許 琴, 董 翔, 李建瑛, 張東輝, 李佳佳, 楊亞萍,楊秋月, 是文輝, 馬娜 , 宋來陽, 劉江偉

(1. 新疆軍區(qū)總醫(yī)院新疆特殊環(huán)境醫(yī)學重點實驗室, 烏魯木齊 830000;2. 新疆農業(yè)大學食品科學與藥學學院, 烏魯木齊 830052)

中暑是指在高溫作業(yè)環(huán)境，由于熱平衡或水鹽代謝紊亂而引起的以中樞神經(jīng)和心血管障礙為主要表現(xiàn)的急性疾病，常表現(xiàn)為驚厥、昏迷以及高體溫[1]。沙漠干熱具有一系列特征，如紫外線強度高，降雨量和水量少，極端干燥和炎熱, 使得在沙漠干熱環(huán)境下工作的人中暑風險更高[2]。相關研究[3]表明，重癥中暑是由過高熱引起的類膿毒癥樣急癥，其病死率近幾年在持續(xù)增高。

正常人體腸道內寄居著數(shù)量龐大、種類繁多的微生物, 以細菌為主, 統(tǒng)稱為腸道菌群, 其細胞總數(shù)高達1014、種類大于1 000種, 是人體細胞總和的10倍[4]。腸道內正常菌群對外襲菌的定植抵抗力及菌群的聚集構成了腸道的生物屏障[5]，可防止腸道內細菌和內毒素侵入血液循環(huán)。近期研究[6]表明,細菌內毒素在中暑發(fā)生中起著不可忽視的作用。

姜黃素是從姜科植物姜黃中提取的一種物質，也是姜黃發(fā)揮藥理作用最重要的活性成分[7]。近年來, 姜黃素的生物學活性受到廣泛關注, 其抗腫瘤、抗炎癥及器官保護等作用均被發(fā)現(xiàn)，目前美國國立腫瘤所已把姜黃素列為第三代抗癌化學藥物[8]。

我們推測姜黃素可能在沙漠干熱中暑的防治方面具有一定作用，本實驗從回腸、結腸內各菌群表達量的變化來觀察姜黃素對沙漠干熱環(huán)境中暑大鼠的預防作用，探討其在沙漠干熱環(huán)境中暑防治中的應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雄性 SD 大鼠，220～250 g, 購自新疆維吾爾自治區(qū)實驗動物研究中心[SCXK (新)2012-001]。5只一籠于SPF飼養(yǎng)間IVC籠盒內預飼一周，飼養(yǎng)室溫度為 25±0.5 ℃，明暗各12 h循環(huán)，大鼠自由采食，供給滅菌酸化水[SYXK(新)2012-003]。

1.1.2 試劑 姜黃素購自日本 TCI公司(C0434), 羧甲基纖維素鈉購自國藥集團化學試劑有限公司，戊巴比妥鈉購自德國默克公司， GoodViewTM核酸染料、DNA Marker購自大連寶生物工程公司，DNA試劑盒購自Omega Bio-tek公司，PCR引物由北京華大基因生物技術有限公司合成。

1.1.3 主要儀器設備 西北特殊環(huán)境人工實驗艙為專利產(chǎn)品[9-14]; 多功能生理信號儀420購自成都儀器廠; 臺式低溫高速離心機購自美國Thermo 公司; 微型低速離心機購自杭州奧盛儀器有限公司; IVC飼養(yǎng)籠盒購自意大利TechPlus公司; 溫度梯度PCR儀、核酸電泳儀購自美國Bio-Rad公司; 全能型凝膠成像系統(tǒng)購自美國UVP公司; 超微量微孔板分光光度計購自美國Bio-Tex公司。

1.2 方法

1.2.1 姜黃素配制和動物分組 53 kHz, 65 ℃超聲配制質量分數(shù)0.5%羧甲基纖維素鈉, 以質量分數(shù)0.5%的羧甲基纖維素鈉生理鹽水為溶劑，配制質量分數(shù)20 mg/mL的姜黃素混懸液。姜黃素一般于灌胃前1 d配制，于每次灌胃前均經(jīng)53 kHz，37 ℃超聲30 min，灌胃時充分混勻。

