尹米琦，張雙喜，范春捆，王坤楊，王靜，王軻，杜麗璞，葉興國(guó)

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不同化學(xué)試劑和處理方式加倍小麥單倍體植株的效果

尹米琦1，張雙喜2，范春捆3，王坤楊1，王靜1，王軻1，杜麗璞1，葉興國(guó)1

（1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所/農(nóng)作物基因資源與基因改良國(guó)家重大科學(xué)工程，北京 100081；2寧夏農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)作物研究所，銀川 750105；3西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院農(nóng)業(yè)研究所，拉薩 850032）

【目的】長(zhǎng)期以來(lái)，小麥單倍體植株染色體加倍主要采用移栽前秋水仙素溶液通氣浸泡分蘗節(jié)方法，該方法存在操作復(fù)雜、污染環(huán)境等問(wèn)題，而且秋水仙素毒性較強(qiáng)、用量較大、價(jià)格較高。本研究的目的是建立小麥單倍體植株簡(jiǎn)便、安全、高效的加倍方法，尋找可以替代秋水仙素用于小麥單倍體植株加倍的化學(xué)試劑?！痉椒ā客ㄟ^(guò)小麥品系Fielder花藥培養(yǎng)，小麥品種科農(nóng)199、新春9號(hào)和小麥品系CB037、中國(guó)春（CS）與玉米自交系鄭58雜交獲得小麥單倍體植株，小麥品系中國(guó)春與甘肅黑麥雜交獲得小麥-黑麥雙單倍體植株，利用0、5、10和20 mmol·L-1秋水仙素溶液分別采取分蘗節(jié)加注、葉片涂抹和培養(yǎng)基表面添加方式對(duì)不同來(lái)源小麥單倍體植株進(jìn)行加倍，并采用培養(yǎng)基表面添加0、30、60和120 μ·L-1甲基胺草磷、炔苯酰草胺和氟樂(lè)靈溶液對(duì)小麥單倍體植株及小麥-黑麥雙單倍體植株加倍，比較不同加倍方法和3種除草劑的加倍效果，確定各個(gè)加倍試劑的適宜濃度。【結(jié)果】不同濃度秋水仙素溶液（0、5、10和20 mmol·L-1）加注小麥與玉米雜交單倍體植株分蘗節(jié)部位對(duì)小麥單倍體植株不具有加倍效果，不宜在小麥單倍體植株加倍中采用。10 mmol·L-1秋水仙素溶液涂抹拔節(jié)期小麥單倍體植株葉片的加倍率為7.7%，其他3個(gè)秋水仙素溶液濃度沒(méi)有加倍成功，也不適合小麥單倍體植株加倍。培養(yǎng)基表面添加4個(gè)濃度秋水仙素溶液處理小麥花藥培養(yǎng)單倍體植株的加倍率分別為26.7%、42.9%、73.3%和85.7%。表明培養(yǎng)基表面添加秋水仙素溶液對(duì)小麥單倍體植株的加倍效果最好，適宜濃度至少為20 mmol·L-1。培養(yǎng)基表面添加0、30、60和120 μmol·L-1炔苯酰草胺溶液處理小麥與玉米雜交單倍體植株的加倍率分別為0、0—57.1%、28.6%—75.0%和0—100%，其他2種除草劑處理小麥與玉米雜交單倍體植株沒(méi)有成功；培養(yǎng)基表面添加120 μmol·L-1炔苯酰草胺溶液處理小麥與黑麥雜交雙單倍體植株的加倍率為9.0%，添加其他3個(gè)濃度炔苯酰草胺溶液和其他3種加倍試劑均沒(méi)有結(jié)實(shí)?！窘Y(jié)論】60—120 μmol·L-1濃度炔苯酰草胺溶液對(duì)小麥單倍體植株加倍具有較好效果，培養(yǎng)基表面添加適宜濃度秋水仙素和炔苯酰草胺溶液對(duì)小麥單倍體植株加倍有效，而且簡(jiǎn)單易行。

