苗 飛，孟 陽，王 悅，袁春營，崔青曼

(天津科技大學(xué) 海洋與環(huán)境學(xué)院，天津市海洋資源與化學(xué)重點(diǎn)試驗(yàn)室，天津 300457)

幾丁質(zhì)廣泛存在于真菌、細(xì)菌、高等植物及甲殼動(dòng)物等的外殼中，據(jù)估計(jì)自然界每年生物合成的幾丁質(zhì)約為1×1011t，是自然界中第二豐富的多聚糖[1-3]。幾丁質(zhì)及其降解產(chǎn)物作為重要的有機(jī)碳源和氮源參與生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)交換和能量流動(dòng)[4]，同時(shí)作為一種新材料，已廣泛應(yīng)用在化學(xué)、醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)、環(huán)保等領(lǐng)域[5]。目前幾丁質(zhì)的降解產(chǎn)物主要來自于化學(xué)方法的降解，但是該方法會(huì)引起較嚴(yán)重的環(huán)境污染，不符合綠色生產(chǎn)的需要。而幾丁質(zhì)酶可催化水解幾丁質(zhì)的β-1，4糖苷鍵，生成N-乙酰氨基葡萄糖，具有條件溫和、得率高且不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)，因此在蟹、蝦殼等幾丁質(zhì)廢物的轉(zhuǎn)化和利用方面具有廣闊的前景[6-8]。自然環(huán)境中存在大量幾丁質(zhì)，其降解主要由微生物來完成，那么從自然界中分離篩選幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌株，無疑是一條較為有效的途徑，一些學(xué)者已從自然環(huán)境中分離出幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌株，并進(jìn)行了條件優(yōu)化、酶學(xué)性質(zhì)及基因能克隆等研究[9-12]。此外，微生物產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶還可用于生物防治上，趙秋敏等[13]從524株芽孢桿菌中篩選出一株幾丁質(zhì)酶活力高的側(cè)孢芽孢桿菌(Bacilluslaterosporus)1.864菌株。研究表明，該菌對(duì)小麥赤霉菌等6種病原真菌具有明顯的抑制作用。通過幾丁質(zhì)酶抑制劑以及酶活力變化對(duì)抑制真菌活性的相關(guān)研究，初步認(rèn)為該菌株的抑菌物質(zhì)為幾丁質(zhì)酶。生物測定表明1.864的幾丁質(zhì)酶粗酶對(duì)蚊幼具有較高的活性，同時(shí)對(duì)蘇云金桿菌(B.thuringiensis)制劑殺蟲活性具有明顯的增效作用。基于此，筆者從對(duì)蝦養(yǎng)殖底泥中分離并鑒定一株幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌株，并采用響應(yīng)面法對(duì)該菌株的產(chǎn)酶條件進(jìn)行了優(yōu)化，為該菌株的進(jìn)一利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株

該菌株從天津漢沽對(duì)蝦養(yǎng)殖池底泥中分離得到。

1.1.2 主要材料

K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、FeSO4·7H2O、ZnSO4、NaNO3、NaCl、苯酚均為分析純；瓊脂(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；細(xì)粉幾丁質(zhì)、GoldViewⅠ型核酸染色劑(北京索萊寶科技有限公司)；3，5-二硝基水楊酸(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)；Taq DNA polymerase、dNTPs(大連寶生物工程有限公司)；普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒(北京天根生化科技有限公司)。

膠體幾丁質(zhì)液體發(fā)酵培養(yǎng)基(%)：KH2PO40.03，K2HPO40.07，F(xiàn)eSO40.002，MgSO4·7H2O 0.05，ZnSO40.001，1%(m/V)膠體幾丁質(zhì)1.5，pH 7.0。

膠體幾丁質(zhì)固體篩選培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加1.6%瓊脂。

膠體幾丁質(zhì)的制備參考文獻(xiàn)[14]的方法并略作修改:1 g幾丁質(zhì)加入少量丙酮研磨至糊狀，加入40 mL濃鹽酸，使之充分溶解，經(jīng)玻璃纖維棉過濾，得到的液體溶于5倍體積的50%乙醇溶液中，攪拌至出現(xiàn)膠體懸浮物，反復(fù)離心、蒸餾水洗滌直至中性，配制含量為1%(m/V)后，冰箱中4 ℃保存。

