申光茂，李恒，梁金輝，何林?

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朱砂葉螨的體外表達(dá)及其功能

申光茂，李恒，梁金輝，何林?

（西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，重慶 400715）

【目的】朱砂葉螨（）是一種重要的農(nóng)業(yè)害螨，長期化學(xué)防治導(dǎo)致其對多種藥劑產(chǎn)生了抗性，因此明確該螨對化學(xué)藥劑的解毒代謝機(jī)制對開展有效的抗性治理具有重要意義。谷胱甘肽-轉(zhuǎn)移酶（GST）是節(jié)肢動物主要的解毒代謝酶之一，筆者前期研究中篩選出了朱砂葉螨體內(nèi)高表達(dá)的一條GST基因，該基因的表達(dá)在藥劑處理下具有明顯的可誘導(dǎo)性。因此，本研究以為研究對象，進(jìn)一步利用異源表達(dá)技術(shù)分析TcGSTM7重組蛋白和甲氰菊酯、丁氟螨酯的互作效應(yīng)，以及利用RNAi沉默該基因的表達(dá)后，檢測朱砂葉螨對這兩種藥劑的敏感性變化，為明確在藥劑代謝中的功能打下基礎(chǔ)?！痉椒ā坷肗CBI數(shù)據(jù)庫對編碼蛋白的序列特征進(jìn)行注釋，并在SWISS MODEL構(gòu)建的蛋白三維結(jié)構(gòu)中對相關(guān)結(jié)構(gòu)域、結(jié)合位點以及活性中心等進(jìn)行展示。利用異源表達(dá)系統(tǒng)在大腸桿菌（）中表達(dá)TcGSTM7重組蛋白，對重組蛋白進(jìn)行分離純化后使用特異性底物檢測其GST催化活性，并通過檢測殺螨劑對該蛋白活性的抑制效果分析其與甲氰菊酯和丁氟螨酯的互作效應(yīng)。在此基礎(chǔ)上，為明確基因表達(dá)水平對朱砂葉螨藥劑敏感性的影響，參照該基因的序列設(shè)計并合成特異dsRNA，利用葉碟飼喂法將其導(dǎo)入朱砂葉螨體內(nèi)，經(jīng)qPCR檢測表達(dá)水平顯著下調(diào)后，進(jìn)行生物測定分析基因沉默后朱砂葉螨對不同劑量甲氰菊酯和丁氟螨酯藥劑敏感性的變化?！窘Y(jié)果】TcGSTM7的氨基酸序列分析結(jié)果表明，其N端具有一個Mu家族GST特有的“thioredoxin-like”結(jié)構(gòu)域，以及一個GSH的結(jié)合位點(G-site)，在C端則具有催化底物結(jié)合域(H-site)。該蛋白具有9個螺旋和4個折疊結(jié)構(gòu)，呈經(jīng)典的“”排列方式。在三維結(jié)構(gòu)預(yù)測的基礎(chǔ)上，通過原核表達(dá)技術(shù)獲得了TcGSTM7重組蛋白，該重組蛋白分子量為26 kD，與預(yù)測結(jié)果一致，并且具有GST蛋白的催化活性。TcGSTM7重組蛋白酶活性為673.26 nmol·min-1·mg-1，其動力學(xué)常數(shù)m為0.71 mmol·L-1，max為109.54 nmol·min-1·mg-1。藥劑抑制試驗結(jié)果表明甲氰菊酯和丁氟螨酯均可抑制TcGSTM7重組蛋白的酶活性，IC50分別為0.038和0.2 mmol·L-1。進(jìn)一步利用葉碟飼喂法讓朱砂葉螨取食dsRNA，對的表達(dá)進(jìn)行了干擾，qPCR檢測表明取食48 h后，dsRNA對的干擾效率達(dá)到52.88%。藥劑敏感性測定結(jié)果顯示，沉默的表達(dá)后，朱砂葉螨對LC30和LC50的甲氰菊酯敏感性分別上升了9.0%和12.3%，對LC30和LC50的丁氟螨酯敏感性分別上升了12.9%和11.0%，且均達(dá)到顯著水平（＜0.05）?！窘Y(jié)論】的表達(dá)可以影響朱砂葉螨對甲氰菊酯和丁氟螨酯的敏感性，且其重組蛋白和這兩種藥劑存在互作效應(yīng)，表明可能在朱砂葉螨對甲氰菊酯和丁氟螨酯的代謝過程中具有重要作用。

