陳 林, 楊亞飛, 楊 進(jìn), 何平林, 王 凱, 王云漢, 汪自力

(1. 成都大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科, 成都610081; 2. 遵義醫(yī)學(xué)院, 遵義 563000)

膀胱出口部分梗阻(partial bladder outlet obstruction,pBOO)是一種常見的慢性泌尿系統(tǒng)疾病，其特征表現(xiàn)是膀胱病理性肥大，膠原沉積和尿潴留[1]。pBOO可由多種病因引起, 包括良性前列腺增生, 尿道狹窄和前列腺術(shù)后的膀胱頸攣縮等[2,3]。受累人群非常廣泛。以前列腺增生為例，流行病學(xué)研究表明, 70歲及以上的男性患病率最高[4], 26.2%的男性患者一生中會(huì)罹患不同程度的前列腺增生[5]，隨著我國人口老齡化加劇，該疾病的家庭負(fù)擔(dān)和社會(huì)負(fù)擔(dān)將極為嚴(yán)重。如果沒有良好的藥物或技術(shù)控制疾病，患者排尿功能障礙加重必然導(dǎo)致腎臟功能損害甚至尿毒癥等一系列嚴(yán)重后果[6,7]。因此, 越來越多的研究者將目光轉(zhuǎn)至膀胱梗阻性疾病的基礎(chǔ)研究中，這對(duì)梗阻性膀胱疾病的發(fā)病機(jī)制研究具有重要現(xiàn)實(shí)意義。為了觀察機(jī)體的整體狀態(tài)，從現(xiàn)象到本質(zhì)完整觀察疾病的病理生理狀態(tài)，合理使用動(dòng)物構(gòu)建疾病模型的方法仍然是不可替代的[8]。該領(lǐng)域近年來新報(bào)道較多，國內(nèi)相關(guān)綜述少且較陳舊[9],本文就pBOO動(dòng)物模型的造模方法選擇等研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 膀胱頸結(jié)扎

自1982年以來，開放手術(shù)膀胱頸結(jié)扎法一直是構(gòu)建pBOO動(dòng)物模型使用最廣泛也較為成熟的方法[10]。開放手術(shù)誘導(dǎo)的pBOO模型能夠包含臨床上所觀察到的大多數(shù)臨床特征。目前臨床上診斷pBOO的金標(biāo)準(zhǔn)為尿流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)[11]，其中壓力-流率測(cè)定(pressure-flow study，PFS)常呈現(xiàn)“高壓低流”的特點(diǎn)。有學(xué)者[2,12]應(yīng)用膀胱頸結(jié)扎法在大鼠中成功構(gòu)建pBOO動(dòng)物模型，行膀胱充盈測(cè)壓檢測(cè)可見其膀胱壓力曲線圖示，具體方法如下: 動(dòng)物稱重后，腹腔注射或氣體吸入麻醉, 仰臥位平放小鼠。碘伏消毒會(huì)陰處，將直徑為1 mm的硬膜外導(dǎo)管經(jīng)尿道外口插入膀胱，以此作為尿道支撐，并發(fā)揮校準(zhǔn)棒的功能。下腹部行縱行切口后逐層切開皮膚及皮下組織, 鈍性分離出膀胱頸周圍組織，仔細(xì)游離膀胱-尿道交界處，游離近端尿道，避免因誤扎兩側(cè)輸尿管引起上尿路梗阻或腎積水。近端尿道穿過3-0絲線, 結(jié)扎近端尿道, 拔除尿道內(nèi)導(dǎo)管逐層縫合關(guān)閉腹部。目前對(duì)結(jié)扎膀胱頸造成pBOO模型所需校準(zhǔn)棒的直徑大小尚無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。雄鼠由于尿道外口暴露不明顯而且尿道彎曲，其校準(zhǔn)棒直徑多在2 mm以內(nèi)，雌鼠因其尿道外口暴露明顯且尿道直，校準(zhǔn)物的金屬棒外徑多為1 mm，雌鼠具有解剖簡(jiǎn)單，方便導(dǎo)尿的特點(diǎn)，因此國內(nèi)外文獻(xiàn)中動(dòng)物模型造模以雌性為主。校準(zhǔn)棒的放置位置目前也無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，可通過導(dǎo)尿的方式經(jīng)尿道插入導(dǎo)尿管，以導(dǎo)尿管作為校準(zhǔn)棒，結(jié)扎縫合造成梗阻。也有將校準(zhǔn)棒直接與雌鼠尿道緊貼，縫合尿道后抽出校準(zhǔn)棒的方式建立模型，此種方式梗阻程度與校準(zhǔn)棒直徑呈正相關(guān)關(guān)系。該方法具有簡(jiǎn)便、可操作性強(qiáng)以及造模時(shí)間短的特點(diǎn)，是一種快速、簡(jiǎn)便的pBOO造模方法。

