李德強(qiáng)，呂聞耀

(象山縣第二人民醫(yī)院,浙江 寧波315731)

結(jié)腸癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，特別在發(fā)達(dá)國(guó)家發(fā)病率居高不下[1]。我國(guó)結(jié)腸癌的發(fā)病率也呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重影響了人們的健康。最近有文獻(xiàn)報(bào)道蛋白酶體抑制劑硼替佐米抑制結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29細(xì)胞增殖[2]。但結(jié)腸癌具有高度適應(yīng)性，在腫瘤內(nèi)相關(guān)的信號(hào)機(jī)制能激活促存活信號(hào)并抑制凋亡信號(hào)，最終導(dǎo)致耐藥[3]。因此聯(lián)合應(yīng)用不同靶點(diǎn)的藥物可能會(huì)是治療腫瘤的有效手段。

CK2屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶的一種，廣泛參與到多種細(xì)胞過(guò)程。此外，CK2在多種實(shí)體瘤中高表達(dá)[4]。大量的研究表明高表達(dá)CK2通過(guò)多種分子機(jī)制和信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)促使癌癥存活，抑制CK2能促使癌癥對(duì)靶向藥物的敏感性[5]。因此，本文想探討CK2抑制劑TBB是否能增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29對(duì)硼替佐米的敏感性，從而為臨床治療結(jié)腸癌提供有效的理論支持。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

體外培養(yǎng)的HT29細(xì)胞(人結(jié)腸癌細(xì)胞)購(gòu)買(mǎi)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，培養(yǎng)細(xì)胞所用1640培養(yǎng)液和胎牛血清購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)Hyclone 公司。硼替佐米(bortezomib)、四溴苯三唑(TBB)、MTT(四甲基偶氮唑藍(lán))均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，western blotting所需抗體Caspase-3以及兔二抗均購(gòu)買(mǎi)自Santa Cruz公司(美國(guó))。轉(zhuǎn)膜所需的PVDF 膜(0.45 μm)購(gòu)買(mǎi)自美國(guó) Millipore 公司。

1.2腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)

用含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液體外培養(yǎng)人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞，為避免細(xì)胞污染，培養(yǎng)液中含有100 U/ml的青霉素和鏈霉素。將細(xì)胞培養(yǎng)皿放置在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，溫度調(diào)整為37℃，CO2濃度調(diào)整為5%。每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，1-2天更換培養(yǎng)液一次，細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)皿后進(jìn)行細(xì)胞傳代，按照1∶3比例進(jìn)行傳代，細(xì)胞傳代至2-3代處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后進(jìn)行后續(xù)分組實(shí)驗(yàn)。

1.3細(xì)胞增殖率檢測(cè)

利用MTT法檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞增殖率的影響。步驟如下：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT29細(xì)胞按照3000個(gè)/孔鋪于96孔板內(nèi)，搖勻，過(guò)夜，待細(xì)胞完全貼壁后，給予HT29細(xì)胞不同濃度藥物(Bortezomib 0 nm,10 nM，20 nM，50 nM)或聯(lián)合CK2抑制劑TBB，每組設(shè)置6個(gè)重復(fù)孔，藥物作用完成后，每個(gè)孔內(nèi)均加入15 μl MTT(5 mg/mL)工作液，加入后繼續(xù)放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3個(gè)小時(shí)，結(jié)束后利用加樣器完全棄除培養(yǎng)液，棄除溶液后每孔加入180 μl的DMSO(二甲基亞砜)，完全加入后放置于平板振蕩器上混勻振蕩，利用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值。

1.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，按照藥物濃度分組作用后，消化收集細(xì)胞后，利用預(yù)先冷卻的PBS溶液洗滌細(xì)胞3次，洗滌完成后棄除PBS溶液，加入檢測(cè)試劑盒內(nèi)的結(jié)合緩沖液500 μl，利用加樣器重懸細(xì)胞，將細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液后，每組加入Annexin V-FITC溶液5 μl，混勻后再加入PI溶液5 μl，混勻后室溫孵育 20 min(避光)，最后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

1.5WesternBlotting檢測(cè)各組細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)

為明確各組細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)差異，利用免疫印跡(Western Blotting)檢測(cè)HT29細(xì)胞中cleaved caspase-3的表達(dá)水平。細(xì)胞分組藥物作用后，消化收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞兩次，完全棄除PBS后加入細(xì)胞裂解液RIPA150 μl，同時(shí)在裂解液內(nèi)加入蛋白酶抑制劑和蛋白磷酸酶抑制劑，冰上孵育5分鐘后，放入冰箱內(nèi)旋轉(zhuǎn)混勻20 min，3 000 rpm/min 離心10 min，盡量取上清，利用BCA方法檢測(cè)蛋白濃度后將蛋白濃度稀釋相同，煮沸8 min蛋白變性后放入-20℃冰箱內(nèi)保存用于后續(xù)跑膠。配置10% 濃度分離膠，蛋白完全分離后將膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，100V，轉(zhuǎn)膜60 min，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后放入5%脫脂奶粉中封閉2 h，然后加入稀釋好的Cleaved caspase-3后4℃孵育過(guò)夜，第二天加入兔二抗室溫孵育1 h，利用PBST溶液洗膜3次,ECL顯色液對(duì)PVDF膜進(jìn)行顯色拍照。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS13.0版本進(jìn)行分析。計(jì)量數(shù)據(jù)采用M±SD 表示，兩組數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)，3組及以上數(shù)據(jù)采用方差分析，利用統(tǒng)計(jì)所得數(shù)據(jù)繪制圖表。