朱砂葉螨；谷胱甘肽-轉(zhuǎn)移酶；RNAi；解毒代謝

0 引言

【研究意義】朱砂葉螨（）是一種可危害多種農(nóng)作物的多食性害螨[1]。由于朱砂葉螨的防治主要依賴化學(xué)藥劑，且該螨具有繁殖快、世代周期短、可孤雌生殖等特點，導(dǎo)致其抗性問題尤為突出[2]?？剐詸C(jī)制研究是開展有效的抗性治理的基礎(chǔ)，近年來關(guān)于螨類抗性的研究在靶標(biāo)、代謝機(jī)制等方面都取得了較為顯著的進(jìn)展，篩選出多種與抗性相關(guān)的靶標(biāo)和代謝酶基因，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步開展相關(guān)基因的功能驗證是當(dāng)前螨類抗性研究的一大熱點[3]。以此前篩選出的一條朱砂葉螨谷胱甘肽-轉(zhuǎn)移酶（GST）基因為對象，通過原核表達(dá)和RNAi等技術(shù)在蛋白、分子水平驗證其與藥劑敏感性的關(guān)系，對進(jìn)一步明確該螨的解毒代謝機(jī)制，開展有效的抗性治理具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】GST是生物體內(nèi)重要的代謝酶之一。諸多研究均表明GST廣泛參與了昆蟲對氧化脅迫的響應(yīng)過程，以及對植物次生毒素、殺蟲劑的解毒代謝過程[4]。GST主要參與II相代謝，可催化親水基團(tuán)和外源有毒物質(zhì)的結(jié)合，提高其可溶性，進(jìn)而促使其排出體外，起到降低對有機(jī)體毒性的作用[5]。筆者研究團(tuán)隊針對朱砂葉螨的抗性機(jī)制開展了大量的工作，通過一系列研究表明GST可能介導(dǎo)了該螨對多種殺螨劑的抗藥性，如通過增效劑實驗證明抑制GST活性可導(dǎo)致朱砂葉螨對甲氰菊酯和丁氟螨酯的敏感性提高，并且在相應(yīng)抗性品系中也檢測到GST酶活性較敏感品系有顯著提高，表明GST酶活性與朱砂葉螨對這兩種藥劑的敏感性密切相關(guān)[6-7]。在此基礎(chǔ)上借助二斑葉螨基因組注釋了朱砂葉螨轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，得到了大量編碼GST的基因信息[8]。通過克隆獲得了Dleta和Mu家族兩個GST基因家族的14個基因，利用qPCR技術(shù)檢測了這些基因在不同螨態(tài)的表達(dá)模式，并發(fā)現(xiàn)多個基因的表達(dá)在藥劑脅迫下具有可誘導(dǎo)性，其中的表達(dá)豐度最高，表明該基因可能廣泛參與了朱砂葉螨生長發(fā)育中的生物過程，并且可能與該螨對藥劑脅迫的抵御過程有關(guān)[9]?！颈狙芯壳腥朦c】害螨在受到藥劑脅迫時，可通過提高相應(yīng)解毒代謝酶基因的表達(dá)來增強(qiáng)對外源毒素的代謝能力，這是一種重要的抗性機(jī)制。在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過RNAi以及異源表達(dá)技術(shù)驗證該基因的功能?！緮M解決的關(guān)鍵問題】利用異源表達(dá)技術(shù)獲得TcGSTM7的重組蛋白，檢測其與藥劑的互作效應(yīng)。通過RNAi有效沉默目的基因表達(dá)，分析其對朱砂葉螨藥劑敏感性的影響。

