張 濤，閆有利

(遼寧省淡水水產(chǎn)科學(xué)研究院，遼寧 遼陽(yáng) 111000)

目前，隨著我國(guó)淡水漁業(yè)的發(fā)展，高密度集成養(yǎng)殖成為我國(guó)淡水漁業(yè)養(yǎng)殖的主要發(fā)展趨勢(shì)，而伴隨的水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物疾病頻發(fā)，死亡率增大等突出問(wèn)題，也是水產(chǎn)工作者面臨亟需解決的問(wèn)題?，F(xiàn)在常用的廣譜抗菌類藥物由于耐藥性[1-6]，藥物殘留導(dǎo)致的環(huán)境污染等副作用嚴(yán)重影響了淡水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，所以如何尋找一條既可以提高水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物免疫能力，降低水產(chǎn)動(dòng)物發(fā)病率和死亡率，又可以降低藥物在長(zhǎng)期使用后的不良副作用的途徑勢(shì)在必行。

芽孢桿菌(Bacillus)是一種好氧微生物，不僅能夠改善水質(zhì)[7-12]，而且能在腸道中產(chǎn)生生物工程利用價(jià)值極高的脂肽類和肽類抗生素，同時(shí)能產(chǎn)生多種消化酶[13-14]，提高水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的免疫能力[15-16]，并抑制有害細(xì)菌的繁殖，促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的健康成長(zhǎng)[17]。研究表明，飼料中添加芽孢桿菌能有效改變魚(yú)蝦腸道內(nèi)的細(xì)菌種群，從而能顯著提高水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的非特異性免疫指標(biāo)和消化酶活性，促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物健康生長(zhǎng)[18-24]。

已有的試驗(yàn)表明，在草魚(yú)(Ctenopharyngodonidellus)腸道內(nèi)篩選出抑菌活性很強(qiáng)的芽孢桿菌，并以一定含量攪拌到草魚(yú)的飼料中，能提高草魚(yú)的生長(zhǎng)率，降低草魚(yú)的發(fā)病率和死亡率。而如何較好的保存由草魚(yú)腸道提取的病原拮抗性芽孢桿菌的活性和穩(wěn)定性的報(bào)道較少。由脫脂乳、海藻糖、甘油、谷氨酸4種組分組成的混合保護(hù)劑可在冷凍干燥中對(duì)日本金龜子芽孢桿菌(B.popilliae)的孢子提供最有效的支持和保護(hù),其最佳組合為10%脫脂乳，8%海藻糖，2%甘油，0.2%谷氨酸，在凍干過(guò)程中孢子的活性保持率達(dá)到90%以上[25]。筆者通過(guò)冷凍干燥方法，設(shè)計(jì)不同保護(hù)劑配方的正交試驗(yàn)，從而篩選出對(duì)草魚(yú)拮抗性芽孢桿菌保存較好的試驗(yàn)配方，為后期草魚(yú)養(yǎng)殖過(guò)程中的病害防治和制劑學(xué)研究提供一定的科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

草魚(yú)健康無(wú)病，采自于遼寧省淡水水產(chǎn)科學(xué)研究院試驗(yàn)基地。麥芽糊精、海藻糖和甘氨酸來(lái)源、性狀等見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)藥物性狀

1.2 方法

1.2.1 病原拮抗性芽孢桿菌的處理

采用80 ℃水浴法[26]從草魚(yú)腸道內(nèi)分離并純化芽孢桿菌，再通過(guò)牛津杯法[27]篩選出病原拮抗性芽孢桿菌。將實(shí)驗(yàn)室制得的病原拮抗性芽孢桿菌接種到裝有滅過(guò)菌的普通液體培養(yǎng)基的三角瓶中，并在37 ℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)48 h；培養(yǎng)后的菌懸液放入滅菌過(guò)的50 mL離心管中，并在4 ℃、6000 r/min的冷凍離心機(jī)中離心6 min后，倒出上清液，留有的沉淀既是擴(kuò)增后的菌體；在沉淀中加入滅菌生理鹽水洗滌細(xì)胞，去除上清液；再加入滅菌的15 mL的不同保護(hù)劑溶液(表2～3)，混勻后加入10 mL西林瓶中，每個(gè)西林瓶加入5 mL菌懸液，共3個(gè)平行組；放入-80 ℃冰箱24 h后，移至FD5505冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥48 h，以凍干后菌體存活率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)選病原拮抗性芽孢桿菌凍干保護(hù)劑配方，并以對(duì)照組為參照。

凍干條件：將每個(gè)裝有5 mL菌懸液的西林瓶從-80 ℃冰箱拿出后，放至FD5505冷凍干燥機(jī)中，經(jīng)過(guò)預(yù)凍后的菌懸液分別進(jìn)行冷凝干燥和解析干燥；第一步冷凝干燥時(shí)，將冷凍干燥箱的前箱隔板溫度設(shè)置為-35 ℃，后箱冷阱溫度設(shè)置為-80 ℃，時(shí)間設(shè)置為25 h，壓力設(shè)置為10 Pa；第二步解析干燥時(shí)，將冷凍干燥箱的前箱隔板溫度設(shè)置為20 ℃，后箱冷阱溫度設(shè)置為-80 ℃，時(shí)間設(shè)置為23 h，壓力設(shè)置為10 Pa。冷凝干燥和解析干燥結(jié)束后，對(duì)每個(gè)西林瓶進(jìn)行手動(dòng)壓蓋，即制成菌體凍干品。

