消化傳代(1∶3),用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3構(gòu)建過表達(dá)miR-210和低表達(dá)miR-210的卵巢癌細(xì)胞株采用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑，根據(jù)試劑盒說明書，將miR-210 mimic和anti-miR-210抑制劑分別轉(zhuǎn)染至卵巢癌細(xì)胞株。轉(zhuǎn)染48 h后，提取總RNA，用TaqMan MicroRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,采用Real-time PCR法檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞株中miR-210的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)以GAPDH作為內(nèi)部參照。結(jié)果計(jì)算采用比較閾值法，即目的基因的量=2-ΔΔCt，將Real-time PCR得到的Ct值轉(zhuǎn)化成miRNA的擴(kuò)增倍數(shù)，ΔΔCt=(實(shí)驗(yàn)組Ct目的基因-實(shí)驗(yàn)組Ct內(nèi)參基因)-(對(duì)照組Ct目的基因-對(duì)照組Ct內(nèi)參基因)。

1.4MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期經(jīng)轉(zhuǎn)染的卵巢癌細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×104mL-1。于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，將細(xì)胞置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中孵育。每48 h取3孔細(xì)胞，每孔加入10 μL MTT溶液(5 g·L-1)，然后繼續(xù)培養(yǎng)4 h，之后取出細(xì)胞,每孔加入150 μL DMSO，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解,在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm處測(cè)量各孔的吸光度(A)值，以A值代表卵巢癌細(xì)胞的增殖活性。

1.5MTT法檢測(cè)電離輻射條件下過表達(dá)miR-210卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)細(xì)胞照射條件：美國(guó)Varian 23Ex醫(yī)用高能電子直線加速器，6 MV X射線照射，照射源到液面距離100 cm,劑量率300 cGy·min-1。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的過表達(dá)miR-210的卵巢癌細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。采用不同劑量(30、50和100 Gy)的離子輻射作用于細(xì)胞，然后消化處理細(xì)胞轉(zhuǎn)種至96孔板,采用MTT法檢測(cè)經(jīng)放射處理后的過表達(dá)miR-210卵巢癌細(xì)胞的增殖活性，操作步驟見1.4。

1.6Western blotting法檢測(cè)電離輻射條件下過表達(dá)miR-210卵巢癌細(xì)胞中相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)收集經(jīng)放射處理后的卵巢癌細(xì)胞，加入適量細(xì)胞裂解液于冰上靜置15 min后，低溫下離心，收取上清液，用BCA Protein Assay Kit測(cè)定細(xì)胞總蛋白濃度。將待電泳的蛋白樣品用SDS-PAGE蛋白電泳上樣緩沖液混和，于100℃加熱5 min。將蛋白樣品加樣于SDS-PAGE進(jìn)行電泳分析，然后依次進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，于室溫下采用5%脫脂奶粉封閉1 h后，加入一抗于4℃孵育過夜。次日洗膜后加入二抗于室溫下孵育1 h。使用Super Singal West Dura發(fā)光試劑盒檢測(cè)目的蛋白的表達(dá),以GAPDH作為內(nèi)參蛋白,得到的條帶采用凝膠成像分析儀進(jìn)行灰度分析。

2　結(jié)　果

2.1Real-time PCR法鑒定過表達(dá)和低表達(dá)miR-210卵巢癌細(xì)胞模型卵巢癌細(xì)胞株OVCAR3和SKOV3轉(zhuǎn)染miR-210 mimic及anti-miR-210抑制劑后，采用Real-time PCR法驗(yàn)證miR-210在OVCAR3和SKOV3細(xì)胞中的表達(dá)量。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染miR-210 mimic后，OVCAR3和SKOV3細(xì)胞中miR-210表達(dá)水平明顯升高，而anti-miR-210抑制劑則抑制了OVCAR3和SKOV3細(xì)胞中miR-210的表達(dá)(P<0.05)。見表1。

表1轉(zhuǎn)染后卵巢癌細(xì)胞中miR-210表達(dá)水平

MiRNAOVCAR3ControlMiR?210mimicControlAnti?miR?210inhibitorSKOV3ControlMiR?210mimicControlAnti?miR?210inhibitormiR?210580±2023000±501?575±15200±10?400±2519000±300?410±35180±20?