1 材料與方法

試驗于2015—2016年在西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院農(nóng)藥毒理與科學(xué)應(yīng)用實驗室完成。

1.1 試驗材料

供試朱砂葉螨最初采自重慶市北碚區(qū)田間，至今飼養(yǎng)已超過15年。將朱砂葉螨置于室內(nèi)光照恒溫培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為溫度（26±1）℃；相對濕度55%—70%；14 h光照/10 h黑暗的人工溫室中。寄主植物為新鮮盆栽豇豆苗。

1.2 試驗方法

1.2.1 TcGSTM7蛋白結(jié)構(gòu)分析 通過Blast在NCBI數(shù)據(jù)庫注釋TcGSTM7（GenBank登錄號：KM076640）蛋白的功能結(jié)構(gòu)域，利用SWISS MODEL構(gòu)建該蛋白的三維結(jié)構(gòu)，并使用PyMOL軟件對蛋白的功能區(qū)進(jìn)行標(biāo)注。

1.2.2 TcGSTM7原核表達(dá) 通過帶酶切位點的引物PCR擴(kuò)增全長序列，引物信息見表1。利用雙酶切將該基因連接到pColdII質(zhì)粒（Takara）上，進(jìn)行序列驗證后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21（DE3）的感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)。涂布于含卡納霉素（50 μg·mL-1）的LB平板中，于37℃培養(yǎng)過夜。次日，挑單菌落培養(yǎng)，當(dāng)OD550接近0.6時，加入IPTG至終濃度1 mmol·L-1，15℃培養(yǎng)24 h，收菌。

表1 dsRNA合成、qPCR以及異源表達(dá)相關(guān)引物信息

下劃線所示為T7 promoter序列和酶切位點 Underline indicates T7 promoter and restriction enzyme site

1.2.3 重組蛋白純化及酶活性檢測 取適量的菌液在PBS緩沖體系下進(jìn)行超聲破碎，上清液直接上Ni柱進(jìn)行純化。純化后的蛋白參照Wang等[7]的方法檢測GST酶活性。重組蛋白與藥劑的互作效應(yīng)參照Shi等[10]的方法進(jìn)行檢測。

1.2.4特異dsRNA的合成 嚴(yán)格按照說明書步驟，使用Trizol（Invitrogen）提取朱砂葉螨總RNA，對得到的RNA進(jìn)行瓊脂糖電泳，檢測其完整性。選取OD260/280和OD260/230在1.8—2.2的RNA進(jìn)行后續(xù)試驗。使用PrimeScriptTMRT reagent Kit（Takara）合成第一鏈cDNA，操作按相應(yīng)說明書進(jìn)行。以cDNA為模板，通過PCR擴(kuò)增特異片段（引物信息見表1），并利用TranscriptAid T7 High Yield Transcription Kit（ThermoFisher）合成dsRNA。

1.2.5 飼喂dsRNA 將豇豆葉片剪成2.5 cm×2.5 cm大小的葉碟，然后置于60℃的烤箱烘烤1 min。將10—15 μl dsRNA溶液（約20 μg）滴在經(jīng)去RNA酶處理的培養(yǎng)皿內(nèi)，然后把烘烤后的葉片正面朝下覆蓋在液滴上，使葉面充分接觸試劑，室溫放置5 h使葉片充分吸收dsRNA溶液。以綠色熒光蛋白（GFP）和RNAse-free water作為對照，重復(fù)3次。用毛筆將3日齡健康活潑的雌成螨輕輕挑到處理好的葉片上，每個葉片接30—50頭螨，飼養(yǎng)48 h后進(jìn)行后續(xù)檢測。

1.2.6 qPCR檢測 提取經(jīng)dsRNA處理后的朱砂葉螨總RNA，并經(jīng)DNA酶（Promega）處理后反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為qPCR模板。qPCR反應(yīng)體系和條件參照GoTaq?qPCR Master Mix（Promega）試劑盒說明書，使用Mx3000PTM實時定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)?；虮磉_(dá)量的計算參考Schmittgen等[11]的方法進(jìn)行分析。引物信息見表1。