小麥；單倍體植株；遠(yuǎn)緣雜交；花藥培養(yǎng)；加倍試劑

0 引言

【研究意義】小麥?zhǔn)鞘澜缰匾募Z食作物之一，培育優(yōu)良品種是提高小麥產(chǎn)量的關(guān)鍵措施[1-2]。在眾多小麥育種方法中，單倍體育種具有基因純合速度快、育種年限短、提高育種效率的優(yōu)勢(shì)。小麥單倍體植株誘導(dǎo)及其染色體加倍不但是培育小麥新品種的關(guān)鍵技術(shù)，也是用于小麥遺傳分析和基因定位中創(chuàng)建DH群體的重要方法。【前人研究進(jìn)展】小麥單倍體植株可以通過(guò)小麥與玉米雜交后染色體排除[3-4]、花藥培養(yǎng)[5-7]和小孢子培養(yǎng)[8-12]3種途徑獲得。其中，花藥培養(yǎng)具有強(qiáng)烈的基因型依賴性，多數(shù)小麥品種或F1雜種的花藥培養(yǎng)難以獲得愈傷組織和再生植株；雖然小孢子培養(yǎng)對(duì)基因型的依賴性較小，但試驗(yàn)操作復(fù)雜，容易污染，周期較長(zhǎng)；小麥與玉米雜交方式誘導(dǎo)單倍體植株幾乎不受基因型的限制，操作容易，周期較短，但成胚率較低[3-4]。在獲得植株的倍性方面，小麥與玉米雜交后通過(guò)幼胚拯救獲得單倍體植株幾乎不能自然加倍[4]，花藥培養(yǎng)方式獲得單倍體植株的自然加倍率20%—30%[13]，小孢子培養(yǎng)方式獲得單倍體植株的自然加倍率30%—40%[11]。為了確保純合二倍體植株的獲得并提高單倍體植株的加倍效率，需要利用秋水仙素（cochicine）對(duì)幼苗或愈傷組織進(jìn)行染色體加倍[14-15]。迄今為止，對(duì)小麥單倍體植株進(jìn)行染色體加倍利用最多的方法是苗期分蘗節(jié)處理加倍，即將幼苗從培養(yǎng)基中取出，放入含秋水仙素0.02%—0.1%的水溶液中，在通氣泵介導(dǎo)的供氧條件下處理5—10 h，然后取出幼苗，流水沖洗3—4 h，最后移栽在花盆中。該方法的加倍率一般為50%—60%，加倍植株生長(zhǎng)發(fā)育正常[16-19]。利用0.2%秋水仙素對(duì)小麥單倍體植株進(jìn)行5 h浸根處理，加倍率也只有37.5%[17]。需要說(shuō)明的是，這兩種方法操作比較繁瑣，步驟較多，容易污染人體和水源。為了提高單倍體植株加倍效率，減少秋水仙素對(duì)環(huán)境的污染和人體接觸秋水仙素的機(jī)率，一些實(shí)驗(yàn)室也探索過(guò)在花藥培養(yǎng)愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入0.02%—0.1%的秋水仙素，單倍體植株染色體加倍率30%—60%[16-17,19]，不能滿足小麥細(xì)胞工程育種的需要。另外，秋水仙素是一種毒性比較強(qiáng)的化學(xué)試劑，不但對(duì)操作人員的安全性不高，而且也容易導(dǎo)致水源污染，需要尋找一種安全、無(wú)殘留、易降解的加倍試劑替代秋水仙素。在玉米誘導(dǎo)系誘導(dǎo)的單倍體植株加倍中，利用0.04%的甲基胺草磷（amiprophos-methyl）除草劑溶液在三葉期至五葉期滴心處理，能夠獲得20%—30%的加倍率（對(duì)照處理加倍率為0）[20]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，小麥單倍體植株染色體加倍普遍采用移栽前秋水仙素溶液通氣浸泡分蘗節(jié)方法，存在操作復(fù)雜、環(huán)境污染、毒性較強(qiáng)、成本較高等問(wèn)題。另外，甲基胺草磷、炔苯酰草胺（propyzamide）和氟樂(lè)靈（trifluralin）等除草劑對(duì)單倍體植株的加倍作用和地上部施用加倍方法僅在玉米等少數(shù)幾種植物中有報(bào)道，在小麥中還沒(méi)有嘗試。鑒于目前小麥單倍體加倍技術(shù)存在的一些缺點(diǎn)，需要建立一種簡(jiǎn)便、高效、安全的單倍體植株加倍方法?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究通過(guò)對(duì)甲基胺草磷、氟樂(lè)靈、炔苯酰草胺和秋水仙素等化學(xué)試劑加倍小麥單倍體植株的方法和效果進(jìn)行比較，確定高效加倍小麥單倍體植株的適宜方法和試劑及其用量，為提高小麥單倍體植株加倍效率和加倍單倍體育種效率奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

