胡 櫻, 楊 斐, 陳鴻婷

(復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 上海200032)

貓是具有獨特應(yīng)用價值的實驗用動物，19世紀(jì)末以來，貓被陸續(xù)應(yīng)用于生理學(xué)、藥理學(xué)、毒理學(xué)、病毒學(xué)、遺傳學(xué)、心理學(xué)、營養(yǎng)學(xué)、腫瘤學(xué)等多個研究領(lǐng)域，其應(yīng)用范圍日趨廣泛，甚至成為某些領(lǐng)域中無可替代的實驗用動物[1]，如，在腦和高級神經(jīng)生理研究領(lǐng)域，貓是目前公認最理想的動物，在中國藥典中規(guī)定降壓物質(zhì)檢查須使用貓[2], 在人艾滋病及其疫苗研究中使用貓?zhí)娲侨遂`長類等[3]。由于貓的實驗動物化程度仍較低，我國絕大多數(shù)實驗用貓只能來源于市場收購、自行捕捉等渠道[4]，除了動物背景不清、來源不穩(wěn)定之外，實驗者還面對生物學(xué)特性基礎(chǔ)數(shù)據(jù)缺失、動物質(zhì)量不可靠、生物安全隱患、動物福利損害等[5,6]問題，同時貓還是人們熟知的寵物之一，缺乏標(biāo)準(zhǔn)化實驗動物身份的現(xiàn)實也使應(yīng)用貓進行動物實驗比用犬背負更大的輿論壓力[7]。鑒于上述原因，貓的實驗動物化研究迫在眉睫。然而貓?zhí)煨元毩?，是少?shù)通過自我馴化進入人類生活的動物之一，較難進行群體人工飼養(yǎng)繁殖，這是貓的實驗動物化工作的一大障礙，為了提高培育成功率，作者從具有悠久人工馴化歷史和良好人工培育歷程的品種貓中選擇英國短毛貓進行實驗動物化研究。英國短毛貓是一個古老的品種，具有2000多年的馴化史，該品種體格健壯，性情溫順，適應(yīng)性強，分布廣泛，具備培育為實驗用貓的良好潛質(zhì)。本實驗所用英國短毛實驗貓系從美國引進原種，在實驗室內(nèi)封閉繁殖二代所獲，本文在測定該種群F2代血液生理生化指標(biāo)基礎(chǔ)上分析相應(yīng)生物學(xué)特性的增齡性變化和性別差異，探討對于確定英國短毛實驗貓血液生理生化基礎(chǔ)數(shù)據(jù)的意義，為英國短毛貓的實驗動物化研究和應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雌性和雄性英國短毛實驗貓各6只，從分娩存活數(shù)和哺乳數(shù)均為3～4只的成窩離乳幼貓中隨機選擇，每窩最多選1只雄性和1只雌性。

1.2 飼養(yǎng)環(huán)境和日常管理

貓舍采用自然通風(fēng)和照明，室溫控制范圍18～26 ℃，相對濕度40%～70%，所有貓采用籠養(yǎng)+定時出籠運動的飼養(yǎng)方式，妊娠貓單籠飼養(yǎng)，哺乳母貓及其幼貓按窩飼養(yǎng)，離乳未成年貓按性別分籠飼養(yǎng)，每日上下午各安排2 h運動時間，讓貓出籠在貓舍內(nèi)自由活動。

1.3 飼料和飼喂

按不同生長階段飼喂相應(yīng)品種的全價貓糧(法國皇家), 每日上午(8∶30)和下午(17∶30)定時飼喂, 成年公貓和未妊娠母貓飼喂i27貓糧，4～12月齡幼貓飼喂k36貓糧，0～4月齡幼貓和哺乳母貓飼喂BK34貓糧，妊娠母貓孕6周內(nèi)飼喂i27貓糧，孕7周至分娩飼喂BK34貓糧，成年公貓和未妊娠母貓參照飼喂說明按體質(zhì)量定量飼喂，其他階段的貓不限定飼喂量，不同階段貓糧轉(zhuǎn)換期為1周，飲用水24 h持續(xù)供應(yīng)，采用煮沸消毒冷卻的自來水。