1.2.7 生物測定 生物測定參考Feng等[12]的藥膜法。具體步驟如下：參照之前的生物測定結(jié)果，將殺螨劑原藥用少量丙酮溶解后加清水稀釋成LC30和LC50的濃度[6-7]。吸取1.2 mL藥液加入到1.5 mL的離心管中，輕輕轉(zhuǎn)動離心管，使藥劑在管內(nèi)壁形成一層均勻的藥膜，然后倒掉多余的藥液，放置通風(fēng)櫥內(nèi)抽風(fēng)至液體完全揮發(fā)，每個濃度處理設(shè)3個重復(fù)。對照單獨用同劑量的丙酮加清水處理離心管，方法相同。每個藥膜管放置30頭健康一致的雌成螨，在室內(nèi)正常飼養(yǎng)條件下放置24 h后檢查死亡率。死亡標(biāo)準(zhǔn)為用毛筆尖輕觸螨體，螨體無反應(yīng)或只有足輕微抽搐即視為死亡。對照死亡率＜10%則為有效測定，用對照死亡率對結(jié)果進(jìn)行校正，計算方法：校正死亡率={(處理組死亡率-對照組死亡率)/(1-對照組死亡率)}×100%。

2 結(jié)果

2.1 TcGSTM7蛋白結(jié)構(gòu)分析

在對TcGSTM7進(jìn)行原核表達(dá)之前，首先對其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測和3D建模。與數(shù)據(jù)庫比對的結(jié)果顯示，TcGSTM7蛋白的N端具有一個“thioredoxin-like”結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域的序列特征與數(shù)據(jù)庫中Mu家族GST蛋白一致。此外，在N端還存在GSH的結(jié)合位點（G-site）。在該蛋白的C端則具有催化底物結(jié)合域（H-site）。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示其具有9個螺旋和4個折疊結(jié)構(gòu)，并且呈經(jīng)典的“”排列方式。其中4個折疊均位于N端，而螺旋中，第1、2個也位于N端，4—9個位于C端，第3個螺旋位于N端和C端之間。GST Mu家族蛋白的特征區(qū)域以及活性中心均如圖1所示。

2.2 表達(dá)TcGSTM7重組蛋白

利用雙酶切技術(shù)將目的基因與pCold II載體連接形成重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入大腸桿菌進(jìn)誘導(dǎo)表達(dá)后，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，在上清液和沉淀中均發(fā)現(xiàn)在26 kD的位置出現(xiàn)了特異性條帶，該條帶位置與預(yù)測的目的蛋白一致（圖2-A）。使用鎳柱對上清液中的蛋白進(jìn)行純化，電泳檢測顯示洗脫液中含有純度較高的重組蛋白，而流穿液中沒有出現(xiàn)蛋白條帶（圖2-B），表明純化效果較好。

2.3 重組蛋白酶酶活性檢測以及藥劑抑制效果

以CDNB和GSH為底物測定了TcGSTM7重組蛋白的酶活性。結(jié)果顯示，TcGSTM7重組蛋白具有典型的GST催化活性，其酶活性為673.26 nmol·min-1·mg-1，其動力學(xué)常數(shù)m為0.71 mmol·L-1，max為109.54 nmol·min-1·mg-1。與此前筆者實驗室測定的數(shù)據(jù)相比，重組蛋白的酶活性是粗酶活性的10余倍[6-7]。酶活性抑制試驗結(jié)果表明，甲氰菊酯和丁氟螨酯均可有效抑制TcGSTM7重組蛋白的催化活性，IC50分別為0.038和0.2 mmol·L-1（表2）。

