雷 靜

(成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院，成都 611130)

0 引言

花青素是一種類黃酮類的水溶性色素，廣泛存在于植物體中。植物細(xì)胞液為酸性時(shí)花青素呈現(xiàn)紅色，為堿性時(shí)則呈現(xiàn)藍(lán)色?；ㄇ嗨厥侵参锏囊环N次生代謝產(chǎn)物，參與植物自身一些重要的生理功能。研究表明：花青素具有抗氧化、抗增生和抗突變的特性，還能預(yù)防心血管疾病，阻止腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散。作為一種天然的色素，花青素的營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值極高，還可以用作食品加工的著色劑[1]?；ㄇ嗨厥菢?gòu)成花瓣和果實(shí)顏色的主要色素之一，許多蔬菜和水果的市場(chǎng)價(jià)格都由顏色的深淺決定，反映出花青素巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值?；ㄇ嗨氐幕締卧腔ㄉ?，種類有多種，包括飛燕草素、矮牽牛素和錦葵色素，這3類色素覆蓋了花青素90%以上的種類。

番茄可以同時(shí)作為蔬菜和水果食用，其果實(shí)顏色鮮艷，水分含量大，深受消費(fèi)者的歡迎。但是，番茄的應(yīng)用價(jià)值主要在其所含的番茄紅素，而花青素的含量則相對(duì)較少。有研究對(duì)番茄的核心種質(zhì)資源庫(kù)進(jìn)行了檢測(cè)，僅在極少數(shù)的種質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了很低濃度的花青素。與其野生近緣物種如智利番茄、龍葵和葡萄等相似，番茄的花青素都積累在果實(shí)的表皮中[2]。即便如此，積累花青素的合成途徑仍存在于番茄中，富含花青素的功能型番茄便成為一個(gè)重要的育種目標(biāo)。除了功能方面的研究外，花青素的生物合成過(guò)程和分子機(jī)理也在多種植物中得到了闡明，為利用植物基因工程技術(shù)提高花青素含量創(chuàng)造了條件。例如，趙岑等通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將花青素調(diào)節(jié)基因VlmybA2轉(zhuǎn)入番茄，使根、莖、葉脈和果實(shí)均呈現(xiàn)出紫色，大幅度地提高了番茄花青素的含量[3]。

在花青素的相關(guān)研究中，含量的測(cè)定是最基礎(chǔ)的技術(shù)手段。植物不同組織中的花青素含量測(cè)定方法有很多種，如正丁醇鹽酸法、香草醛鹽酸法、鹽酸甲醇法和pH示差法等。在實(shí)際研究中，一般根據(jù)植物組織不同的物質(zhì)結(jié)構(gòu)和特性，選擇相應(yīng)的測(cè)定方法。其中，正丁醇鹽酸法和香草醛鹽酸法可以用于測(cè)定落葉松樹皮的花青素含量，鹽酸甲醇法則用于測(cè)定油菜的種皮[4-5]。這3種方法的原理基本相同，都是將花青素抽提出來(lái)成為溶液，然后用分光光度計(jì)測(cè)量溶液的吸收光譜，計(jì)算其中的花青素濃度。pH示差法是根據(jù)花色苷在不同的pH值條件下的形態(tài)不同，顯示的顏色各異來(lái)確定花青素的濃度，其測(cè)定的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性更好[5-6]。隨著實(shí)驗(yàn)技術(shù)的進(jìn)步，高效液相色譜法也用于花青素的含量測(cè)定。該方法操作簡(jiǎn)便，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)花青素的精準(zhǔn)定量測(cè)定，但需要標(biāo)準(zhǔn)濃度的樣品和較昂貴的儀器，限制了它的應(yīng)用范圍[7]。

常規(guī)的方法都需要用植物組織樣品提取溶液，然后通過(guò)分析吸光度值或色譜來(lái)測(cè)定花青素的含量。這些方法對(duì)儀器設(shè)備有一定的要求，不能滿足實(shí)時(shí)、快速和無(wú)損傷的要求，測(cè)定消耗的物質(zhì)和人力成本也較高；部分方法難以達(dá)到很高的精確度，只能進(jìn)行定性檢測(cè)。計(jì)算機(jī)視覺是一種新興的分析技術(shù)，其概念在20世紀(jì)60年代初被提出來(lái)，在80年代取得了長(zhǎng)足的發(fā)展。計(jì)算機(jī)視覺的核心內(nèi)容包括圖像的理解和圖像的分析，現(xiàn)在已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用到社會(huì)發(fā)展的各個(gè)領(lǐng)域。計(jì)算機(jī)視覺在農(nóng)業(yè)上可以用于果實(shí)的采摘、分級(jí)檢測(cè)、田間雜草定位識(shí)別和農(nóng)業(yè)機(jī)械路徑識(shí)別等，代表了現(xiàn)代精準(zhǔn)農(nóng)業(yè)的研究和發(fā)展方向。