但是隨著pBOO研究的廣泛開展，學(xué)者們對(duì)膀胱頸結(jié)扎構(gòu)建pBOO動(dòng)物模型的穩(wěn)定性和可重復(fù)性提出質(zhì)疑，除傳統(tǒng)的經(jīng)膀胱頸構(gòu)建pBOO動(dòng)物模型高達(dá)15%的死亡率飽受詬病外[13]，開放手術(shù)相關(guān)的并發(fā)癥可能損害膀胱血供并導(dǎo)致膀胱神經(jīng)支配異常，也使這一傳統(tǒng)模型備受質(zhì)疑。Sidler等[14]研究表明，膀胱頸周圍的侵入性解剖操作破壞了膀胱的部分神經(jīng)支配，并通過去神經(jīng)支配破壞了膀胱頸與膀胱體之間的神經(jīng)交互聯(lián)系。即使是在除去結(jié)扎近端尿道，其余步驟同膀胱頸結(jié)扎法的假手術(shù)組中，也出現(xiàn)膀胱重量增加和膀胱功能障礙，這可能與去神經(jīng)損傷有關(guān)，因此不能作為非神經(jīng)源性pBOO的對(duì)照組動(dòng)物模型。

最新的一些研究[6,15]已證實(shí)膀胱缺血和氧化應(yīng)激介導(dǎo)pBOO中的膀胱壁重塑，此前機(jī)械刺激被認(rèn)為是引起這一效應(yīng)的主要原因[16]。研究人員就pBOO的發(fā)病機(jī)制得出了截然不同的結(jié)論，表明傳統(tǒng)開放手術(shù)動(dòng)物模型不夠穩(wěn)定，并且這些變化可能不容易被檢測(cè)到。傳統(tǒng)開放手術(shù)動(dòng)物模型可能與臨床上的pBOO患者具有不同的發(fā)病機(jī)制和病理生理過程?；谝陨显?，有學(xué)者[14]在傳統(tǒng)膀胱頸結(jié)扎法的基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)明了保留神經(jīng)的尿道中段梗阻術(shù)，具體做法是在雌性小鼠插入24G血管導(dǎo)管作為導(dǎo)尿管，恥骨聯(lián)合向尿道口施行約6 mm縱行皮膚切口，顯微剪鈍性分離帶有尿道管支架的尿道，仔細(xì)解剖出尿道周圍的神經(jīng)血管束避免損傷，分離出在尿道與陰道之間的縱行平面，穿過5-0不可吸收絲線，外科結(jié)縫合結(jié)扎尿道，拔除尿道內(nèi)導(dǎo)管造成梗阻，逐層縫合。結(jié)果顯示與傳統(tǒng)結(jié)扎膀胱頸法相比，保留神經(jīng)的尿道中段梗阻術(shù)能更為準(zhǔn)確控制梗阻程度，出現(xiàn)殘余尿增加和膀胱纖維化的改變，但梗阻的膀胱不會(huì)顯著擴(kuò)大，更加貼合臨床的膀胱梗阻性疾病的病理生理過程，也可避免腹部切口愈合過程中炎癥以及膀胱與腹壁的粘連發(fā)生(這兩方面會(huì)進(jìn)一步引起膀胱功能障礙)。但即便如此，膀胱頸結(jié)扎依然是目前應(yīng)用最廣泛，也最被學(xué)術(shù)界認(rèn)可的構(gòu)建pBOO動(dòng)物模型的方式。

2 經(jīng)會(huì)陰途徑結(jié)扎

為了避免經(jīng)腹pBOO模型的這些缺點(diǎn)，Zhang等[17]報(bào)告了結(jié)扎會(huì)陰造成近端尿道梗阻模型: 麻醉大鼠后，暴露尿道并用直徑1 mm的硬膜外導(dǎo)管通過尿道口插入膀胱。小心分離出尿道和陰道，并用4-0帶線縫合針穿過會(huì)陰尿道周圍。該手術(shù)不需要低位腹部切口，可避免損傷膀胱及其神經(jīng)支配和尿道周圍血管[18]。但該方法在縫合會(huì)陰尿道時(shí)只能盲目進(jìn)針縫合，縫合深度無法定量操作，對(duì)術(shù)者技術(shù)要求較高。在此基礎(chǔ)上，本課題組進(jìn)一步創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)思路，將大鼠尿道外口梗阻1/3面積，能得到與膀胱頸結(jié)扎類似的病理生理改變，最接近傳統(tǒng)膀胱頸結(jié)扎法誘導(dǎo)pBOO病理生理過程中的最佳梗阻程度[19]。該動(dòng)物模型能得到與經(jīng)腹腔途徑在組織學(xué)改變和膀胱充盈測(cè)壓數(shù)據(jù)方面相近的結(jié)果。