*P<0.05 compared with control group.

2.2過表達(dá)和低表達(dá)miR-210卵巢癌細(xì)胞增殖活性細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，MTT法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞增殖活性結(jié)果顯示：增加miR-210表達(dá)水平，OVCAR3和SKOV3細(xì)胞增殖活性增加(P<0.05)；降低miR-210表達(dá)水平，OVCAR3和SKOV3細(xì)胞增殖活性降低(P<0.05)。見表2。

表2過表達(dá)和低表達(dá)miR-210卵巢癌細(xì)胞的增殖活性

TimeOVCAR3ControlMiR?210mimicControlAnti?miR?210inhibitorSKOV3ControlMiR?210mimicControlAnti?miR?210inhibitorDay10．25±0．090．26±0．08?0．41±0．110．40±0．11?0．30±0．090．31±0．08?0．30±0．100．29±0．10?Day30．57±0．110．66±0．11?0．81±0．090．71±0．09?0．87±0．100．96±0．11?0．52±0．090．48±0．09?Day50．90±0．131．75±0．13?1．52±0．101．21±0．10?1．26±0．121．65±0．11?1．20±0．110．91±0．10?Day71．67±0．142．77±0．13?2．21±0．101．73±0．11?1．97±0．112．77±0．11?1．91±0．111．33±0．11?

*P<0.05 compared with control group.

2.3電離輻射條件下過表達(dá)miR-210卵巢癌細(xì)胞的增殖活性MTT檢測(cè)結(jié)果顯示：電離輻射條件下miR-210過表達(dá)組卵巢癌細(xì)胞增殖活性明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。見表3和4。

表3電離輻射照射后過表達(dá)miR-210 OVCAR3細(xì)胞增殖活性

TimeLowdoseofradiation(30Gy)ControlMiR?210mimicMiddledoseofradiation(50Gy)ControlMiR?210mimicHighdoseofradiation(100Gy)ControlMiR?210mimicDay12．52±0．102．49±0．092．56±0．102．50±0．062．58±0．072．53±0．06Day31．85±0．111．99±0．10?1．45±0．101．60±0．09?1．31±0．101．56±0．06?Day51．09±0．101．53±0．11?0．88±0．091．22±0．09?0．65±0．111．08±0．09?Day70．53±0．111．20±0．10?0．32±0．110．88±0．09?0．11±0．110．59±0．10?

*P<0.05 compared with control group.

表4電離輻射照射后過表達(dá)miR-210 SKOV3細(xì)胞增殖活性

TimeLowdoseofradiation(30Gy)ControlMiR?210mimicMiddledoseofradiation(50Gy)ControlMiR?210mimicHighdoseofradiation(100Gy)ControlMiR?210mimicDay13．01±0．102．99±0．093．11±0．093．08±0．093．10±0．103．11±0．10Day32．45±0．102．58±0．11?2．25±0．102．43±0．09?1．99±0．102．17±0．09?Day51．63±0．072．09±0．11?1．45±0．111．88±0．06?1．11±0．111．57±0．09?Day70．84±0．111．58±0．10?0．80±0．121．38±0．12?0．29±0．110．82±0．11?

*P<0.05 compared with control group.

2.4電離輻射條件下過表達(dá)miR-210卵巢癌細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較，過表達(dá)miR-210的OVCAR3和SKOV3細(xì)胞給予50 Gy放射線照射后，2株細(xì)胞中BAX表達(dá)水平均明顯下降，而Bcl-2表達(dá)水平均明顯升高。見圖 1。

Lane 1: Control group; Lane 2: miR-210 group.

