黃開順 梁海英 李開祥 李寶財 趙志珩

(1. 廣西林業(yè)科學(xué)研究院，國家林業(yè)局八角肉桂工程技術(shù)研究中心，廣西木本香料工程技術(shù)研究中心，廣西特色經(jīng)濟(jì)林培育與利用重點實驗室，廣西 南寧 530002；2. 克萊姆森大學(xué)，美國 克萊姆森 29634)

柱頭是植物完成傳粉受精的門戶，花粉落到柱頭上經(jīng)過交互作用，萌發(fā)出花粉管，花粉管在花柱內(nèi)不斷伸長進(jìn)入胚囊，釋放雄配子，最終完成雌雄配子的融合，可見柱頭在受精過程中具有重要作用[1]。柱頭性狀比較穩(wěn)定，成為植物類群劃分和演化趨勢研究的重要對象。趙敏桂等[2]通過對牡丹組植物的柱頭解剖研究，提出了牡丹組亞組劃分的新觀點，在牡丹組植物柱頭性狀的演化趨勢方面也獲得了重要認(rèn)識。

花粉是植物生長、遺傳、變異特性和功能的基礎(chǔ)，其形態(tài)是在長期的進(jìn)化過程中不斷演化和發(fā)展形成，性狀較為穩(wěn)定，有許多微細(xì)形態(tài)特征明顯體現(xiàn)出種間的差異性，植物學(xué)者已廣泛利用花粉形態(tài)作為植物分類、系統(tǒng)發(fā)育、起源與演化研究的輔助指標(biāo)[3]。劉志紅等[4]通過對花粉形態(tài)觀察和鑒定，闡明了松樹4個樹種的進(jìn)化演替規(guī)律，認(rèn)為花粉大小及花粉體和萌發(fā)區(qū)的形態(tài)可作為松屬分類的輔助孢粉指標(biāo)。賈子瑞等[5]通過花粉形態(tài)觀察，實現(xiàn)了云杉屬植物的分類，建立了云杉屬20個種的花粉形態(tài)檢索表。王麗娟等[6]應(yīng)用掃描電鏡，觀察了煙臺甜櫻桃 (Cerasusavium) 花期不同發(fā)育階段柱頭形態(tài)的變化，獲得了櫻桃柱頭可授性的變化規(guī)律。

八角 (Illiciumverum) 特產(chǎn)于我國廣西、云南亞熱帶地區(qū)[7]，是一種具有香調(diào)料和藥用價值的經(jīng)濟(jì)林樹種，其果實大紅八角以及從枝葉、果實提取的茴油、莽草酸等內(nèi)含物具有較高的利用價值[8]，常年出口歐美、日韓等國[9-10]，深受消費者青睞。我國大規(guī)模人工栽培八角已有50多年的歷史，因此有關(guān)八角生物學(xué)、生態(tài)學(xué)特性的研究已較多[11]，國外在八角有效成分提取和利用方面也深有研究[12-13]。八角品種類型多樣，國內(nèi)曾有一些資料對八角基本生物學(xué)特性、品種分類等方面進(jìn)行了較詳實的觀察與描述，但以肉眼可觀的宏觀表型性狀描述為主[14]，少有八角柱頭和花粉的微觀形態(tài)研究。林祁等人曾對八角在內(nèi)的八角屬13種1變種植物的花粉形態(tài)進(jìn)行掃描電鏡觀察，驗證了八角屬各組分類的合理性，以及該屬花粉形態(tài)的演化趨勢[15]。目前八角柱頭和花粉的超微形態(tài)結(jié)構(gòu)尚不清楚，柱頭和花粉形態(tài)指標(biāo)在八角品種分類依據(jù)中的可靠度尚未明了。研究柱頭和花粉形態(tài)，也有助于提高對八角傳粉生物學(xué)的認(rèn)識，指導(dǎo)八角遺傳改良和良種選育工作。本研究旨在應(yīng)用體視鏡和掃描電鏡，對不同花色品種八角的柱頭、花粉形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行更詳實的描述，為八角品種進(jìn)化、分類、遺傳改良等研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料采集

