孫維娜 王紹欣 董平栓 汪硯雨 王可 李轉(zhuǎn)珍 魏麗娟 閆鵬 劉向勇 程建新 王麗平 段娜娜 王闖

(河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，河南 洛陽471003)

急性心肌梗死(Acute myocardial infarction, AMI)是急性起病、發(fā)展迅速并死亡率高的心血管疾病，近年大量研究表明,AMI后的心肌細(xì)胞中存在有細(xì)胞凋亡[1]，并與AMI的預(yù)后及演變有關(guān)。細(xì)胞凋亡是基因調(diào)控的程序性死亡，是機(jī)體產(chǎn)生變化或者受到刺激時在基因調(diào)控及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)下引起的一系列連鎖反應(yīng)。目前國內(nèi)外有大量心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)的研究，但對其心梗后心肌凋亡的動態(tài)演變研究較少。本研究通過建立中華小豬急性心肌梗死模型后對心肌梗死的缺血區(qū)心肌細(xì)胞的凋亡指數(shù)(AI)及心肌組織中caspase-3蛋白的表達(dá)進(jìn)行動態(tài)觀察并分析其變化規(guī)律，從而探討AMI后心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制。

1 對象及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對象 健康中華小豬8只，由泰州泰和生物技術(shù)有限公司提供，均同窩出生，體重15～21kg，雌雄各半，全部經(jīng)防疫檢驗(yàn)合格，檢疫證號：3205197447，許可證號：SCXK(蘇)2011-0002。排除近期患病、體質(zhì)差及進(jìn)食不佳的小豬。

1.2 分組及建模 分組：選取其中1只小豬作為對照組，余7只小豬作為實(shí)驗(yàn)組并隨機(jī)分成7個亞組，給予編號1～7組，分別對應(yīng)心梗后1、3、5、7、10、14及28d的小豬，所有小豬均正常喂養(yǎng)，飲食、室溫均相同。建模：將小豬禁食水8～12h后，行肌肉注射誘導(dǎo)麻醉(氯胺酮)，并備皮固定于手術(shù)臺上，同時給予吸氧、心電監(jiān)護(hù)并建立靜脈通路，消毒鋪巾，穿刺部位(右側(cè)股動脈搏動最強(qiáng)點(diǎn))局部麻醉，沿右側(cè)股動脈處穿刺進(jìn)針并送入J型導(dǎo)引導(dǎo)絲及6F動脈鞘管，追加肝素后將Guiding導(dǎo)管送入升主動脈根部，行左右冠狀動脈多體位造影。將Runthrough微導(dǎo)管遠(yuǎn)端送入OM支近端，撤出導(dǎo)絲，將明膠海綿混懸液(明膠海綿溶于造影劑碘普羅胺內(nèi))經(jīng)微導(dǎo)管推入，造影顯示OM支遠(yuǎn)端血流中斷，撤出微導(dǎo)管，拔鞘管，置入人工套管，肝素封閉創(chuàng)口并壓迫6 h，術(shù)畢。對照組僅行冠脈造影術(shù)。在整個手術(shù)過程中小豬心率維持在120～200 次/min，血壓維持在140～180/110～150mmHg(心電監(jiān)護(hù)顯示)。手術(shù)結(jié)束后，將動物送回飼養(yǎng)中心，單豬飼養(yǎng)，避免感染并注意觀察生命體征變化。

1.3 備制標(biāo)本 在成功建立AMI模型后，分別于AMI后第1、3、5、7、10、14及28 d處死實(shí)驗(yàn)組小豬并取出8只小豬的整體心臟，經(jīng)4%的甲醛固定后于左室側(cè)壁切取不同部位的梗死缺血區(qū)及對照組正常心肌各3塊組織，經(jīng)脫水、石蠟包埋后切片(每塊組織均切5張切片)，脫蠟，行TUNEL檢測及caspase-3免疫熒光檢測。TUNEL試劑盒購于美國羅氏abcam公司 In Site Death TMR紅色標(biāo)記，編號：12156792910；caspase-3兔抗購于上海優(yōu)寧維生物科技有限公司，貨號：ab90437。