1.4 血液標(biāo)本采集和測定

入選幼貓生長至5月齡和11月齡時, 分別經(jīng)股靜脈采集全血1 mL, 其中0.5 mL全血經(jīng)EDTA-K2抗凝后于4 h內(nèi)使用IDEXX ProCyte Dx全自動血細胞分析儀(購自美國家愛德仕公司)測定21項血液學(xué)指標(biāo): 紅細胞數(shù)(RBC)、血紅蛋白 (HGB)、紅細胞比容(HCT)、平均紅細胞體積(MCV)、紅細胞平均血紅蛋白含量(MCH)、紅細胞平均血紅蛋白濃度(MCHC)、紅細胞分布寬度標(biāo)準(zhǔn)差(RDW-SD)、紅細胞分布寬度變異系數(shù) (RDW-CV)、網(wǎng)織紅細胞數(shù)(RET)、網(wǎng)織紅細胞百分比(RET)、白細胞數(shù)(WBC)、中性粒細胞數(shù)(NEUT)、淋巴細胞數(shù)(LYMPH)、單核細胞數(shù)(MONO)、嗜酸性粒細胞數(shù)(EO)、嗜堿性粒細胞數(shù)(BASO)、中性粒細胞百分比(NEUT)、淋巴細胞百分比(LYMPH)、單核細胞百分比(MONO)、嗜酸性粒細胞百分比(EO)和嗜堿性粒細胞百分比(BASO); 0.5 mL全血經(jīng)肝素抗凝后于4 h內(nèi)使用IDEXX Catalyst Dx生化分析儀(購自美國家愛德仕公司)測定14項血液生化指標(biāo): 白蛋白(ALB)、堿性磷酸酶(ALKP)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、尿素(UREA)、鈣(CA)、膽固醇(CHOL)、肌酐(CREA)、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)、球蛋白(CLOB)、葡萄糖(GLU)、磷(PHOS)、總膽紅素(TBIL)和總蛋白(TP)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

測定結(jié)果以x- ±s表示, 使用STATA 統(tǒng)計軟件進行分析，同性別不同月齡的兩樣本均數(shù)采用配對比較，同月齡不同性別的兩樣本均數(shù)采用非配對比較，行t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血液學(xué)指標(biāo)

與5月齡比較，11月齡雌性貓HGB和HCT較高(P＜0.05), 11月齡雄性HCT和MCV較高(P＜0.05),RBC、HGB和MCH顯著升高(P＜0.01)。相同月齡的雌雄貓間比較，5月齡雄性WBC和LYMPH計數(shù)均高于5月齡雌性(P＜0.05、P＜0.01); 11月齡雄性的RBC、HGB和LYMPH%均高于11月齡雌性(P＜0.05)(表 1)。

2.2 血液生化指標(biāo)

與5月齡時比較, 11月齡雌貓ALKP和PHOS較低(P＜0.01,P＜0.05)，CHOL和CREA較高(P＜0.01,P＜0.05)，11月齡的雄貓ALKP和PHOS較低，CREA較高(均P＜0.01)。5月齡雌貓的CHOL低于5月齡雄貓(P＜0.05)，11月齡雌貓的ALB和CREA均低于雄貓(P＜0.05), 11月齡雌貓的ALT高于雄貓(P＜0.01)(表 2)。

3 討論

3.1 英國短毛實驗貓血液生理指標(biāo)的年齡差異和性別差異

比較5月齡和11月齡實驗貓血液生理的各項指標(biāo)，紅細胞相關(guān)的10項指標(biāo)中，11月齡的雄性英國短毛實驗貓有5項指標(biāo)即RBC、HGB、HCT、MCV、MCH都高于其5月齡時的水平，平均增幅約23%，11月齡的雌性英國短毛實驗貓有2項指標(biāo)即HGB和HCT也高于其5月齡時的水平，并且平均增幅和雄性相似，白細胞相關(guān)指標(biāo)未見和月齡有關(guān)的差異，表明該種群英國短毛實驗貓在1歲以內(nèi)的紅細胞相關(guān)特性存在增齡性變化的特點。由于紅

細胞計數(shù)及血紅蛋白含量相關(guān)的指標(biāo)和機體的營養(yǎng)狀況之間有著密切關(guān)系[8]，而本文中5月齡的貓和11月齡的貓在飼料品種及飼喂方式上是相同的，故推測上述變化與1歲以內(nèi)的英國短毛實驗貓隨著年齡的增長對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用效率逐漸提高有關(guān)。通常貓的消化系統(tǒng)至1歲時功能才能達到較穩(wěn)定的狀態(tài)，這一生長規(guī)律為本文觀察到的幼貓紅細胞相關(guān)指標(biāo)的增齡性升高提供了理論基礎(chǔ)。

表 1 英國短毛實驗貓的血液學(xué)指標(biāo)Table 1 The hematological indexes of laboratory British-shorthair cats

表 2 英國短毛實驗貓的血液生化指標(biāo)Table 2 The blood biochemical indexes of laboratory British-shorthair cats