1.1.3 主要儀器

立式雙層小容量恒溫培養(yǎng)搖床(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)，全溫型多振幅軌道搖床(上海智城分析儀器制造有限公司)，立式蒸汽滅菌器(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)，智能型垂直流超凈工作臺(tái)(上海智城分析儀器制造有限公司)，高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司)，生物顯微鏡(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)，精密pH計(jì)(天津市盛邦科學(xué)儀器技術(shù)公司)，CO2培養(yǎng)箱(Thermo Scienrific有限公司)，電子分析天平(上海奧豪斯儀器有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌株的篩選

平板篩選法，參考文獻(xiàn)[15]的方法進(jìn)行。取少量底泥加入適量無菌水重懸，上清液梯度稀釋后涂布于膠體幾丁質(zhì)平板上，30 ℃培養(yǎng)3～5 d，觀察在菌落周圍是否產(chǎn)生透明圈，挑選透明圈直徑較大的菌株，經(jīng)多次劃線純化后，將初篩菌株接入膠體幾丁質(zhì)液體發(fā)酵培養(yǎng)基，測定幾丁質(zhì)酶活力，選取酶活力最高的菌株WY作為試驗(yàn)菌株。

1.2.2 幾丁質(zhì)酶活力的測定

[16]的方法并加以改進(jìn)。取發(fā)酵液3 mL，8000 r/min離心15 min后，取上清液1 mL與1%膠體幾丁質(zhì)1 mL混合，40 ℃反應(yīng)30 min，取出加入1.5 mL蒸餾水與1.5 mL DNS溶液，混勻，沸水浴5 min后，流水冷卻至室溫，定容至25 mL，于540 nm處測吸光值，以滅活的酶液作為空白對(duì)照。

酶活力單位定義：在上述條件下每分鐘產(chǎn)生相當(dāng)于1 μg N-乙酰氨基葡萄糖所需的酶量，定義為一個(gè)酶活力單位(U)。

1.2.3 菌株的鑒定

1.2.3.1 菌株的形態(tài)學(xué)研究

菌株純化后接種膠體幾丁質(zhì)篩選培養(yǎng)基，30 ℃恒溫培養(yǎng)3 d后觀察菌落形態(tài)；革蘭氏染色后于普通光學(xué)顯微鏡下觀察菌體形態(tài)；掃描電鏡下觀察菌體形態(tài)。

1.2.3.2 16S rDNA序列分析

細(xì)菌總DNA的提取使用試劑盒法。PCR擴(kuò)增采用16S rDNA通用引物：27 F和1495 R。反應(yīng)體系(50 μL)為：10×Buffer：5 μL；dNTPs：4 μL；27F：1 μL；1492R：1 μL；Taq酶：0.5 μL；DNA模板：2 μL；蒸餾水：36.5 μL。擴(kuò)增程序：預(yù)變性94 ℃ 5 min；變性94 ℃ 30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min；30個(gè)循環(huán)；72 ℃維持10 min。PCR產(chǎn)物由北京奧科生物公司進(jìn)行測序，將所得序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫并進(jìn)行BLAST分析比對(duì)。

1.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化菌株的產(chǎn)酶條件

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù) Box-Benhken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用響應(yīng)面法在3因素3水平上對(duì)菌株的產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)因子和水平見表1。

表1 試驗(yàn)因素和水平編碼值

注：A，培養(yǎng)時(shí)間；B，培養(yǎng)溫度；C，膠體幾丁質(zhì)含量.下表同.

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選與鑒定

用膠體幾丁質(zhì)為唯一碳源的篩選培養(yǎng)基和透明圈法篩選出產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的11個(gè)菌株，純化后測定這些菌株的產(chǎn)酶活力，結(jié)合其透明圈直徑與菌株直徑的比值大小，選取一株比值為2.89、幾丁質(zhì)酶活力7.5 U/mL的菌株WY作為試驗(yàn)菌株。

試驗(yàn)菌株WY在30 ℃膠體幾丁質(zhì)固體篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)1 d后呈乳白色凸起的圓形菌落，光滑，濕潤，培養(yǎng)3 d后出現(xiàn)透明圈，菌株和透明圈不斷擴(kuò)大。

光學(xué)顯微鏡觀察，試驗(yàn)菌株WY革蘭氏染色陽性；掃描電鏡觀察，菌株呈短桿狀，大小(0.4～0.8) μm×(1.5～2.5) μm；表面粗糙，呈單個(gè)或不規(guī)則群狀出現(xiàn)。