2 結(jié)果

2.1蛋白酶體抑制劑硼替佐米對(duì)人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞增殖的影響

MTT檢測(cè)硼替佐米對(duì)HT29細(xì)胞增殖抑制的效果。MTT結(jié)果表明不同劑量的硼替佐米都能抑制HT29細(xì)胞的增殖，并且呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性。在 50 nM時(shí)，硼替佐米的抑制效果最明顯。見(jiàn)表 1。

表1 蛋白酶體抑制劑Bortezomib對(duì)結(jié)腸癌HT29細(xì)胞生存率的影響

*與Control相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.05

2.2硼替佐米誘導(dǎo)了HT29細(xì)胞的凋亡

流式細(xì)胞儀檢測(cè)硼替佐米對(duì)HT29細(xì)胞凋亡的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明10 nM、20 nM、50 nM都能誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，在50 nM時(shí)，細(xì)胞凋亡最明顯，見(jiàn)表2。

表2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Bortezomib對(duì)結(jié)腸癌HT29細(xì)胞凋亡的影響

*與Control相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.05

2.3硼替佐米增加了HT29細(xì)胞內(nèi)CleavedCaspase-3的表達(dá)

Cleaved Caspase-3 作為凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行分子，在凋亡信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Control組幾乎不表達(dá)Cleaved Caspase-3，不同硼替佐米劑量組能誘導(dǎo)Cleaved Caspase-3 的表達(dá)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 Bortezomib對(duì)結(jié)腸癌HT29細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.4聯(lián)合CK2抑制劑TBB對(duì)硼替佐米引起的HT29細(xì)胞增殖抑制的影響

實(shí)驗(yàn)分為四組：Control組，硼替佐米組，TBB組及聯(lián)合用藥組。根據(jù)前面實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在后面的實(shí)驗(yàn)中，我們選擇硼替佐米的劑量為20 nM。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明與硼替佐米組相比，聯(lián)合用藥組抑制了HT29細(xì)胞的增殖。見(jiàn)表3。

表3 聯(lián)合應(yīng)用CK2抑制劑TBB對(duì)Bortezomib引起的結(jié)腸癌HT29細(xì)胞生存率影響

*與Control相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.05；#與Bortezomib組相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.05

2.5聯(lián)合TBB對(duì)硼替佐米引起的HT29細(xì)胞凋亡率升高的影響

流式細(xì)胞儀檢測(cè)聯(lián)合用藥對(duì)HT29細(xì)胞凋亡的變化情況，結(jié)果表明聯(lián)合用藥組能明顯增強(qiáng)硼替佐米誘導(dǎo)的HT29細(xì)胞的凋亡。見(jiàn)表4。

表4 聯(lián)合應(yīng)用CK2抑制劑TBB對(duì)Bortezomib引起的結(jié)腸癌HT29細(xì)胞凋亡的影響

*與Control相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.05；#與Bortezomib組相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.05

2.6聯(lián)合TBB對(duì)硼替佐米誘導(dǎo)的HT29細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

Western blotting檢測(cè)不同組細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白Cleaved Caspase-3表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示出，與單獨(dú)使用硼替佐米作用相比較，聯(lián)合CK2抑制劑TBB可以進(jìn)一步增加Cleaved Caspase-3的表達(dá)水平。見(jiàn)圖2。

圖2 TBB對(duì)硼替佐米誘導(dǎo)的HT29細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

3 討論

硼替佐米是第一代蛋白酶體抑制劑，能抑制26S蛋白酶體亞基的活性。已有研究表明硼替佐米能明顯抑制多發(fā)性骨髓瘤的活性[6]。目前，以硼替佐米為基礎(chǔ)的聯(lián)合療法，結(jié)合傳統(tǒng)的化療藥物和新型制劑，代表著治療多發(fā)性骨髓瘤和非霍奇金淋巴瘤的治療標(biāo)準(zhǔn)[7]。本實(shí)驗(yàn)研究表明硼替佐米抑制HT29細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡并且呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性。然而，最近有文獻(xiàn)報(bào)道盡管硼替佐米能促使抗凋亡分子Mcl1裂解和失活，但它也能維持抑癌基因p53、促凋亡蛋白Bax的活性，促進(jìn)Noxa和Puma蛋白表達(dá)[8]。硼替佐米也能誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，這是腫瘤細(xì)胞存活的機(jī)制之一。促存活的未折疊蛋白反應(yīng)是硼替佐米所誘導(dǎo)的結(jié)果[9]。因此，靶向硼替佐米所誘導(dǎo)的促存活分子是我們研究的目標(biāo)。

蛋白激酶CK2，也稱(chēng)為酪蛋白激酶II，是細(xì)胞內(nèi)普遍存在的絲氨酸/蘇氨酸激酶。越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)表明了CK2是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活的主要原因之一[4]。CK2通過(guò)對(duì)Cdc37和Hsp90形成的分子伴侶活性的調(diào)控激活了細(xì)胞內(nèi)眾多蛋白酶的活性[10]。CK2調(diào)控著IκBα蛋白周轉(zhuǎn)、p53的功能、AKT的活性和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[11]。Sabrina Manni等人證實(shí)了CK2維持多發(fā)性骨髓瘤的生存，而CK2的抑制劑下調(diào)NF-κB和STAT3促存活信號(hào)通路，從而增加多發(fā)性骨髓瘤對(duì)化療藥物的敏感性[12]。因此本文探討了蛋白酶CK2抑制劑TBB是否能增強(qiáng)硼替佐米對(duì)HT29細(xì)胞的敏感性。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TBB增強(qiáng)了硼替佐米的抑制增殖和促進(jìn)凋亡效應(yīng)，兩者之間具有協(xié)同作用。

綜上所述，硼替佐米抑制了HT29細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡。靶向CK2能增強(qiáng)硼替佐米的殺傷作用。這表明了CK2活性在硼替佐米誘導(dǎo)的HT29細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮著促存活的作用。

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