雄性 SD大鼠50只, 隨機分為5組, 每組10只,包括常溫常濕空白組、輕度中暑組、中度中暑組、重度中暑組、重度中暑姜黃素干預組(簡稱姜黃素干預組), 除姜黃素干預組大鼠每日1次以姜黃素20 mg/100 g, 1 mL/100 g體質量, 連續(xù)灌胃7 d。其余各組按相同體積連續(xù)灌胃生理鹽水7 d[15-18]。

1.2.2 中暑模型復制 常溫常濕空白組置于SPF飼養(yǎng)間內，(25±0.5) ℃，相對濕度50%±2%，干熱組大鼠置于西北特殊環(huán)境人工實驗艙模擬沙漠干熱環(huán)境中(41±0.5) ℃，相對濕度10%±2%復制中暑模型，參照實驗室前期建立的中暑模型[19,20]。使用多功能生理信號儀420檢測大鼠核心體溫，即將多功能生理記錄儀中的溫度探頭經(jīng)液體石蠟浸潤后, 由肛門旋轉進入大鼠直腸約3 cm處, 待記錄儀上溫度曲線基本保持平穩(wěn)后(約30 s)，讀取記錄儀上的溫度值，即為此時受試大鼠的核心體溫。大鼠分別在干熱實驗艙內熱暴露(50±5) min, 核心體溫達到 39.5～40.6℃,暴露(100 ± 5) min, 核心體溫達到 40.4～41.2 ℃,暴露(150 ± 5) min, 核心體溫達到41.2～42.5 ℃, 造成輕、中、重度中暑模型。受試大鼠給藥進艙后, 嚴格按時間與核心體溫進行篩選，因個別給藥操作不當，刺激受試動物咽喉或受試動物耐熱性個體差異的存在, 淘汰中途死亡及核心體溫未達標動物, 保證各組納入分析的動物數(shù)≥6只。各組大鼠出現(xiàn)各中暑階段的跡象之后，即輕度中暑大鼠身體出汗，但僅局限于頭頸部，呼吸頻率加快，異常興奮, 在籠內四處串動; 中度中暑時大鼠呼吸頻率更快, 全身出汗并已濕透, 仍然四處串動,但明顯動作已經(jīng)遲緩, 喜歡將頭埋于其他動物身下或墊料中; 重度中暑時動物呼吸急促，明顯呼出時間長，吸入時間短，氣體交換基本是有出無進, 全身出汗?jié)裢?，嘴角有唾液等分泌物流出，爬在籠低不動，此時若延長熱暴露時間，動物漸漸停止呼吸死去[21]。

1.2.3 實驗取材 實驗結束后處死大鼠，把大鼠放在無菌手術臺，腹面朝上, 四肢分開, 用手術剪在腹部正中部剪開皮膚及肌肉層，注意刀尖稍向上挑以免傷及內臟。找到胃、十二指腸后，順下找到盲腸，由回盲瓣向胃端上行越10 cm后, 剪取近胃端回腸4 cm，留取其中回腸內容物，液氮凍存; 無菌取近盲端結腸約2 cm, 同法取其中內容物標號登記后，液氮凍存待測。

1.2.4 細菌基因組DNA的提取 液氮凍存的回、結腸內容物采取液氮研磨法，并結合糞便細菌DNA提取試劑盒說明書提取腸道內容物菌群基因組DNA[22]，具體操作如下: (1)隨機取出樣品，無菌組織剪剪取0.1 g腸內容物，放入10 mL帶蓋離心管中，加入0.2 g經(jīng)高溫干烤的玻璃珠，加入液氮并用粗玻璃棒研磨直至磨碎。(2)待液氮揮發(fā)后，按照Omega Bio-tek DNA試劑盒說明書進行操作。(3)將提取的DNA用超微量微孔板分光光度計測DNA濃度，標號登記后，-20℃冰箱保存待用。

1.2.5 引物的設計與合成 設計針對細菌16S rDNA的V3至V5區(qū)大腸桿菌、雙歧桿菌屬、乳酸桿菌屬和腸球菌屬特異性引物[23-25]。引物設計見表1。引物委托北京華大基因合成。

1.2.6 PCR擴增 以上大腸桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌、腸球菌引物對, 以細菌基因組DNA為模板,進行PCR擴增。反應體系均為15 μL: 2×Pre-mix 7.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，細菌DNA模板1 μL，滅菌蒸餾水 5.5 μL。