取材于南寧城郊廣西林科院八角種質(zhì)資源收集圃的12年生八角樹，在9月八角開花盛期的晴朗天氣進(jìn)行采樣。紅花、淡紅花、白花和黃花八角品種類型各選擇1株，共4珠，分別在樹冠中部向陽部位采集盛開的花朵10朵，其中花藥已開裂且有花粉散出5朵，花藥未開裂5朵，分單株和花類編號，放入保鮮袋，立即帶回實驗室進(jìn)行解剖觀察及固定處理。

1.2 觀察方法

1.2.1體視顯微鏡觀察

每株取花藥開裂、未開裂花朵各一朵，剝?nèi)セò?，立即使用型號Nikon SMZ 1500、變焦范圍0.75～11.25X的體視顯微鏡觀察雌蕊花柱、柱頭以及雄蕊花藥開裂、散出花粉的形態(tài)特征，選取典型視野、角度進(jìn)行實體形態(tài)拍照記錄。

1.2.2掃描電鏡觀察

每株取花藥已開裂花朵剝?nèi)ニ谢ò?，剩下的花蕊放入EP管中并用2.5%戊二醛固定液固定，置于2～8 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｓ^察時，先從EP管中取出樣品，經(jīng)漂洗后，梯度乙醇50%、70%、85%、95%逐級脫水1次，100%乙醇脫水3次，每次15 min，之后使用Quorum K850臨界點干燥儀干燥，裕隆時代LJ-16小型離子濺射儀噴金鍍膜，最后置于卡爾蔡司EVO LS10掃描電鏡下觀測，選有代表性的視野觀察花蕊、花柱、柱頭及花粉的形貌并拍照記錄?；ǚ坌螒B(tài)術(shù)語描述參考 《孢粉學(xué)概論》[16]以及 《孢粉學(xué)手冊》[17]，形態(tài)指標(biāo)包括極軸長 (P)、赤道軸長 (E)、極赤比 (P/E) 和花粉體積V (根據(jù)公式πPE2/6計算)。利用電鏡測量工具，隨機(jī)選取10粒花粉測量花粉形態(tài)指標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 八角柱頭分布形態(tài)及顏色特征

八角的心皮通常為8個，有時7或9個，少數(shù)達(dá)10～12個，呈聚合放射星芒狀排列，心皮的上端為花柱及柱頭，呈 “J” 型卷曲，卷曲程度有所差異 (圖1-1, 2, 5)。柱頭受粉面在 “J” 型中下段的外側(cè)，呈狹長帶狀 (圖1-3)，與雄蕊花藥近距離相望。從進(jìn)化特征來看，柱頭呈卷曲分布形態(tài)和長帶狀的受粉面，有利于接受雄蕊群花藥開裂時散出的花粉，提高自身的受孕與繁殖能力。由八角花柱形態(tài)認(rèn)為，八角花柱發(fā)育較為原始，柱頭與花柱的分化不明顯，受粉面的長度基本覆蓋整個花柱，并不像其他高等植物具有細(xì)長花柱且柱頭明顯地分化在上端。

八角花色多樣，黃卓民等通過八角資源普查，大體上按花瓣顏色將八角劃分成紅花八角、淡紅花八角、白花八角和黃花八角4個品種類型[14]。試驗發(fā)現(xiàn)八角的柱頭顏色有紅色、粉紅色和米白色，不一定與花瓣顏色相同，其中紅花、淡紅花類的柱頭顏色有紅色、白色，但白花、黃花類的柱頭顏色均為米白色。

2.2 八角柱頭顯微結(jié)構(gòu)

體視顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，紅花、淡紅花、白花和黃花4個品種八角的柱頭受粉面發(fā)育有緊密排列、晶瑩剔透的帶狀乳突組織 (圖1-3, 4)，當(dāng)花朵開放2～4 d后，乳突失水萎縮變成暗褐色，接受花粉的能力明顯下降。進(jìn)一步通過掃描電鏡觀察，柱頭尖端部分無乳突，乳突呈緊密排列的圓棒狀或圓球狀突起，表面具大量分泌物，從破損及變形扁平的乳突可以看出乳突體內(nèi)部近于空虛，內(nèi)容物極少或者無，易扁癟或破損。表面具分泌物的柱頭乳突結(jié)構(gòu)有利于捕獲花粉，花粉粒落到乳突表面被粘住并獲得適宜的萌發(fā)條件。不同花色品種的柱頭乳突表面紋飾存在差異，其中白花八角的柱頭乳突表面呈明顯的近圓形或不規(guī)則條形凸起，略顯粗糙，表面分泌物較多，而紅花、淡紅花、黃花八角的柱頭乳突表面較為平滑，呈細(xì)網(wǎng)狀皺紋，分泌物較少 (圖2)。