表2 TcGSTM7重組蛋白酶活性以及藥劑抑制效果

2.4 沉默TcGSTM7表達(dá)后對朱砂葉螨藥劑敏感性的影響

朱砂葉螨在經(jīng)dsRNA處理后的葉片上飼喂48 h后，qPCR檢測顯示，其體內(nèi)的表達(dá)量顯著下調(diào)，沉默效率達(dá)到52.88%，并且清水與GFP處理組之間的表達(dá)沒有顯著性差異，表明通過飼喂法可有效沉默靶基因的表達(dá)（圖3）。在明確了表達(dá)量下調(diào)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過生物測定檢測了朱砂葉螨對甲氰菊酯和丁氟螨酯敏感性的變化。結(jié)果表明，經(jīng)dsRNA處理后，朱砂葉螨對LC30和LC50的甲氰菊酯敏感性分別上升了9.0%和12.3%，對LC30和LC50的丁氟螨酯敏感性分別上升了12.9%和11.0%，且均達(dá)到顯著水平（＜0.05），而GFP處理組和對照組之間無顯著性差異（圖4），表明的表達(dá)與朱砂葉螨對這兩種藥劑的敏感性密切相關(guān)。

3 討論

GST是生物體中一種重要的多功能催化酶，這類酶由多個家族的基因編碼，廣泛參與了哺乳動物、昆蟲以及蜱螨對外源有毒物質(zhì)的代謝過程[13]。研究表明昆蟲對主流殺蟲劑的抗藥劑均與GST的酶活性變化有關(guān)[14]。螨類的抗性問題在節(jié)肢動物中尤為突出，但是與昆蟲相比，其GST介導(dǎo)的抗性機(jī)制的相關(guān)研究還相對滯后。筆者實驗室前期在蛋白水平研究證明利用專一性抑制劑抑制朱砂葉螨GST酶活性后可增強(qiáng)其對甲氰菊酯和丁氟螨酯的敏感性。同時基于朱砂葉螨的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對其GST基因進(jìn)行了注釋，通過qPCR檢測發(fā)現(xiàn)在多個螨態(tài)均具有較高的表達(dá)豐度，表明此基因可能參與了朱砂葉螨的多種生命活動，此外，的表達(dá)還具有明顯的藥劑誘導(dǎo)性，因此將其作為本研究的目的基因[6-7,9]。

研究顯示昆蟲中與藥劑敏感性有關(guān)的GST大多屬于Delta和Epsilon家族，重組蛋白功能分析也證實它們與藥劑存在互作效應(yīng)[15-16]。而螨類的GST與昆蟲存在較大差異，沒有昆蟲中重要的Epsilon家族的GST，但是有在哺乳動物中存在的Mu家族GST，且Mu家族GST與螨類的藥劑敏感性有密切關(guān)系。在二斑葉螨的研究中就發(fā)現(xiàn)重組蛋白的酶活性遠(yuǎn)高于其他Delta家族的GST，抑制試驗結(jié)果也表明該蛋白與噻螨酮、噠螨靈、四螨嗪等藥劑存在互作效應(yīng)[17]，而Delta家族的則被證實可以直接代謝丁氟螨酯[18]。筆者在解析了朱砂葉螨TcGSTM7蛋白結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，利用原核表達(dá)分離純化了其重組蛋白，酶活性檢測表明該蛋白具有GST的催化活性，并且其酶活性是此前研究中檢測到的GST總蛋白粗酶活性的10倍左右，說明TcGSTM7重組蛋白的純度和活性均較高。將TcGSTM7重組蛋白與甲氰菊酯和丁氟螨酯反應(yīng)后，其酶活性出現(xiàn)了顯著降低，表明它與這兩種藥劑存在結(jié)合效應(yīng)，可能具有代謝外源有毒物質(zhì)的作用。

A：大腸桿菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后表達(dá)的重組蛋白條帶Expression of the recombinant protein after induction by IPTG。S1、S2：經(jīng)細(xì)胞破碎后在上清液中的蛋白條帶Content in the supernatant after cell disruption。P1、P2：沉淀中的蛋白條帶Content in the precipitate after cell disruption；B：經(jīng)過柱純化后的重組蛋白電泳圖Purified recombinant protein。E1、E2：洗脫液中的重組蛋白content in the eluant。F1、F2：流穿液電泳圖content in the liquid flow-through