凍干后菌體成活率：凍干后的菌體用5 mL蒸餾水加入10 mL西林瓶中復(fù)溶，并采用平板菌落計(jì)數(shù)法[28]，分別記錄菌體凍干前后的菌體數(shù)，并通過(guò)1.3中的公式計(jì)算凍干后菌體成活率。

設(shè)置麥芽糊精、甘氨酸和海藻糖3個(gè)變量因素，采用三因素三水平(表2)，即L9(34)正交試驗(yàn)法優(yōu)選病原拮抗性芽孢桿菌凍干保護(hù)劑最佳配比含量，每組試驗(yàn)設(shè)定3個(gè)平行組。

表2 因素水平表

1.2.2 菌體穩(wěn)定性試驗(yàn)

根據(jù)上述正交試驗(yàn)測(cè)試結(jié)果，篩選出菌體成活率較高的兩組凍干保護(hù)劑配方，分別將實(shí)驗(yàn)室制得的菌體加入篩選出的凍干保護(hù)劑后(方法同1.2.1)，經(jīng)過(guò)冷凍干燥放在4 ℃冰箱中保存，在分別測(cè)試1、3、5、7、9、12個(gè)月后的菌體成活率，每組3個(gè)平行(表5～6)。菌體成活率測(cè)試方法與1.2.1相同。

1.3 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)和分析

記錄凍干后菌體成活率，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 15.0在α=0.05水平下進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)經(jīng)方差分析后進(jìn)行組間兩兩比較和顯著性檢驗(yàn)(P<0.05)，并采用層次分析法統(tǒng)計(jì)正交試驗(yàn)結(jié)果[29]。

式中，S為菌體成活率，S1為菌體凍干前菌群數(shù)量(cfu/mL)，S2為菌體凍干后菌群數(shù)量(cfu/mL)。

2 結(jié)果與分析

以凍干后菌體存活率為考察指標(biāo)時(shí)，極差R值大小顯示各因素對(duì)菌體存活率作用影響為A>B>C(表3)。其中，B、C因素R值<空列組R值，說(shuō)明A因素對(duì)凍干后菌體存活率作用最重要；其中，A1B3C3的凍干保護(hù)劑配方對(duì)菌體存活率高達(dá)(93.30±2.21)%，高于A1B1C1和A2B1C2的凍干保護(hù)劑配方對(duì)菌體存活率，但不顯著(P>0.05)，顯著高于其他凍干保護(hù)劑配方對(duì)菌體的存活率(P<0.05)。

表3 菌體凍干保存試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

注：同列中標(biāo)有不同字母的平均值之間有顯著性差異(P<0.05).

方差分析表明各因素?zé)o顯著差異(P>0.05)(表4)。從正交試驗(yàn)(表3)和方差分析(表4)綜合結(jié)果可知，以凍干后菌體存活率為考察指標(biāo)時(shí)，菌體凍干保護(hù)劑最佳配方為A1B1C3。由正交試驗(yàn)(表3)和方差分析(表4)綜合結(jié)果中，篩選出2種凍干保護(hù)劑配方(表5)。

表4 菌體凍干后成活率方差分析結(jié)果

表5 菌體凍干保存劑的篩選配方

在經(jīng)過(guò)12個(gè)月的穩(wěn)定性試驗(yàn)(表6)可知，A1B1C3的凍干保護(hù)劑配方對(duì)菌體存活率高于A1B3C3的凍干保護(hù)劑配方對(duì)菌體存活率，但不顯著(P>0.05)。

綜合上述正交試驗(yàn)和穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果分析，A1B1C3的凍干保護(hù)劑配方可以有效的保護(hù)菌體的成活；在經(jīng)過(guò)12個(gè)月后，仍然可以使菌體達(dá)到80%以上的存活率，基本達(dá)到了益生菌經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期保存而不失活的目的。

表6 菌體凍干后穩(wěn)定性試驗(yàn)

注：同列中標(biāo)有不同字母的平均值之間有顯著性差異(P<0.05).