通過比較不同性別實驗貓在相同月齡的血液生理指標(biāo)，表明5月齡雄性實驗貓的WBC和LYMPH均高于雌性，11月齡雄性實驗貓的RBC、HGB和LYMPH% 也均高于雌性，該結(jié)果提示了1歲以內(nèi)英國短毛實驗貓的血液生理部分特性存在性別差異。根據(jù)本文觀察到的實驗貓日?；顒犹攸c和規(guī)律，雌雄實驗貓在離乳后逐漸顯示出活動性的性別差異，雄性總體上更加活潑。更樂于嘗試各種玩具和游戲，相對而言雌性比較安靜，鑒于運動可引起白細胞的生理性增高[9]，且適量運動促進新陳代謝提高機體對營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化利用率，推測上述指標(biāo)出現(xiàn)性別差異的原因很可能與雄性較雌性運動量更大有關(guān)。

3.2 英國短毛實驗貓血液生化指標(biāo)的年齡差異和性別差異

比較5月齡和11月齡實驗貓血液生化的各項指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，ALKP、CREA、PHOS這3項指標(biāo)在雌雄實驗貓都出現(xiàn)非常明顯的增齡性變化，其中，ALKP和PHOS隨年齡增加而大幅減少， 11月齡雌性的ALKP水平約為5月齡時的49%，11月齡雄性的ALKP水平約為5月齡時的47%，11月齡時PHOS的水平在雌性和雄性則分別相當(dāng)于5月齡時的85%和72%，雌、雄實驗貓的CREA水平隨月齡的增加而上升，增幅分別達到35%和44%，雌性實驗貓的CHOL 也隨年齡增長而升高，增幅達到45%。ALKP、CREA、PHOS在血中的含量均受到年齡因素的影響，其中，ALKP和PHOS與年齡呈負相關(guān)，CREA與年齡正相關(guān)[10]，本文觀察到的現(xiàn)象與此規(guī)律一致?？偰懝檀嫉乃娇呻S年齡波動，但在本文中僅觀察到雌性實驗貓在5月齡和11月齡時的差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

比較相同月齡的雌、雄實驗貓血液生化指標(biāo)，5月齡時雌性和雄性的CHOL有性別差異，而11月齡時，性別差異出現(xiàn)于另外3項指標(biāo)ALB、ALT和CREA。由于CREA和肌肉含量之間存在正相關(guān)，據(jù)此推測本文中雄性CREA高于雌性與同齡雄性實驗貓體重普遍大于雌性有關(guān)。

3.3 建立英國短毛實驗貓血液生理生化參考值意義

目前絕大多數(shù)科學(xué)實驗所使用貓的來源是從市場收購的家貓、捕獲或者救助的無主家貓及其隨意交配產(chǎn)生的后代[11], 由此獲得的基礎(chǔ)生物學(xué)數(shù)據(jù)因沒有清晰的遺傳背景和個體狀態(tài)如年齡、免疫狀況等作為支撐, 即便使用相同的采樣測定方法, 也無從進行橫向、縱向的比較，參考價值很低, 極大限制了研究結(jié)果的比較和應(yīng)用。實驗動物的血液生理生化參考值是其重要的基礎(chǔ)生物學(xué)數(shù)據(jù)，也是實驗動物標(biāo)準(zhǔn)化的重要標(biāo)志，從動物本身而言，影響該數(shù)據(jù)的因素包括動物種屬、種群、性別、年齡、生理狀態(tài)、生命階段、營養(yǎng)狀況、健康水平等，有價值的參考數(shù)據(jù)應(yīng)當(dāng)能夠充分反映這些因素的作用或者排除其干擾[12,13]。本文根據(jù)上述思路, 選用純種英國短毛貓作為原種, 通過實驗室封閉繁殖建立英國短毛實驗貓種群, 在限定上述各影響因素的基礎(chǔ)上進行血液生理生化指標(biāo)的測定和比較，首次明確了在5月齡至11月齡期間, 實驗貓的5項血液生理指標(biāo)RBC、HGB、HCT、MCV、MCH和4項血液生化指標(biāo)ALKP、CREA、PHOS、CHOL具有增齡性變化, 5項血液生理指標(biāo)RBC、HGB、WBC、LYMPH、LYMPH% 和4項血液生化指標(biāo)ALB、ALT、CHOL、CREA存在性別差異。據(jù)此, 作者認為, 英國短毛實驗貓的血液生理生化參考值應(yīng)當(dāng)按實驗貓不同生長階段和性別分別確定，以便更精確反映不同性別在每個生長階段的指標(biāo)波動范圍。