2.3 八角花粉形態(tài)

根據(jù)掃描電鏡觀察，4個花色品種類型的八角花粉形貌大致相近，粉體呈扁圓形、扁球形，具3條沿極軸方向等間距分布的萌發(fā)溝，萌發(fā)溝長至兩極，有的甚至在極部連通。花粉外壁具有清晰的穴網(wǎng)狀紋飾，網(wǎng)眼為不規(guī)則的多邊形，穴內(nèi)表面粗糙凸起，穴口往里逐漸變窄小，網(wǎng)眼大小不一，其中萌發(fā)溝邊緣處的網(wǎng)眼較小 (見圖3)。通過掃描電鏡測量，花粉極軸長15.45～25.01 μm，赤道軸長19.26～27.15 μm，極赤比0.73～1.01，體積4 409.78～6 990.04 μm3。由方差分析結(jié)果 (表1)可知，不同花色品種花粉的極軸長、赤道軸長、極赤比、體積大小均差異顯著，說明花粉粒大小一定程度上受不同花色品種的影響。由多重比較結(jié)果 (表2) 可知，淡紅花、白花的花粉極軸長差異不顯著，兩者與紅花、黃花差異顯著，紅花與黃花之間差異也顯著；紅花、黃花的花粉赤道軸長差異不顯著，兩者與淡紅花、白花差異顯著，淡紅花與白花之間差異也顯著；淡紅花、白花、黃花的花粉極赤比差異不顯著，三者與紅花差異顯著；花粉體積的差異規(guī)律與赤道軸長的差異規(guī)律相同，其中淡紅花、白花的花粉體積顯著大于紅花、黃花的花粉體積。

1. 雄蕊和雌蕊群；2. 呈 “J” 型卷曲的花柱及柱頭；3. 具密集乳突的長帶狀柱頭；4. 卷曲柱頭上晶瑩剔透的乳突；5. 雄蕊群和雌蕊群的側(cè)面觀；6. 花藥已開裂散粉的雄蕊群；7. 謝花后柱頭；8. 柱頭上的白色花粉。X為花藥未開裂散粉的單枚雄蕊；Z為柱頭；r為乳突；k為花藥已開裂散粉的單枚雄蕊。

圖1八角柱頭分布形態(tài)
Fig.1 The distribution of stigma ofI.verum

1. 柱頭群分布全貌；2. 單個柱頭及其乳突；3. 柱頭圓棒狀乳突發(fā)生扁平及斷裂；4. 圓棒狀乳突緊密排列并粘附有花粉粒；5. 紅花、淡紅花和黃花八角柱頭乳突形態(tài)；6. 圖5中乳突放大顯示倍數(shù)后的形態(tài)，其乳突表面呈細(xì)網(wǎng)狀皺紋，分泌物較少；7. 白花八角柱頭乳突形態(tài)；8. 圖7中乳突放大顯示倍數(shù)后的形態(tài)，其乳突表面呈近圓形或不規(guī)則條形凸起，分泌物較多。r為乳突；jd為無乳突的柱頭尖端部分；br為發(fā)生扁平變化的乳突；pr為破損的乳突；f為乳突表面吸附的花粉粒。

圖2八角柱頭顯微結(jié)構(gòu)
Fig.2 Microstructure of stigma ofI.verum

1, 2. 花藥開裂且花粉準(zhǔn)備從裂口散出；3. 花藥內(nèi)壁上附著的花粉粒；4. 花粉粒斜面觀，花粉粒三裂萌發(fā)溝長達(dá)兩極并相連通；5. 花粉粒極面觀，花粉粒三裂萌發(fā)溝長達(dá)兩極但無相連通；6. 花粉粒表面穴網(wǎng)狀紋飾及萌發(fā)溝形態(tài)。f為花粉粒；y為花藥外壁紋飾；yb為花藥內(nèi)壁紋飾。