3 討 論

目前，我國(guó)關(guān)于芽孢桿菌在淡水漁業(yè)養(yǎng)殖上的應(yīng)用報(bào)道較多[30-33]。這些報(bào)道表明，芽孢桿菌不僅具有改善水質(zhì)的能力，而且能夠有效改變水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的腸道細(xì)菌種群，抑制有害細(xì)菌的產(chǎn)生，從而提高了水生動(dòng)物的防病能力；而如何能在水產(chǎn)養(yǎng)殖應(yīng)用過(guò)程中保存其生物活性和穩(wěn)定性是芽孢桿菌提取和保存工藝的重要一環(huán)。

本試驗(yàn)采用冷凍干燥的方法保存病原拮抗性芽孢桿菌，與其他方法比較，主要有以下幾方面優(yōu)勢(shì)：(1)芽孢桿菌屬于原核細(xì)胞型微生物，對(duì)溫度比較敏感，在高溫條件下易繁殖、老化和死亡；而在低溫干燥條件下，芽孢桿菌其生物活性損失較少。(2)芽孢桿菌屬于好氧微生物，在真空干燥條件下，環(huán)境的氧氣極少，芽孢桿菌處于休眠狀態(tài)，不易繁殖，其生物活性可以得到有效保護(hù)。(3)冷凍干燥法可以去除菌懸液95%～99%的水分，并保持芽孢桿菌生物活性的穩(wěn)定性，從而便于其運(yùn)輸和長(zhǎng)期保存。

微生物凍干燥過(guò)程中賦形劑的選擇是決定冷凍干燥能否成功的關(guān)鍵因素。目前，根據(jù)化學(xué)性質(zhì)，微生物凍干賦形劑有單糖(葡頭糖、半乳糖等)、二糖(乳糖、海藻糖等)和多糖類(糊精、淀粉等)，多元醇類保護(hù)劑(甘油、甘露醇等)、氨基酸類保護(hù)劑(甘氨酸、色氨酸等)、蛋白質(zhì)和多肽類保護(hù)劑(生長(zhǎng)因子、激素等)以及聚合物類保護(hù)劑(牛血清白蛋白、麥芽糊精等)[34]。

為防止凍干過(guò)程中芽孢桿菌生物活性的損失，本試驗(yàn)選取了海藻糖、麥芽糊精和甘氨酸作為芽孢桿菌的凍干賦形劑，其主要依據(jù)以下幾方面因素[35]：(1)與單糖、多糖和還原性二糖比較，海藻糖屬于非還原二糖，不存在與凍干品發(fā)生還原性Mailard反應(yīng)；同時(shí)，海藻糖作為二糖能在凍結(jié)過(guò)程中更好的起到低溫保護(hù)劑的作用，并在干燥脫水過(guò)程中起到脫水保護(hù)劑的作用。(2)與多元醇類、多肽類及其他聚合物賦形劑比較，麥芽糊精作為一種聚合物賦形劑成本較低，在冷凍干燥過(guò)程中，其優(yōu)先析出，具有一定的表面活性，并在細(xì)菌分子之間產(chǎn)生“位阻”作用，從而減少芽孢桿菌的生物活性損失；同時(shí)，麥芽糊精能更好的提高菌懸液水溶液黏度，提高玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，抑制小分子賦形劑海藻糖的結(jié)晶和pH值的降低；在微生物冷凍干燥過(guò)程中，麥芽糊精在凍結(jié)過(guò)程和脫水過(guò)程中都能提供更好的有效保護(hù)作用。(3)筆者在前期試驗(yàn)篩選氨基酸類凍干賦形劑發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌在快速凍結(jié)過(guò)程中，甘氨酸作為氨基酸類凍干賦形劑，能夠更有效的抑制菌懸液的pH值變化，減少了芽孢桿菌生物活性的損失。(4)聚合物凍干保護(hù)劑一般不單獨(dú)使用，當(dāng)麥芽糊精作為一種聚合物保護(hù)劑與糖類或氨基酸類物質(zhì)聯(lián)合使用時(shí)，可以與蛋白質(zhì)物質(zhì)形成很強(qiáng)的氫鍵作用，更好的保證了凍干微生物的穩(wěn)定性。

綜合上述試驗(yàn)結(jié)果和幾方面因素分析，芽孢桿菌的生物活性總體趨勢(shì)與時(shí)間有一定關(guān)系，時(shí)間越長(zhǎng)，生物活性越低，說(shuō)明這3種賦形劑對(duì)微生物細(xì)菌凍干粉活性影響隨著時(shí)間的增長(zhǎng)會(huì)逐漸降低，從而影響到芽孢桿菌生物活性穩(wěn)定性。3種賦形劑對(duì)芽孢桿菌生物活性影響依次為麥芽糊精>甘氨酸>海藻糖，各賦形劑差異雖不顯著(P>0.05)，但海藻糖、甘氨酸并不是起主要作用的賦形劑，這說(shuō)明聚合物類的賦形劑保護(hù)功能強(qiáng)于低聚糖及氨基酸類賦形劑。上述3種賦形劑的正交試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)以凍干后菌體成活率為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)，3種賦形劑最佳配方為A1B1C3。

通過(guò)試驗(yàn)篩選出的病原拮抗性芽孢桿菌保存配方A1B1C3，即2%麥芽糊精，0.5%甘氨酸，6%海藻糖，經(jīng)過(guò)12個(gè)月保存后，其生物活性仍然超過(guò)80%，為后期草魚(yú)養(yǎng)殖過(guò)程中的病害防治，減少魚(yú)體發(fā)病和死亡率起到了保駕護(hù)航的作用。

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