圖1電離輻射照射后過表達(dá)miR-210 OVCAR3(A)和SKOV3(B)細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)電泳圖

Fig.1 Electrophoregram of expressions of apoptosis-related proteins in OVCAR3 and SKOV3 cells overexpressing miR-210 after radiation

3　討　論

腫瘤的發(fā)生與細(xì)胞異常增殖、分化及凋亡密切關(guān)聯(lián)。研究[11]顯示：一些miRNA與腫瘤的發(fā)生、腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡均有著密切的聯(lián)系。深入探討miRNA在腫瘤發(fā)生過程中的調(diào)控作用及機(jī)制，對(duì)于人們不斷認(rèn)識(shí)和戰(zhàn)勝腫瘤具有重要的意義。miRNA與卵巢癌關(guān)系的研究也早已展開。miR-141、miR-200a、miR-200b和miR-200c等在卵巢癌中呈高表達(dá)，而miR-125b-1﹑miR-140和miR-145等呈低表達(dá)。這些不同表達(dá)的miRNA提示其在卵巢癌中起著不同的調(diào)控作用,同時(shí)也具有潛在治療靶點(diǎn)的意義[12]。隨后的研究[13-16]顯示：在早期卵巢腫瘤患者和健康人的血液中可檢測(cè)到一些差異表達(dá)的miRNA，并且這些miRNA表達(dá)水平與腫瘤的進(jìn)展呈一定的相關(guān)性。這些研究結(jié)果進(jìn)一步提示可通過檢測(cè)患者血液中的miRNA進(jìn)行卵巢癌的早期診斷，并可針對(duì)差異表達(dá)的miRNA制定相應(yīng)的治療方案。

miR-210是目前公認(rèn)的缺氧特異性miRNA，在缺氧環(huán)境的細(xì)胞中表達(dá)明顯升高。腫瘤生長(zhǎng)的特點(diǎn)是在缺氧和氧化應(yīng)激之間轉(zhuǎn)變。在乏氧持續(xù)刺激下miR-210的表達(dá)最突出。提示這可能是癌癥細(xì)胞在腫瘤發(fā)病中的一個(gè)原因。以往有研究[17]顯示：miR-210可以通過抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄而調(diào)節(jié)乳腺腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。最近的研究[18]顯示：在卵巢癌組織中miR-210表達(dá)水平明顯升高，提示miR-210可能與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系。

近年來，研究[19]顯示：miR-210除了參與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展外，還與卵巢癌的化療耐藥有關(guān)，miR-210可能通過HOXA9、FGFRL1、EFNA3、VEGF和E2F3等參與其耐藥的形成,但目前對(duì)于miR-210與卵巢癌放療相關(guān)性的研究相對(duì)較少。卵巢癌發(fā)病率較高，預(yù)后較差，死亡率高居?jì)D科惡性腫瘤首位，其中最重要一個(gè)原因?yàn)槁殉舶┗颊咴诜暖熤委熯^程中產(chǎn)生抵抗[20]。因此闡明卵巢癌輻射抵抗的確切機(jī)制已成為當(dāng)前醫(yī)學(xué)研究中極其緊迫而重要的研究課題。

基于上述理論和研究結(jié)果，本文作者應(yīng)用細(xì)胞轉(zhuǎn)染法制備miR-210過表達(dá)及低表達(dá)模型，采用Real-time PCR法進(jìn)行鑒定，通過MTT法檢測(cè)miR-210對(duì)卵巢癌生長(zhǎng)的影響，結(jié)果顯示：miR-210過表達(dá)有明顯的促進(jìn)卵巢癌生長(zhǎng)作用。為了驗(yàn)證其與放療的敏感性，本文作者設(shè)置低﹑中和高3個(gè)輻射劑量組，對(duì)過表達(dá)miR-210卵巢癌細(xì)胞進(jìn)行照射，結(jié)果顯示：過表達(dá)miR-210細(xì)胞組細(xì)胞對(duì)輻射存在一定的抵抗，這種輻射抵抗也許與miR-210表達(dá)異常有關(guān)；為了明確其分子機(jī)制，本文作者對(duì)其凋亡相關(guān)蛋白進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示：凋亡相關(guān)蛋白BAX表達(dá)下降，而Bcl-2表達(dá)升高，提示這種輻射抵抗是通過抑制凋亡實(shí)現(xiàn)的。

隨著對(duì)miR-210的進(jìn)一步深入研究，本文作者發(fā)現(xiàn)miR-210在卵巢癌治療中確有潛在的作用，有可能成為新的基因治療途徑。但miR-210是否直接或間接參與卵巢癌侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)尚需進(jìn)一步研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Kujawa KA, Lisowska KM. Ovarian cancer--from biology to clinic[J].Postepy Hig Med Dosw(Online), 2015, 69: 1275-1290.