試劑盒提取菌株WY的DNA，16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖電泳圖譜見圖2。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，將所得序列輸入GenBank中，相似性較高的16S rDNA序列均來自芽孢桿菌屬，同已知的蜂房芽孢桿菌(Paenibacillusalvei)DSM29 16S rDNA序列相似性超過99%。利用MEGA軟件，以鄰接法繪制16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。結(jié)合以上菌株WY的菌落形態(tài)、亞顯微形態(tài)特征和16S rDNA序列分析，確定篩選到的菌株WY為蜂房芽孢桿菌。

圖1 掃描電鏡照片(×9000倍)

2.2 菌株的產(chǎn)酶條件優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面法的結(jié)果與分析

以培養(yǎng)時(shí)間(A)、培養(yǎng)溫度(B)、膠體幾丁質(zhì)含量(C)為自變量，以幾丁質(zhì)酶活力(Y)為響應(yīng)值，試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

運(yùn)用 Design expert 7.0軟件對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行整理和數(shù)據(jù)分析，二次回歸模型進(jìn)行擬合，回歸分析結(jié)果見表3、表4。

圖2 菌株WY的16SrDNA電泳圖譜

圖3 基于16S rDNA序列同源性的菌株WY的系統(tǒng)發(fā)育樹

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果

表3 二次響應(yīng)面回歸模型的方差分析

回歸模型的方差分析顯示(表3)，P<0.05，即表示該項(xiàng)指標(biāo)顯著，模型的P=0.0001，說明該模型顯著; 一次項(xiàng)中培養(yǎng)溫度、膠體幾丁質(zhì)含量的P值分別為0.0332和0.0165，說明培養(yǎng)溫度、膠體幾丁質(zhì)含量對(duì)響應(yīng)值的影響顯著；二次項(xiàng)A2、B2、C2的P值分別為<0.0001、<0.0001、0.0002，均小于0.05，說明所選3個(gè)因素的二次項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值影響顯著。F值越大，P值越小，說明該系數(shù)越重要。由此可見，在所選的各因素中，對(duì)幾丁質(zhì)酶活力的影響依次為培養(yǎng)時(shí)間>培養(yǎng)溫度>膠體幾丁質(zhì)含量。

表4 回歸模型的可信度分析

回歸模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)為0.9915，校正相關(guān)系數(shù)為0.9762，達(dá)到了較好水平，說明模型的預(yù)測值和試驗(yàn)值擬合較好，Y的變異系數(shù)較低，說明試驗(yàn)的可靠性較高。信號(hào)與噪音的比率較大，說明這個(gè)模型能合適地反映試驗(yàn)結(jié)果(表4)。因此，可以利用該回歸模型確定最佳產(chǎn)酶條件。最終擬合得到的二次回歸方程為：

Y=12.90+0.19A+0.39B+0.47C+0.03AB-0.055AC+0.11BC-3.66A2-2.61B2-2.00C2

響應(yīng)面回歸分析和回歸方程擬合，繪出響應(yīng)面分析圖，見圖4～6。

由圖4可見，隨著培養(yǎng)時(shí)間和膠體幾丁質(zhì)含量的提高，產(chǎn)酶活力也在增大，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間和膠體幾丁質(zhì)含量升高到一定程度時(shí)，產(chǎn)酶活力達(dá)到最大，培養(yǎng)時(shí)間和膠體幾丁質(zhì)含量繼續(xù)升高時(shí)，產(chǎn)酶活力又會(huì)隨之下降，說明它們?nèi)∧硞€(gè)適中值時(shí)，可使產(chǎn)酶活力達(dá)到最大。同理，圖5和圖6也存在類似的規(guī)律。

通過軟件優(yōu)化、模擬得最佳產(chǎn)酶條件為:培養(yǎng)時(shí)間為3.03 d、培養(yǎng)溫度為40.77 ℃、膠體幾丁質(zhì)含量為1.62%，預(yù)測酶活力為12.95 U/mL。經(jīng)3次驗(yàn)證試驗(yàn)，實(shí)際酶活力為12.99 U/mL。

考慮到操作的便利，將產(chǎn)酶條件修改為：培養(yǎng)時(shí)間為3 d、培養(yǎng)溫度為40 ℃、膠體幾丁質(zhì)含量為1.62 %，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證，酶活力為13.07 U/mL。驗(yàn)證試驗(yàn)和修正試驗(yàn)所得酶活力與理論值相差很小，說明利用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的產(chǎn)酶條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠，模型具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