目前，利用計(jì)算機(jī)視覺測(cè)定作物各種色素含量的技術(shù)方法已經(jīng)成熟，其在葉綠素含量測(cè)定中的報(bào)道最多[8-11]。這一方法的基本過(guò)程是采集目標(biāo)圖像后提取顏色特征參數(shù)，然后與對(duì)應(yīng)的葉綠素含量做相關(guān)性分析，選擇擬合程度最高的特征參數(shù)建立回歸方程并檢驗(yàn)其準(zhǔn)確度。這一方法在辣椒紅色素的含量測(cè)定中也有應(yīng)用，但是用于測(cè)定植物花青素含量的報(bào)道目前還很少[12]。借鑒這些研究，本文利用計(jì)算機(jī)視覺和統(tǒng)計(jì)分析軟件，對(duì)番茄成熟果實(shí)的各種顏色特征和花青素含量之間的相關(guān)性進(jìn)行分析，選擇合適的參數(shù)建立計(jì)算模型，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)花青素含量的快速無(wú)損測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 番茄果實(shí)圖像采集

測(cè)定的番茄樣品為從大棚中采集的中雜101品種的成熟果實(shí)，個(gè)體質(zhì)量在200～300g之間，形狀近圓形，顏色為粉紅色。該品種的果實(shí)表皮含有低水平的花青素。

圖像采集系統(tǒng)的硬件包括數(shù)碼相機(jī)、暗箱和計(jì)算機(jī)。計(jì)算機(jī)軟件為WindowsXP操作系統(tǒng)、MatLab圖像處理工具及SPSS16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。數(shù)碼相機(jī)為與計(jì)算機(jī)連接的Nikon DL24-500型，關(guān)閉閃光燈，安裝在暗箱的頂部，距離番茄果實(shí)20cm。暗箱的內(nèi)壁黑色，頂部?jī)啥朔謩e安裝2盞15W的白光燈，底部平臺(tái)用于放置被拍攝物體，如圖1所示。選取50個(gè)正常的番茄分別編號(hào)后進(jìn)行拍攝，形成JPEG格式的圖片傳入計(jì)算機(jī)。

1.2 花青素含量的常規(guī)測(cè)定

采集完圖像的番茄立即取樣測(cè)定花青素含量，具體方法為撕下表皮，稱取約0.1g后剪碎；將表皮碎片放入離心管中，加入5mL的0.1M的HCl，然后在32℃的恒溫箱中靜置5h后過(guò)濾。濾液用蘇州島津UV-2450/2550型紫外可見分光光度計(jì)讀取530nm波長(zhǎng)和1cm光徑下的吸光度值，并用0.1M的HCl作為空白對(duì)照；最后，按照文獻(xiàn)介紹的方法計(jì)算花青素的濃度[13]。

1.3 圖像預(yù)處理

采集的圖像質(zhì)量受各種因素影響，可能會(huì)出現(xiàn)噪音、毛刺和孤立點(diǎn)等問(wèn)題，不利于對(duì)目標(biāo)區(qū)域的分割和特征提取。因此，需要對(duì)圖像進(jìn)行預(yù)處理，包括灰度化和圖像分割。原始圖片中的番茄是粉紅色，背景主要為黑色，夾雜少量白色的斑點(diǎn)，利用二者之間顏色的差異將番茄從背景中分離出來(lái)。彩色圖像的分割首先要進(jìn)行灰度化，然后根據(jù)顏色進(jìn)行閾值分割。選擇合適的閾值對(duì)于圖像處理分割的效果有著決定性影響，它是通過(guò)分析直方圖獲得的。本文中番茄的特征受光照影響不大，因此為了確定閾值，將灰度圖做了最大類間方差分析后再進(jìn)行圖像二值化；直方圖得到各形狀特征的閾值，然后通過(guò)最大閾值分割圖像。圖像的預(yù)處理如圖2所示。

1.4 顏色空間的應(yīng)用

彩色圖像的顏色空間有多種，如RGB、HIS、CMY和YIQ等，本文根據(jù)所采集的圖像特點(diǎn)和研究目的，選擇RGB顏色空間用于模型建立。RGB模型中的R、G和B分別代表圖像中的紅、綠和藍(lán)3種顏色的亮度值，通過(guò)改變這3者的數(shù)量，可以混合成其它的各種顏色。但是，RGB顏色特征值受到光照強(qiáng)度影響較大。針對(duì)這一問(wèn)題，通常采用變換的r、g、b值來(lái)消除光照差異的影響。這3個(gè)參數(shù)是以R、G和B為3基色的數(shù)量，對(duì)其做歸一化了的數(shù)值。具體的計(jì)算公式為：r=R/(R+G+B)，g=G/(R+G+B)，b=B/(R+G+B)，因此r+g+b=1。它們對(duì)光照強(qiáng)度的變化不敏感，能夠消除光線差異引起的誤差。另外，還采用了一些上述6個(gè)參數(shù)之間的簡(jiǎn)單算術(shù)組合作為顏色特征參數(shù)，來(lái)與花青素含量之間進(jìn)行相關(guān)性檢驗(yàn)。