[2] Dong X, Men X, Zhang W, et al. Advances in tumor markers of ovarian cancer for early diagnosis[J]. Indian J Cancer, 2014, 51(3): 72-76.

[3] De Felice F, Marchetti C, Di Mino A, et al. Recurrent Ovarian Cancer: The Role of Radiation Therapy[J]. Int J Gynecol Cancer, 2017, 27(4): 690-695.

[4] Liao Q, Zhang HM, Li HH,et al. A preliminary study on the radiation-resistance mechanism in ovarian cancer[J]. J Cancer Res Ther，2013，9(1): 22-24.

[5] Reddy KB. MicroRNA (miRNA) in cancer[J]. Cancer Cell Int, 2015，15:38.

[6] 霍紅日，楊智勇，朱玲莉. miRNA-193a在肺腺癌患者體內(nèi)的表達(dá)水平及意義[J]. 國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2017, 38(13)：1773-1775.

[7] Wu Q, Yang Z, Shi Y, et al. MiRNAs in human cancers: the diagnostic and therapeutic implications[J]. Curr Pharm Des, 2014, 20(33): 5336-5347.

[8] Li Y, Fang Y, Liu Y, et al. MicroRNAs in ovarian function and disorders[J].J Ovarian Res, 2015，8:51.

[9] Zhang S, Lu Z, Unruh AK, et al. Clinically relevant microRNAs in ovarian cancer[J].Mol Cancer Res， 2015，13(3): 393-401.

[10]Liu M, Zhang X, Hu CF, et al. MicroRNA-mRNA functional pairs for cisplatin resistance in ovarian cancer cells[J]. Chin J Cancer， 2014, 33(6): 285-294.

[11]Su Z, Yang Z, Xu Y, et al. MicroRNAs in apoptosis, autophagy and necroptosis[J]. Oncotarget, 2015, 6(11): 8474-8490.

[12]Wang ZH, Xu CJ. Research Progress of MicroRNA in Early Detection of Ovarian Cancer[J]. Chin Med J (Engl), 2015, 128(24): 3363-3370.

[13]Gao YC, Wu J.MicroRNA-200c and microRNA-141 as potential diagnostic and prognostic biomarkers for ovarian cancer[J]. Tumour Biol，2015，36(6): 4843-4850.

[14]Shapira I, Oswald M, Lovecchio J, et al. Circulating biomarkers for detection of ovarian cancer and predicting cancer outcomes[J]. Br J Cancer, 2014, 110(4): 976-983.

[15]Mahdian-Shakib A, Dorostkar R, Tat M, et al. Differential role of microRNAs in prognosis, diagnosis, and therapy of ovarian cancer[J]. Biomed Pharmacother, 2016, 84: 592-600.

[16]Pal MK, Jaiswar SP, Dwivedi VN, et al. MicroRNA: a new and promising potential biomarker for diagnosis and prognosis of ovarian cancer[J]. Cancer Biol Med, 2015, 12(4): 328-341.

[17]Liu D, Xia H, Wang F, et al. MicroRNA-210 interacts with FBXO31 to regulate cancer proliferation cell cycle and migration in human breast cancer[J]. Onco Targets Ther, 2016, 9: 5245-5255.

[18]Li L, Huang K, You Y,et al. Hypoxia-induced miR-210 in epithelial ovarian cancer enhances cancer cell viability via promoting proliferation and inhibiting apoptosis[J]. Int J Oncol, 2014, 44(6) :2111-2120.

[19]張萍，王敏，接智慧，等. miR-210在化療耐藥與化療敏感卵巢漿液性癌組織中的檢測(cè)及意義[J]. 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2014, 43(6): 487-492.

[20]Rai B, Bansal A, Patel FD, et al. Radiotherapy for ovarian cancers - redefining the role[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2014, 15(12): 4759-4763.

[21]劉書中，李子全，李政垚，等.外周血miR-21檢測(cè)在胰腺癌中的意義研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2016，20(6):1038-1042.

[22]付霞霏，何援利，王雪峰，等.化療性卵巢功能早衰動(dòng)物模型及患者血清miR-21水平的變化[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2016，41(11):915-918.