另有學(xué)者[20]根據(jù)雄性大鼠的尿道解剖特點(diǎn)，從陰莖與陰囊連接部分離出陰莖海綿體，鈍性分離出尿道球部后，適度結(jié)扎形成尿路梗阻。經(jīng)會(huì)陰途徑的pBOO動(dòng)物模型構(gòu)建能減少炎癥反應(yīng)，具有更簡(jiǎn)單的解剖結(jié)構(gòu)，手術(shù)方式簡(jiǎn)單，更加接近臨床上的pBOO病理生理過程。但作為一種方法論研究，該方法也存在一些局限性。Kim等[21]報(bào)道經(jīng)會(huì)陰模型中pBOO致膀胱過度活動(dòng)的尿動(dòng)力學(xué)參數(shù)改變不如經(jīng)腹模型明顯，因此經(jīng)會(huì)陰方法在模擬膀胱過度活動(dòng)癥時(shí)可能效果不佳。此外，可能損傷雄性鼠的勃起功能，因?yàn)榻?jīng)會(huì)陰進(jìn)入膀胱不可避免造成海綿體損傷。

3 建立人工束縛環(huán)

pBOO定義是指膀胱頸或尿道由于多種病因引起尿液流出道阻力升高導(dǎo)致的尿液排出困難，出現(xiàn)尿潴留甚至損傷腎功能的疾病類型。據(jù)此定義，有學(xué)者[22]嘗試在膀胱頸至尿道這一段解剖位置處將硅膠或金屬環(huán)、氣囊等不易吸收或變形的材料通過手術(shù)方法置入大鼠體內(nèi)，人為建立束縛環(huán)，模擬膀胱頸流出梗阻或尿道狹窄的病理過程。同時(shí)利用異物產(chǎn)生的無菌性炎癥反應(yīng)，纖維瘢痕增生模型慢性梗阻的生理過程。此種動(dòng)物模型的選擇以雌性大鼠為主, 可避免膀胱過度充盈, 尿液反流進(jìn)入精囊腺及附屬腺體，引起膿毒血癥或者膀胱內(nèi)壓力減少。

此種造模方法是在現(xiàn)代材料學(xué)的迅速發(fā)展下建立的，能夠模擬pBOO患者的尿流動(dòng)力學(xué)表現(xiàn)，但由于其存在異物排斥反應(yīng)和組織相容性差的缺點(diǎn)，目前不能廣泛用于pBOO動(dòng)物模型構(gòu)建。另外，目前也無標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)徑大小對(duì)照研究，其梗阻表現(xiàn)缺乏均一性，不能形成一致的梗阻程度。人工束縛環(huán)的建立過程與開放手術(shù)造模相比，仍存在較大手術(shù)創(chuàng)傷，手術(shù)的相關(guān)并發(fā)癥可能影響動(dòng)物模型構(gòu)建的準(zhǔn)確性。因此還需進(jìn)一步尋找新型材料，使其模型更加標(biāo)準(zhǔn)化，也更加接近臨床病理生理過程。

4 建立前列腺增生

近年研究[23]表明，較高水平的循環(huán)17β-雌二醇(E2)能增加老年男性發(fā)生下尿路癥狀風(fēng)險(xiǎn)，而男性中較低水平的循環(huán)睪酮(T)則會(huì)增加pBOO的嚴(yán)重程度。隨著年齡的增加, 老年男性睪酮水平下降, 而E2的血清水平保持在相對(duì)恒定的水平，但游離T與E2比率的凈效應(yīng)是下降的, 雄激素和雌激素之間的比例不平衡可能會(huì)導(dǎo)致男性患者出現(xiàn)pBOO[24]。過度表達(dá)雌激素生物合成的限速酶——芳香化酶的雄性小鼠易發(fā)生pBOO，且伴隨著膀胱尿路上皮和逼尿肌中的形態(tài)學(xué)變化以及過度增殖反應(yīng)[25]。T聯(lián)合使用E2可以模擬老年男性的激素環(huán)境，提高E2/T的比值，用于雄性小鼠可誘導(dǎo)出現(xiàn)前列腺相關(guān)的BOO癥狀[26,27]。