擴增條件: 乳酸桿菌屬94 ℃預變性4 min, 94 ℃30 s, 55 ℃ 40 s, 72 ℃ 60 s, 30 個循環(huán), 72 ℃ 7 min延伸; 雙歧桿菌屬94 ℃預變性4 min，94 ℃ 15 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 45 s，35 個循環(huán), 72 ℃ 10 min延伸; 大腸桿菌屬94 ℃預變性4 min，94 ℃ 20 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，32 個循環(huán)，72 ℃ 7 min延伸; 腸球菌屬94 ℃預變性3 min, 94 ℃ 30 s, 54.5 ℃40 s，72 ℃ 50 s，30 個循環(huán)，72 ℃ 7 min 延伸。

1.2.7 瓊脂糖凝膠電泳檢測 取PCR產(chǎn)物各10 μL,10 mg/L瓊脂糖凝加5 % Goodview染液, 1×TAE緩沖液，120 V穩(wěn)壓電泳25 min左右，凝膠成像系統(tǒng)拍攝電泳圖譜, 檢查擴增效果，用UVP配套圖像分析軟件對圖像進行灰度分析，計算各菌種的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計方法

所得數(shù)據(jù)以x- ±s表示，實驗組和對照組各類細菌相對表達量的比較用 SPSS 22.0版統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析, 兩兩比較選用LSD法,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠回腸內容物菌群表達量的變化

運用凝膠成像系統(tǒng)自帶分析軟件，對各組大鼠回內容物DNA基因組擴增得到的各菌種擴增目的片段進行灰度分析，得到各菌種的平均吸光度值，以此值來分析各菌種的相對表達量，結果見表2。

由表2可看出，各組大鼠回腸內容物腸球菌的表達量與常溫常濕組比較，中度、重度中暑組極顯著增加(P＜0.01)，隨中暑程度的加深，回腸腸球菌的表達量急劇增加(P＜0.01)，而姜黃素干預后，與重度中暑組比較，腸球菌的表達量極顯著下降(P＜0.01)。大腸桿菌的表達量，與常溫常濕組比較，輕度中暑組顯著增加(P＜0.05)，中度、重度中暑組極顯著增加(P＜0.01)，隨中暑程度的加深，回腸大腸桿菌的表達量極顯著增加(P＜0.01)，而姜黃素干預后，與重度中暑組比較，大腸桿菌的表達量極顯著下降(P＜0.01)。雙歧桿菌的表達量與常溫常濕組比較，輕度中暑組顯著降低(P＜0.05),中度、重度中暑組及姜黃素干預組均極顯著降低(P＜0.01), 而姜黃素干預后, 與重度中暑組比較表達量有顯著回升，但未達到常溫常濕環(huán)境組水平。乳酸桿菌的表達量組間比較均未發(fā)生明顯變化。

表 1 引物序列Table 1 Primer sequence

表 2 各組大鼠回腸內容物菌群表達量的多重比較Table 2 Multiple statistics comparison on microflora expression of ileum content in different groups

表 3 各組大鼠結腸內容物菌群表達量的多重比較Table 3 Multiple statistics comparison on microflora expression of colon content in different groups

2.2 各組大鼠結腸內容物菌群表達量的變化

由表3可知, 與常溫常濕組比較, 各組結腸中腸球菌的表達量顯著增加(P＜0.05或P＜0.01), 姜黃素干預后結腸腸球菌的表達量極顯著降低(P＜0.01)，并基本達到常溫常濕環(huán)境組水平。大腸桿菌的表達量與常溫常濕組比較, 重度中暑組顯著增加(P＜0.05),姜黃素干預后，與重度中暑組比較，大腸桿菌表達量極顯著降低(P＜0.01)，并接近常溫常濕組水平。各組結腸中乳酸桿菌的表達量，輕度、中度、重度中暑組差異不顯著，使用姜黃素后沒有增加其表達量。各組結腸中雙歧桿菌的表達量，輕度、重度中暑極顯著降低(P＜0.01)，而中度中暑時，由于機體的自身代償，雙歧桿菌的表達量極顯著增加(P＜0.01)。姜黃素干預后，結腸雙歧桿菌的表達量極顯著增加(P＜0.01)。