*表示在P＜0.05水平下差異顯著 Significant difference at P＜0.05 level

在蛋白水平分析了TcGSTM7與甲氰菊酯和丁氟螨酯互作效應(yīng)的基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步利用RNAi在基因水平驗證了表達(dá)對朱砂葉螨藥劑敏感性的影響。結(jié)果顯示通過飼喂dsRNA可有效抑制朱砂葉螨體內(nèi)的表達(dá)。生物測定結(jié)果則證實降低的表達(dá)后，朱砂葉螨對不同劑量的甲氰菊酯和丁氟螨酯的敏感性均出現(xiàn)了顯著的提高。這在分子水平也證實了可以影響朱砂葉螨的藥劑敏感性。此外，結(jié)合RNAi和生物測定結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)雖然對表達(dá)的抑制率達(dá)到了52.88%，但對朱砂葉螨的藥劑敏感性的影響卻僅為10%左右，這個現(xiàn)象表明生物具有非常復(fù)雜的解毒代謝系統(tǒng)。目前在昆蟲和螨類中發(fā)現(xiàn)參與藥劑代謝的有GST、P450、CCE等多種解毒酶類，每一種酶均是由龐大的基因家族所構(gòu)成，這些酶在解毒代謝過程中具有協(xié)同作用。以埃及伊蚊（）為例，表達(dá)譜分析結(jié)果顯示，經(jīng)雙硫磷篩選后有大量GST、P450、CCE出現(xiàn)了過表達(dá)的現(xiàn)象[19]。Yang等[20]通過基因芯片檢測了煙粉虱（）對噻蟲嗪抗性、敏感品系間的基因表達(dá)差異，也發(fā)現(xiàn)多種解毒酶基因的表達(dá)均出現(xiàn)了上調(diào)現(xiàn)象。橘小實蠅（）的幼蟲在甲氰菊酯的脅迫下，體內(nèi)多種解毒代謝酶基因的表達(dá)都有顯著的提高[21]。類似的結(jié)果在致倦庫蚊（）、銅綠蠅（）、微小牛蜱（）等多種生物對菊酯類藥劑抗性的研究中多有發(fā)現(xiàn)，表明這種協(xié)同效應(yīng)在昆蟲的抗性機(jī)制中是普遍存在的[22-24]。朱砂葉螨對藥劑的敏感性同樣受多種解毒代謝酶的影響，陳秋雙等[25]在朱砂葉螨的生物測定過程中加入了增效劑，結(jié)果顯示P450、CCE和GST均參與了其抗藥性的形成；WEI等在基因表達(dá)水平的研究也表明CCE、P450等均參與了朱砂葉螨對丁氟螨酯和甲氰菊酯的抗藥性[26-27]。此外，Shi等[28]還發(fā)現(xiàn)沉默朱砂葉螨單個P450基因?qū)ζ浼浊杈挣ッ舾行缘挠绊懹邢?，但是同時沉默6個P450基因造成的改變則非常明顯。在二斑葉螨的研究中也發(fā)現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象，高新菊等檢測了二斑葉螨對四螨嗪和甲氰菊酯抗性品系與敏感品系之間的代謝酶活性差異，發(fā)現(xiàn)抗性品系中P450、CCE、GST、ACP以及ALP等酶的活性均顯著高于敏感品系[29-30]。這些結(jié)果與本研究的結(jié)果一致，說明單一沉默朱砂葉螨的表達(dá)雖然可改變其對甲氰菊酯和丁氟螨酯的敏感性，但僅造成10%左右的死亡率變化也證明可能不止一個GST或者不止GST一種解毒代謝酶參與了此過程。因此，如果在實際應(yīng)用中要通過沉默GST的表達(dá)來達(dá)到抗性治理的目的，采用多基因同時作為靶標(biāo)是更好的選擇。