1.4 實(shí)驗(yàn)步驟

1.4.1 TUNEL法檢測 按照TUNEL試劑盒說明書進(jìn)行。將組織切片放入干燥箱2h，再依次進(jìn)行組織脫蠟、抗原修復(fù)、甲醇-H2O2阻斷液、TUNEL試劑混合液(按抗體混合液：PBS為1:2，其中紅：藍(lán)為45:5，抗體在暗濕盒中孵育1h，37℃)、DAPI染液(按每張組織切片50～100μl 時間10～15min)、覆蓋玻片及中性樹膠封片(從阻斷液后均避光)，將暗濕盒中的切片置于4℃冰箱中保存過夜，每步前后均用PBS洗滌3次×5min，于×40倍電子熒光顯微鏡下觀察心肌凋亡數(shù)目及細(xì)胞核的情況并攝片記錄。

1.4.2 Caspase-3免疫熒光 caspase-3免疫熒光檢測一抗為兔抗豬多克隆抗體，二抗為通用型二抗兔抗鼠免疫熒光試劑盒。先將組織切片放入干燥箱中2h，再依次進(jìn)行脫蠟、抗原修復(fù)、甲醇-H2O2阻斷液、10%山羊血清封閉(山羊血清用PBS稀釋為1:9，時間10min)、一抗孵育(用抗體稀釋液稀釋為1:800， 4℃過夜，棄去血清直接滴加)、二抗孵育(用抗體稀釋液稀釋為1:200， 孵育1h， 37℃)、DAPI染液(按每張組織切片50～100μl，時間10～15min)、覆蓋玻片及中性樹膠封片(從一抗孵育后均避光)封片，4℃冰箱避光保存，每步前后均用PBS洗滌3次×5min，于×40倍電子熒光顯微鏡下觀察caspase-3的表達(dá)情況并攝片。

1.5 觀察指標(biāo) TUNEL法檢測：在顯微鏡觀察下任選陽性集中表達(dá)區(qū)域的10個視野，通過Photoshop-13-LS3軟件進(jìn)行計(jì)數(shù)及圖片整理，統(tǒng)計(jì)視野中陽性指標(biāo)數(shù)目與所占總心肌細(xì)胞數(shù)目百分比的平均值作為凋亡指數(shù)(AI),以定量評價心肌的凋亡程度。免疫熒光：按照caspase-3陽性表達(dá)密度依次從0、20%、40%、60%、80%、100%進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，同時計(jì)算其平均值。

2 結(jié)果

2.1 AMI 模型成功建立 實(shí)驗(yàn)組小豬在局麻下行冠脈造影及OM支明膠海綿封堵術(shù)后，通過對比術(shù)前冠脈造影結(jié)果，顯示OM支遠(yuǎn)端血流中斷，AMI模型建立成功，見圖1。

圖1 建立模型前后冠脈血流情況Figure 1 Coronary blood flow condition before and after the model注：a為實(shí)驗(yàn)組行冠脈封堵術(shù)前，可見血流通暢；b為實(shí)驗(yàn)組冠脈封堵術(shù)后，可見局部血流消失

2.2 TUNEL法檢測結(jié)果 AMI模型建立成功后，行TUNEL法檢測，結(jié)果顯示，正常未梗死心肌(對照組)未見陽性復(fù)合物表達(dá)，見圖2a；AMI后實(shí)驗(yàn)組第1d即出現(xiàn)明顯陽性表達(dá)，同時即為高峰，而后逐漸下降，于第3～7d基本平穩(wěn)，隨后至第14～28d基本降至偏低水平，見圖2b～h和圖3。