3 討論

中暑是因人體在熱環(huán)境中暴露時間過長(或在烈日下暴曬)，而發(fā)生的以中樞神經(jīng)系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)障礙為主的急性疾病，是熱應激癥候群的總稱?，F(xiàn)有研究[26]表明，中暑是熱失代償引起的類膿毒癥樣反應，炎癥因子的大量釋放及由此引發(fā)的過度免疫是引起機體死亡的原因之一。重癥中暑多繼發(fā)彌散性血管內凝血(DIC)，而由此引發(fā)多器官功能障礙(MODs)是其主要死亡原因，重癥中暑死亡率極高且預后不良，目前國內不時有重癥中暑的報道，中暑的預防工作應受到足夠重視[27,28]。相關研究[29]表明, 高溫應激會引起腸道菌群結構改變, 諸如雙歧桿菌和乳酸桿菌等被視為有保護作用的細菌總數(shù)下降，而腸球菌和大腸桿菌等有害健康的種群數(shù)目增加。本實驗據(jù)此對不同程度中暑大鼠回腸與結腸內容物菌群表達進行檢測，結果顯示回腸與結腸內條件致病菌大腸桿菌、腸球菌的表達量顯著增加, 正常生理狀況下，消化道菌群的數(shù)量自口腔至結腸是逐漸增加的，而在重癥中暑時則出現(xiàn)了倒置的病理狀況，實驗進一步為中暑是由過高熱引起的類膿毒癥樣急癥提供了實驗數(shù)據(jù)。大鼠長時間暴露于高溫干熱環(huán)境中, 體表水分大量流失，表面靜脈血管擴張充盈，血流重新分配，導致內臟處于相對缺血缺氧狀態(tài), 腸道對缺血缺氧非常敏感, 大量氧自由基堆積及血管內皮細胞損傷引發(fā)DIC，致使腸道黏膜上皮細胞壞死、脫落, 腸道黏膜物理屏障、黏膜免疫屏障、腸道黏膜生物屏障遭到破壞, 加之腸道菌群穩(wěn)態(tài)被打破, 大量條件致病菌增值, 腸道菌群移位，細菌內毒素入血，炎癥因子大量釋放引發(fā)過度免疫, 最終導致膿毒癥的發(fā)生, 并進展為MODs，導致患者死亡[30]。雖然對重癥中暑的險惡及其并發(fā)癥進行了大量的研究，但對中暑的發(fā)病機制并未闡明，對其救治仍然沒有找到有效方案，仍需要進行不斷研究找到更多防治藥物與救治方法。

本實驗通過將姜黃素提前灌胃給不同程度中暑的實驗大鼠來評價姜黃素對中暑后腸道有益菌和條件致病菌的影響，實驗結果顯示，姜黃素預處理后能提高回腸與結腸內有益菌雙歧桿菌的表達量，又能降低回腸與結腸內條件致病菌大腸桿菌和腸球菌的表達量，而腸道正常菌群在機體消化、免疫和抗病等方面有諸多不可替代的作用，本實驗結果進一步表明姜黃素具有調節(jié)中暑后機體消化道菌群結構的作用，同時也提示姜黃素可能在減緩中暑大鼠腸道炎癥反應方面有一定作用。但中暑后乳酸桿菌表達量沒有明顯改變，查閱相關文獻可知，乳酸桿菌是至今發(fā)現(xiàn)的唯一沒有致病性的一個菌種，它在人和動物體內占絕對優(yōu)勢，以它為表達系統(tǒng)，較其它菌株更易達到較高的表達量[31]。本實驗結果提示姜黃素可能對腸道內乳酸桿菌沒有干預作用，其機制尚不明確，有待進一步探究。

本實驗結果提示，姜黃素可能通過提高中暑大鼠回腸、結腸，尤其是結腸內雙歧桿菌的表達量，抑制回腸、結腸內大腸桿菌和腸球菌的增殖來維持中暑大鼠腸道菌群穩(wěn)態(tài)，減少腸道炎癥因子對機體的侵襲，發(fā)揮對中暑的預防作用，增強大鼠對中暑的耐受力，結腸內雙歧桿菌的表達受干熱中暑應激的影響波動較大，姜黃素抑制結腸內雙歧桿菌表達量的減少，作用效果顯著，其具體機制尚需進一步研究。