1.5 模型的構(gòu)建和檢驗(yàn)

從50個(gè)番茄中隨機(jī)選取30個(gè)樣品的圖片和數(shù)據(jù)作為建模集，用于構(gòu)建模型；剩余的20個(gè)樣品的圖片和數(shù)據(jù)作為檢驗(yàn)集，用于檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臏?zhǔn)確度。在WindowsXP操作環(huán)境中，利用MatLab圖像處理工具提取建模集樣品的圖像特征，分析上述顏色特征參數(shù)與花青素含量之間的相關(guān)性，選取擬合程度最高的特征參數(shù)建立花青素含量的回歸計(jì)算模型。最后，分析檢驗(yàn)集樣品的圖像，計(jì)算花青素含量，對(duì)照常規(guī)方法所測(cè)的花青素含量值，依據(jù)置信區(qū)間對(duì)模型進(jìn)行檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 顏色特征參數(shù)與花青素含量間的相關(guān)性分析

利用圖像處理工具和統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)R、G、B及其經(jīng)過(guò)形式變換所得的總共18個(gè)顏色特征參數(shù)進(jìn)行了與花青素實(shí)際含量之間的相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)與花青素含量之間存在顯著或極顯著相關(guān)性的參數(shù)分別有6個(gè)和7個(gè)。其中，R及其作為分母的參數(shù)與花青素含量之間呈正相關(guān)；G及其作為分母的參數(shù)與花青素含量之間呈負(fù)相關(guān)，顯著性的程度各異；B及其相關(guān)參數(shù)與花青素含量之間的相關(guān)程度相對(duì)較低。R、G、B這3個(gè)基本參數(shù)的相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值在0.304～0.436之間，由其變換得到的部分參數(shù)的相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值更高，有的接近或超過(guò)0.5，表現(xiàn)出更好的擬合性。

顏色特征參數(shù)與花青素含量之間的相關(guān)性數(shù)據(jù),如表1所示。

2.2 花青素含量測(cè)定模型

根據(jù)表1的結(jié)果，選擇R、r、r-g、R-G、R/G和R/(G+B)這6個(gè)相關(guān)系數(shù)較大的代表性特征參數(shù)用于建立測(cè)定模型，利用統(tǒng)計(jì)分析軟件擬合了這些特征參數(shù)與花青素含量之間的回歸方程、決定系數(shù)和均方根誤差，回歸方程的擬合程度通過(guò)決定系數(shù)和均方根誤差來(lái)評(píng)價(jià)。結(jié)果表明：以r和R/(G+B)為特征參數(shù)建立的回歸方程的擬合度較好。

表1 顏色特征參數(shù)與花青素含量之間的相關(guān)性Table 1 The correlation between color characteristic and anthocyanin content

*, **表示檢驗(yàn)在P<0.05和P<0.01水平上具有顯著性。

顏色特征參數(shù)與花青素含量之間的回歸模型數(shù)據(jù)如表2所示。

表2 顏色特征參數(shù)與花青素含量之間的回歸模型Table 2 The regression models between color characteristic and anthocyanin content

*, **表示檢驗(yàn)在P<0.05和P<0.01水平上具有顯著性。

2.3 模型的檢驗(yàn)

用表2中的6個(gè)回歸方程分別處理檢驗(yàn)集中的20個(gè)樣品的圖像，計(jì)算花青素含量，并與實(shí)際測(cè)定值比較分析，依據(jù)置信區(qū)間檢驗(yàn)各模型的精確性。正態(tài)分布檢驗(yàn)結(jié)果表明：6個(gè)模型的殘差服從正態(tài)分布，由此計(jì)算出顯著水平下的置信區(qū)間。從表3中可以看出：以這6個(gè)特征參數(shù)建立的回歸模型都能較好地反映樣品的花青素含量，其中r和R/(G+B)這2個(gè)參數(shù)的模型的錯(cuò)檢個(gè)數(shù)少，誤差也更小，說(shuō)明擬合程度和精確度最高，可以用來(lái)預(yù)測(cè)樣品中的花青素含量。

回歸模型的精確性檢驗(yàn)數(shù)據(jù)分析如表3所示。

表3 回歸模型的精確性檢驗(yàn)Table 3 The accuracy test of regression models

3 結(jié)論

利用計(jì)算機(jī)視覺技術(shù)對(duì)建模集的番茄圖像進(jìn)行分析，從18個(gè)顏色特征參數(shù)中發(fā)現(xiàn)了6個(gè)與花青素的實(shí)際含量之間存在極顯著的相關(guān)性。分別以這6個(gè)參數(shù)為函數(shù)，建立了二者之間的一元二次方程的回歸模型。通過(guò)決定系數(shù)和均方根誤差評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)以r和R/(G+B)為特征參數(shù)建立的回歸方程的擬合度最好，對(duì)檢驗(yàn)集花青素含量的預(yù)測(cè)表現(xiàn)出很高的精確度，可以作為番茄花青素含量快速無(wú)損測(cè)定的有效方法。

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