2.3 caspase-3免疫熒光檢測結(jié)果 在熒光顯微鏡下觀察caspase-3抗體復(fù)合物的陽性表達(dá)見圖4。實(shí)驗(yàn)組及對照組各切片的陽性表達(dá)結(jié)果見圖5。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過成功建立AMI實(shí)驗(yàn)小豬模型，分別對不同時期心肌梗死周邊缺血區(qū)行TUNEL檢測及caspase-3蛋白免疫組化檢測。從實(shí)驗(yàn)圖片中可見梗死后心肌細(xì)胞核與未梗死細(xì)胞核相比，出現(xiàn)明顯細(xì)胞核體積減小及固縮現(xiàn)象，證實(shí)心肌細(xì)胞凋亡存在；TUNEL檢測結(jié)果顯示，AMI后第1 d AI達(dá)高峰，表明心肌梗死周邊缺血區(qū)存在大量凋亡細(xì)胞，這與 Eeva等[1]實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。隨后AI逐漸下降，在第7d左右處于短期平衡狀態(tài)，這正是心肌梗死后炎癥反應(yīng)時期，同時心肌細(xì)胞也處于逐漸修復(fù)過程中。在AMI后第14～28 d左右心肌處于肉芽及瘢痕組織修復(fù)過程中，凋亡細(xì)胞處于低水平狀態(tài)。TUNEL法檢測及免疫熒光的陽性指標(biāo)動態(tài)演變趨勢大致相同，這進(jìn)一步證實(shí)心肌細(xì)胞在AMI后從凋亡、細(xì)胞壞死、炎癥反應(yīng)及修復(fù)等一系列復(fù)雜的病理變化過程。

圖2 顯微鏡下AMI后心肌細(xì)胞不同時期的TUNEL檢測結(jié)果Figure 2 After AMI, TUNEL of myocardial cell in different periods注：a 指心肌細(xì)胞核，b 指陽性結(jié)果,b～h分別指AMI后第1、3、5、7、10、14、28d的TUNEL檢測結(jié)果

圖3 AMI后心肌細(xì)胞不同時期的AIFigure 3 AI of myocardial cells in different periods after AMI注：橫坐標(biāo)為AMI后不同時期，即心梗后第1、3、5、7、10、14、28d；縱坐標(biāo)表示凋亡指數(shù)

圖4 AMI后心肌細(xì)胞的Caspase-3免疫熒光檢測檢測結(jié)果Figure 4 Caspase-3 immunofluorescence result of myocardial cells after AMI注：a表示對照組免疫熒光結(jié)果,未見陽性表達(dá)，藍(lán)色表示細(xì)胞核；b表示心梗后第3d的陽性表達(dá)，其中桃紅色表示Caspase-3抗原抗體復(fù)合物

圖5 AMI后心肌細(xì)胞AI及Caspase-3免疫熒光結(jié)果

Figure5AIandCaspase3immunofluorescenceofmyocardialcellsafterAMI

注：橫坐標(biāo)為AMI后不同時期；縱坐標(biāo)藍(lán)色線表示凋亡指數(shù)(AI)，紅色線表示免疫組化Caspase-3陽性表達(dá)

國內(nèi)外研究表明，急性心肌梗死后出現(xiàn)的細(xì)胞凋亡是除了壞死以外的另一種細(xì)胞的死亡形式[2]，是在外界因素的影響下導(dǎo)致細(xì)胞自身基因調(diào)控的啟動所發(fā)生的連鎖反應(yīng)。細(xì)胞凋亡是一種由多基因調(diào)控的細(xì)胞程序性死亡，不存在炎癥反應(yīng)，因此是由基因調(diào)控、凋亡因子的激活及凋亡蛋白的執(zhí)行所形成的一系列反應(yīng)[3]。目前研究細(xì)胞凋亡的經(jīng)典途徑有死亡受體途徑、線粒體途徑及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑，其中線粒體途徑是在機(jī)體缺血缺氧、應(yīng)激等狀態(tài)下引起線粒體細(xì)胞色素C的釋放，從而激活細(xì)胞凋亡的“執(zhí)行者”-caspase-3(含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶cysteinyl aspartate specific proteinase)的激活，繼而引發(fā)細(xì)胞凋亡的過程。caspase-3是caspase家族中的一員，是細(xì)胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，正常情況下以無活性的caspase-3前體形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，在機(jī)體受到刺激而出現(xiàn)缺血缺氧時，即可立即激活caspase-3前體，從而啟動細(xì)胞的凋亡[4]，可見Caspase-3蛋白在細(xì)胞凋亡過程中具有至關(guān)重要的作用[5-6]。