所用的普通小麥（，AABBDD，2n=6X=42）材料為科農(nóng)199、中國(guó)春（CS）、新春9號(hào)、Fielder和CB037，均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所小麥遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)室保存，甘肅黑麥（，RR，2n=2X=14）由北方民族大學(xué)任賢教授提供，玉米（，2n=2X=20）自交系鄭58花粉由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所劉允軍博士提供。

1.2 化學(xué)試劑和加倍處理設(shè)置

染色體加倍化學(xué)藥劑秋水仙素、甲基胺草磷、炔苯酰草胺和氟樂(lè)靈購(gòu)自西格瑪-奧德里奇公司（純度均為99%以上）。秋水仙素直接用蒸餾水溶解，配置4個(gè)加倍處理濃度為0、5、10和20·L-1，4℃低溫保存。甲基胺草磷、炔苯酰草胺和氟樂(lè)靈先用無(wú)水乙醇加1%吐溫20（TWEEN-20）充分溶解，再加水溶解到適宜濃度，配置4個(gè)加倍處理濃度為0、30、60和120 μ·L-1，4℃低溫保存。

1.3 小麥單倍體誘導(dǎo)方法

1.3.1 小麥與玉米雜交 2013年9月將小麥品種科農(nóng)199和新春9號(hào)、小麥品系CB037和中國(guó)春種植在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)，越冬前覆蓋塑料布，返青期揭開(kāi)塑料布。2014年2月將玉米自交系鄭58分期種植在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所溫室。小麥進(jìn)入抽穗期后，選擇開(kāi)花前一天的麥穗，人工去雄、套袋，3 d后收集玉米新鮮花粉授于去雄后的小麥，分別于授粉后24和48 h用含2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）100 mg·L-1的水溶液噴灑雜交穗各1次；授粉后16—17 d取樣雜交穗，收集幼嫩籽粒，70%酒精表面消毒1 min，15%次氯酸鈉滅菌20 min，無(wú)菌水沖洗5次；在解剖鏡下取出小麥單倍體幼胚，胚軸端向上接種至1/2MS培養(yǎng)基（1/2MS + 20 g·L-1蔗糖 + 2.4 g·L-1植物凝膠，pH 5.8）上，每個(gè)培養(yǎng)管接種3—4個(gè)幼胚；先在黑暗、25℃條件下培養(yǎng)3 d，然后在光照、25℃條件下培養(yǎng)20 d，獲得單倍體植株[21-22]。

1.3.2 小麥花藥培養(yǎng) 2013年9月將小麥品系Fielder種植在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)，越冬前覆蓋塑料布，返青期揭開(kāi)塑料布。在小麥孕穗期取處于單核靠邊期的幼穗，用塑料袋包裹后置于4℃冰箱中預(yù)處理3 d。接種前用70%酒精充分擦拭葉鞘部位進(jìn)行表面消毒，在潔凈工作臺(tái)中用手剝?nèi)ト~鞘，然后用鑷子剝?nèi)シf殼，取出花藥接種在W14愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基（W14 + 2 mg·L-12,4-D + 0.5 mg·L-1激動(dòng)素（KT）+ 100 g·L-1蔗糖 + 2.4 g·L-1植物凝膠，pH 5.8）上，先在生化培養(yǎng)箱中30℃、黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)3 d，然后轉(zhuǎn)到28℃、黑暗下培養(yǎng)30—45 d。將產(chǎn)生的直徑1 mm左右的愈傷組織轉(zhuǎn)移到1/2 MSNK分化培養(yǎng)基（1/2MS+0.5 mg·L-1萘乙酸（NAA）+1 mg·L-1KT + 20 g·L-1蔗糖 + 2.4 g·L-1植物凝膠，pH 5.8）上，在（25±1）℃、光照條件（3 500 Lx，16 h）下培養(yǎng)20—25 d分化單倍體植株[23-24]。