利用激素水平的變化構(gòu)建新型pBOO動(dòng)物模型的可行性在Nevile等[31]研究中得到了佐證。金屬硫蛋白(MTs)是一種富含半胱氨酸的蛋白質(zhì)，對(duì)金屬有很強(qiáng)的親和力，它參與了前列腺的細(xì)胞增殖、凋亡和腫瘤轉(zhuǎn)化。研究人員[28]成功構(gòu)建了前列腺特異性表達(dá)金屬硫蛋白-1(MT1)的轉(zhuǎn)基因鼠，但轉(zhuǎn)基因鼠并未自發(fā)產(chǎn)生前列腺癌和前列腺上皮內(nèi)瘤變等癌前病變，在所有E2治療小鼠中觀察到前列腺增生，68%的E2聯(lián)合T治療的小鼠中不伴有前列腺增生，但都發(fā)生了膀胱明顯充盈伴尿潴留，癥狀類似于pBOO。因此，這種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，其對(duì)E2誘導(dǎo)的pBOO的易感性增加，可作為構(gòu)建pBOO動(dòng)物模型的一種選擇方式。

5 尿道外口注射透明質(zhì)酸

在兔尿道周圍注射自體脂肪構(gòu)建pBOO動(dòng)物模型[29]，其原理是人為縮窄尿道外口面積，造成尿道狹窄，增加尿道阻力。理論上該方法可模擬尿頻、膀胱重量增加等病理生理改變，但是存在感染的風(fēng)險(xiǎn)，以及后期自體脂肪組織吸收，梗阻癥狀自行好轉(zhuǎn)的局限性。

近年來，隨著新興材料的不斷出現(xiàn)，有學(xué)者將目光轉(zhuǎn)移到利用膨脹劑構(gòu)建pBOO動(dòng)物模型。其中以透明質(zhì)酸為代表，尿道外口均分為12點(diǎn)，在其皮下5、7和11點(diǎn)鐘方向分別注射0.2 mL透明質(zhì)酸鈉，制作pBOO動(dòng)物模型[30,31]。通過與傳統(tǒng)膀胱頸結(jié)扎法比較，建模后4周采用尿流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)模型建立后的穩(wěn)定性，蘇木精-伊紅(HE)染色結(jié)果顯示可以復(fù)制傳統(tǒng)模型中的最大排尿壓力、殘余尿量、最大膀胱容量增加等典型pBOO尿流動(dòng)力學(xué)表現(xiàn)，以及組織病理學(xué)中膀胱平滑肌肥大、膠原沉積和間質(zhì)充血水腫典型的膀胱組織結(jié)構(gòu)變化?？杀苊忾_放手術(shù)帶來的感染，結(jié)扎程度不均一等并發(fā)癥，操作更為簡(jiǎn)單，但由于透明質(zhì)酸價(jià)格高昂，制作成本高，不適合用于大批次動(dòng)物造模，因此，透明質(zhì)酸尿道外口注射法可以作為一種候選的pBOO動(dòng)物模型。

6 總結(jié)與展望

本文對(duì)pBOO動(dòng)物模型的制作方法，包括傳統(tǒng)制作方法、改良模型和新開發(fā)動(dòng)物模型的優(yōu)劣勢(shì)進(jìn)行了綜述，目前尚無能完全模擬臨床慢性下尿路梗阻的動(dòng)物模型。其發(fā)病機(jī)制受到性別、年齡、性激素及飲食習(xí)慣等多種因素的影響，選擇一種重復(fù)性好，能夠再現(xiàn)大部分臨床患者情況的動(dòng)物模型對(duì)尋找新藥靶點(diǎn)，延緩膀胱梗阻性疾病進(jìn)展具有重要的科學(xué)和臨床意義。

隨著研究的進(jìn)一步深入，僅僅出現(xiàn)下尿路梗阻表現(xiàn)已不能滿足科學(xué)研究的需要，構(gòu)建能與臨床患者病理生理過程一致的動(dòng)物模型，是目前泌尿外科醫(yī)師和其他研究者需要關(guān)心和解決的問題。同時(shí)，如何將在動(dòng)物模型上出現(xiàn)的相關(guān)信號(hào)通路和分子靶點(diǎn)轉(zhuǎn)化到臨床患者上，也是一個(gè)需要攻克的難題。值得注意的是，無論使用什么類型的模型，將動(dòng)物研究的結(jié)果推廣至臨床應(yīng)用時(shí)應(yīng)格外謹(jǐn)慎。因此，仍需要在現(xiàn)有研究基礎(chǔ)上，對(duì)pBOO動(dòng)物模型開展進(jìn)一步的探索和思考，以期能構(gòu)建更為符合臨床實(shí)際的動(dòng)物模型，為尋找治療膀胱梗阻性疾病的合理有效的分子藥物靶點(diǎn)打下基礎(chǔ)。