先前大量實(shí)驗(yàn)研究表明，心肌缺血、缺氧及再灌注損傷都可導(dǎo)致心肌細(xì)胞的凋亡[7]，心肌細(xì)胞的凋亡參與了多種心血管疾病，并與心肌演變、修復(fù)及預(yù)后有密切關(guān)系。AMI是各種原因引起的心肌在短時間內(nèi)長期持續(xù)性缺血缺氧所引起的心肌損害，心肌的缺血缺氧首先表現(xiàn)在“能量工廠”-線粒體，由于線粒體內(nèi)存在多種促凋亡因子及參與凋亡的蛋白，因此在機(jī)體受到外界因素的刺激時，線粒體在能量ATP下降的同時，誘導(dǎo)促凋亡因子的激活和釋放，從而在基因的調(diào)控下啟動并開始細(xì)胞凋亡的過程。在線粒體能量嚴(yán)重缺乏的情況下出現(xiàn)各種炎癥因子及鈣超載等反應(yīng)，從而引起細(xì)胞的壞死[8]。在傳統(tǒng)觀點(diǎn)上，心肌梗死后出現(xiàn)的主要病理變化是以心肌壞死為主[9-11]，而目前大量相關(guān)研究表明，AMI時在心肌梗死部位首先出現(xiàn)大量的凋亡細(xì)胞，而后出現(xiàn)壞死[12]，這進(jìn)一步說明心肌凋亡參與多種缺血性心肌病的發(fā)生發(fā)展過程。

姚玉宇等[13]通過結(jié)扎雄性大鼠冠狀動脈左前降支建立AMI模型的動物實(shí)驗(yàn)研究表明，動態(tài)觀察AMI后1、7、14、28d的心肌梗死范圍及AI值，結(jié)果顯示AMI后1d細(xì)胞凋亡達(dá)高峰，隨后逐漸下降，28d左右趨于低水平狀態(tài)，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本相符。本實(shí)驗(yàn)同時印證了心肌細(xì)胞凋亡過程中重要參與者-caspase-3蛋白在細(xì)胞凋亡機(jī)制中占有不可或缺的作用。

近幾年國內(nèi)外大量文獻(xiàn)研究，關(guān)于急性心肌梗死后應(yīng)用藥物干預(yù)降低心肌凋亡，進(jìn)一步改善心肌重構(gòu)及預(yù)后，如阿托伐他汀、辛伐他汀及芪藶強(qiáng)心等藥物[14-16]，不僅證實(shí)心肌細(xì)胞凋亡的存在，同時通過藥物干預(yù)組及對照組的對比后得出結(jié)論：經(jīng)過應(yīng)用藥物干預(yù)細(xì)胞凋亡途徑，導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡數(shù)目減少，左室舒張末直徑及射血分?jǐn)?shù)等均較前改善，保護(hù)受損心肌，降低病死率及死亡率。有關(guān)文獻(xiàn)顯示，通過調(diào)節(jié)凋亡因子探究細(xì)胞凋亡不同途徑，進(jìn)一步證實(shí)細(xì)胞凋亡的存在及凋亡機(jī)制[17]。Luo K Q等[18]通過首先建立家兔AMI模型，應(yīng)用SDF-1抗體(stromal cell-derived factor-1 )干預(yù)死亡途徑(NF-κB)，減弱心肌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)血管生成及改善心臟功能。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在AMI后心肌梗死周邊及缺血區(qū)域有大量凋亡因子Caspase-3蛋白存在；當(dāng)心肌細(xì)胞短時間內(nèi)受到缺血缺氧時，可通過細(xì)胞線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的啟動而出現(xiàn)心肌凋亡現(xiàn)象，進(jìn)而參與AMI后心肌重構(gòu)及影響心肌舒縮功能等病理變化過程。未來若應(yīng)用細(xì)胞凋亡抗體則可減少細(xì)胞的不可逆性凋亡。但本研究的樣本數(shù)量較少，未來仍需大樣本研究以進(jìn)一步進(jìn)行認(rèn)證。

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