圖4 沉默TcGSTM7對甲氰菊酯和丁氟螨酯敏感性的變化

4 結(jié)論

的表達(dá)可影響朱砂葉螨對甲氰菊酯和丁氟螨酯的藥劑敏感性，并且其重組蛋白與這兩種藥劑存在互作效應(yīng)，證明該基因可能參與了朱砂葉螨對甲氰菊酯和丁氟螨酯的代謝過程。

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（責(zé)任編輯 岳梅）

expression ofofand its function

SHEN GuangMao, LI Heng, LIANG JinHui, HE Lin

(College of Plant Protection, Southwest University, Chongqing 400715)

【Objective】is an important pest mite in agriculture. Resistance of this pest mite to various pesticides has developed quickly because of long-term chemical control, thus, it is of great significance to clarify the detoxification mechanism ofin order to carry out effective resistance management. Glutathione-transferase (GST) is one of the major detoxification enzymes in Arthropods. In previous research, a highly expressed GST genefromwas identified, and the expression of this gene is inducible by pesticide. In this case, the objective of this study is to construct the recombinant protein of TcGSTM7 with prokaryotic expression system, analyze interaction between recombinant protein and pesticides (fenpropathrin and cyflumetofen), and test the pesticide susceptibility change ofafter decreasing the expression ofthrough RNAi.【Method】The sequence characteristics of TcGSTM7proteinwere annotated by BLAST in NCBI database. The structural domain, binding site, and active site were presented in a three-dimensional structure model, which was predicted by SWISS MODEL. TcGSTM7 was expressed by prokaryotic expression in. GST activity of recombinant protein was tested with specific substrate, and its interaction with fenpropathrin and cyflumetofen was analyzed through activity inhibition test. Then, specific dsRNA was synthetized according to the sequence information of.was feed on the dsRNA through leaf disc method. Gene expression change ofwas detected by qPCR, then, susceptibility change ofto fenpropathrin and cyflumetofen was analyzed by bioassay. 【Result】Amino acid sequence analysis ofTcGSTM7 showed that the N-terminal domain contained a thioredoxin-like domain, which is a specific feature of Mu class GST. In addition, GSH binding site (G-site) was also located in the N-terminal domain. The C-terminal domain contained an alpha helical domain, and the substrate binding pocket (H-site) was included. This protein consisted of nine-helices and four-strands and contained the typicalmotif of the thioredoxin fold. Based on the three-dimensional structure prediction, recombinant protein of TcGSTM7 was constructed through prokaryotic expression. Molecular weight of this protein was 26 kD, which was the same as prediction. Its GST specific activity was 673.26 nmol·min-1·mg-1, and kinetic parameters were calculated as 0.71 mmol·L-1formand 109.54 nmol·min-1·mg-1formax. Analysis of interaction between pesticides and the recombined protein showed that both fenpropathrin and cyflumetofen could inhibit the activity of TcGSTM7. IC50was 0.038 mmol·L-1for fenpropathrin, and 0.2 mmol·L-1for cyflumetofen. Then, dsRNA was feed toby leaf disc feeding method. qPCR data showed the expression ofwas significantly decreased by 52.88%, and bioassay was carried out to test susceptibility of the mites to these two pesticides. Results showed that susceptibility ofto fenpropathrin significantly increased by 9.0% and 12.3% at LC30and LC50, and to cyflumetofen, it also significantly increased by 12.9% and 11.0% at LC30and LC50(＜0.05).【Conclusion】The expression ofcould affect the susceptibility ofto fenpropathrin and cyflumetofen, and the interaction between recombinant protein of TcGSTM7 and these two pesticides was identified. These data indicate thatis important forduring its metabolism process of fenpropathrin and cyflumetofen.

; glutathione-transferase (GST); RNAi; detoxification

2017-09-12；

2017-10-19

國家自然科學(xué)基金青年基金（31401748）

申光茂，Tel：023-68251514；E-mail：blackaet@163.com。

何林，Tel：023-68251514；E-mail：helinok@vip.tom.com