圖3 八角花粉形態(tài)Fig.3 Pollen morphology of I.verum

表2 不同品種八角花粉形態(tài)特征及多重比較結(jié)果Table 2 Morphological characters and multiple comparisons of pollens of different varieties of I.verum

注：同列數(shù)據(jù)后不同字母表示差異顯著。

3 結(jié)論與討論

柱頭卷曲是植物常見的器官發(fā)育形態(tài)。趙敏桂等對牡丹組植物的不同類群進(jìn)行心皮解剖研究，發(fā)現(xiàn)花柱及柱頭不同程度地向被縫線卷曲[2]。八角花柱和柱頭呈 “J” 型卷曲，柱頭受粉面與雄蕊花藥毗鄰相望，這種器官進(jìn)化形態(tài)和空間分布關(guān)系有利于花粉的傳受，提高自身受孕率。學(xué)者普遍認(rèn)為植物花柱和柱頭性狀相對穩(wěn)定，是劃分植物類群和演化關(guān)系的重要依據(jù)，但本次觀察發(fā)現(xiàn)八角種內(nèi)不同花色類群的柱頭彎曲形態(tài)基本相似，品種類型與柱頭彎曲形態(tài)無明顯的差異規(guī)律。八角花色多樣，大體上可劃分為紅花八角、淡紅花八角、白花八角和黃花八角4個品種類型，但柱頭顏色與花瓣顏色也不一定相同，實質(zhì)上花色不易于劃分明顯的顏色界限，如此分類主要是方便生產(chǎn)中對八角的基本認(rèn)識。雖然八角花色多樣，但柱頭彎曲形態(tài)基本相似，這也說明了八角花柱和柱頭性狀的相對穩(wěn)定性。

花粉也是植物較為保守的器官，花粉形態(tài)主要受基因控制，受環(huán)境條件影響較小，具有相對固定的形態(tài)結(jié)構(gòu)，因此在許多植物分類、鑒別和種質(zhì)資源的起源、演化及親緣關(guān)系研究中具有重要的參考價值[18-19]。按照Punt等的描述，P/E為0.5～0.8為扁圓形，P/E為0.8～1.0為扁球形，P/E為1.0～1.1為長球形[17]。八角花粉P/E為0.73～1.01，基本形態(tài)為扁圓形、扁球形。通過觀察發(fā)現(xiàn)，八角花粉外觀形態(tài)與各品種的花色不存在直接關(guān)聯(lián)，因而依據(jù)花粉外觀形態(tài)進(jìn)行分類和鑒定存在一定的局限性，可能需要綜合運用形態(tài)學(xué)、孢粉學(xué)、細(xì)胞解剖學(xué)、分子生物學(xué)等手段，才能得到科學(xué)、客觀的結(jié)論。雖然本研究在測量花粉體積大小時，發(fā)現(xiàn)多數(shù)品種類型之間的花粉體積大小存在顯著差異，但鑒于花粉樣本量略有不足，因此能否通過花粉體積大小的差異作為八角品種分類的依據(jù)，有待于進(jìn)一步研究。

八角花柱及柱頭形態(tài)呈 “J” 型卷曲，卷曲程度略有差異，柱頭外表顏色與花瓣顏色不一定相同，柱頭分布有密集的圓棒狀或圓球狀乳突，表面具分泌物，乳突體內(nèi)部近于空虛，易扁癟或破損。乳突表面紋飾因不同花色品種存在一定差異，白花類呈近圓形或不規(guī)則條形凸起，分泌物較多，而紅花、淡紅花、黃花類呈細(xì)網(wǎng)狀皺紋，分泌物較少。各花色類型花粉在形狀、萌發(fā)溝、外壁紋飾上具有一致性，無明顯差異規(guī)律，形狀以扁圓形、扁球形為主，具3條萌發(fā)溝，溝長至兩極，外壁具穴網(wǎng)狀紋飾，網(wǎng)眼呈不規(guī)則的多邊形，網(wǎng)眼大小不一。由于品種間花粉粒外觀形態(tài)的差異較小，無明顯規(guī)律，若以花粉粒外觀形態(tài)作為評判依據(jù)，并不易于區(qū)分八角品種的類別。

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