圖4 培養(yǎng)時(shí)間與膠體幾丁質(zhì)含量對(duì)產(chǎn)酶活力的影響

圖5 培養(yǎng)時(shí)間與培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶活力的影響

圖6 培養(yǎng)溫度與膠體幾丁質(zhì)含量對(duì)產(chǎn)酶活力的影響

3 討 論

在自然界，不同類群的微生物能在多種不同的環(huán)境中生長繁殖，從環(huán)境中吸收營養(yǎng)，并將廢物排出，對(duì)于環(huán)境的變化還能做出很好的適應(yīng)。薛永常等[17]從大連海域海泥中篩選出1株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶海洋細(xì)菌，經(jīng)鑒定為芽孢桿菌屬細(xì)菌；王曉輝等[18-19]從大連渤海灣的底泥樣品中分離到1株高產(chǎn)低溫幾丁質(zhì)酶的海洋細(xì)菌，鑒定為交替假單胞菌(Pseudoalteromonas)，并進(jìn)行了產(chǎn)酶條件的優(yōu)化。

一些學(xué)者同時(shí)研究了幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌株的生防作用。從草坪土壤中篩選出產(chǎn)幾丁酶的放線菌，經(jīng)過鑒定，確定為皺孢鏈霉菌(Streptomycesscabrisporus)，對(duì)4種草坪草根腐病菌的抑制作用進(jìn)行了探討[20]；徐大可等[21]從篤斯越橘的根部獲得1株對(duì)12種受試病原真菌都具有拮抗活性的內(nèi)生細(xì)菌DUT菌株，該菌株對(duì)菜豆炭疽病病原真菌(Colletotrichumlindemuthianum)抑菌率達(dá)70.5%，對(duì)2種越橘葉斑病病原菌擬盤多毛孢菌(Pestalotiopsissp.)和柯氏帚梗柱孢霉(Cylindrocladiumcolhounii)的抑制率分別達(dá)68.6%和57.7%。通過對(duì)其形態(tài)特征觀察、生理生化特性鑒定及16S rDNA序列同源性分析，鑒定該細(xì)菌為粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)，對(duì)DUT菌培養(yǎng)特性研究結(jié)果表明，該菌培養(yǎng)8 h可達(dá)對(duì)數(shù)生長期，最適生長pH值為7.5，最適生長溫度為28～30 ℃，利用雙抗生素標(biāo)記的DUT菌株回接越橘，該菌株可在越橘體內(nèi)定殖，DUT菌能夠產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶，發(fā)酵36 h后粗酶液的酶活力可達(dá)20.11 U/mL。鄭志成等[22]從廈門地區(qū)牡蠣養(yǎng)殖場灘涂分離篩選到1株產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶的蜂房芽孢桿菌B-91，并研究了幾丁質(zhì)酶的產(chǎn)酶條件。以蜂房芽孢桿菌B-91為主要成分，開發(fā)了錨頭鳋(Lernaea)橈足類特效殺蟲劑，對(duì)魚體寄生的中華鳋(Sinergasilus)、錨頭鳋、魚鲺(Argulus)、車輪蟲(Trichodina)及水體中水蛛、紅蟲等浮游動(dòng)物枝角類、橈足類具有極強(qiáng)的毒殺作用，而對(duì)池內(nèi)飼養(yǎng)的魚類貝類等特種水產(chǎn)品種無不良影響。

凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)的變態(tài)和生長發(fā)育總是伴隨幼體的不斷蛻皮和幼蝦的不斷蛻殼進(jìn)行的。蛻殼(皮)是對(duì)蝦生長發(fā)育的結(jié)果，當(dāng)機(jī)體組織生長及營養(yǎng)物質(zhì)累積到一定程度時(shí)必然要進(jìn)行蛻殼(皮)。正常情況下，每蛻殼(皮)一次，蝦體會(huì)明顯增長，對(duì)蝦一生中要蛻殼50余次。對(duì)蝦蛻下的殼除部分被對(duì)蝦攝食外，其余均沉降在池底，由微生物降解后參與池塘的物質(zhì)循環(huán)。據(jù)此，推測池塘底泥中存在著幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌株，用于降解對(duì)蝦殼質(zhì)。本研究從養(yǎng)蝦池塘的底泥中篩選幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌株，根據(jù)菌株和菌落的形態(tài)以及16S rDNA序列分析，鑒定為蜂房芽孢桿菌，并優(yōu)化了其產(chǎn)酶條件。下一步擬進(jìn)行分離菌株對(duì)小型甲殼動(dòng)物(枝角類、橈足類等)的防治效應(yīng)研究，還要進(jìn)行分離菌株對(duì)凡納濱對(duì)蝦的安全性研究，以此開發(fā)對(duì)蝦專用微生態(tài)制劑，確保對(duì)蝦養(yǎng)殖的健康持續(xù)發(fā)展。

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