1.3.3 小麥與黑麥雜交 2015年2月將小麥品系中國(guó)春和黑麥品系甘肅黑麥種植在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所網(wǎng)室，甘肅黑麥每5 d種植一期，共種植4期。中國(guó)春抽穗時(shí)及時(shí)人工去雄、套袋，3 d后授以黑麥花粉，30 d后直接收獲雜交籽粒，室溫下放置通過(guò)休眠[22, 25]。然后，雜交籽粒用70%酒精表面消毒2 min，15%次氯酸鈉滅菌20 min，無(wú)菌水沖洗5次，取出成熟胚，胚軸端向上接種至1/2MS培養(yǎng)基（1/2MS + 20 g·L-1蔗糖 + 2.4 g·L-1植物凝膠，pH 5.8）上，每個(gè)培養(yǎng)管接種4—5個(gè)成熟胚，在光照、25℃條件下培養(yǎng)20 d，獲得雙單倍體植株。

1.4 染色體加倍方法

1.4.1 小麥單倍體植株分蘗節(jié)加注秋水仙素 離體培養(yǎng)的小麥單倍體幼苗高度8—10 cm、根系健壯時(shí)，移栽到盛有草炭土（大漢園藝產(chǎn)品，貨號(hào)為KLASMAN422）的花盆（直徑25 cm，高度20 cm；每個(gè)花盆中均勻摻入20 g奧綠緩釋肥）中，每個(gè)花盆移栽3—4株，移栽后澆250 mL自來(lái)水，每株苗用透光塑料水杯罩住，放入5—8℃、光照條件的低溫生長(zhǎng)室中緩苗。移栽10 d后移去水杯，15 d后將花盆移至25℃、光照條件的植物生長(zhǎng)室中生長(zhǎng)。在生長(zhǎng)室中生長(zhǎng)7 d左右時(shí)，用微量移液器在每株植株分蘗節(jié)部位加注2 mL不同濃度（0、5、10和20·L-1）的秋水仙素溶液。24 h后每個(gè)花盆中澆250 mL自來(lái)水，每3 d澆一次。成熟期調(diào)查結(jié)實(shí)性，收獲后進(jìn)行細(xì)胞遺傳學(xué)檢查，判別染色體加倍效果。

1.4.2 小麥單倍體植株葉片涂抹秋水仙素 離體培養(yǎng)的小麥單倍體幼苗高度8—10 cm、根系健壯時(shí)，移栽到溫室中。拔節(jié)期用棉簽蘸取不同濃度的秋水仙素溶液（0、5、10和20·L-1），反復(fù)涂抹新生葉片中部。成熟期調(diào)查結(jié)實(shí)性，收獲后進(jìn)行細(xì)胞遺傳學(xué)檢查，判別單倍體植株染色體加倍效果。

1.4.3 小麥單倍體植株培養(yǎng)基表面添加化學(xué)試劑 離體培養(yǎng)的玉米花粉誘導(dǎo)的小麥單倍體植株和小麥與黑麥雜交產(chǎn)生的小麥-黑麥雙單倍體植株在試管中生長(zhǎng)健壯后（苗高8—10 cm，根系健壯），用微量移液器向每個(gè)試管中的培養(yǎng)基表面加入2 mL不同濃度秋水仙素溶液（0、5、10和20·L-1）和甲基胺草磷、炔苯酰草胺及氟樂(lè)靈溶液（0、30、60和120 μ·L-1，處理24 h后流水沖洗30 s。玉米花粉誘導(dǎo)的小麥單倍體植株移栽到花盆（基質(zhì)為KLASMAN422，每個(gè)花盆中均勻摻入20 g奧綠緩釋肥），在25℃生長(zhǎng)室中生長(zhǎng)；小麥-黑麥雙單倍體植株移栽到溫室，生長(zhǎng)期間溫度20—28℃。成熟期調(diào)查結(jié)實(shí)性，收獲后進(jìn)行細(xì)胞遺傳學(xué)檢查，判別染色體加倍效果。

1.5 根尖細(xì)胞染色體制片

小麥單倍體試管苗移栽前取1—2 cm長(zhǎng)度的根尖，成熟小麥種子萌發(fā)處理3—4 d后取相同長(zhǎng)度的根尖，冰水處理24 h，浸泡在3﹕1的酒精與乙酸溶液中固定24 h，放入95%酒精中保存。經(jīng)固定的根尖用1 N HCl在60℃下水解14 min，然后用醋酸洋紅進(jìn)行染色，在顯微鏡下觀察單倍體植株染色體并拍照。

2 結(jié)果

2.1 分蘗節(jié)加注秋水仙素對(duì)小麥單倍體植株加倍效果的影響

從小麥品種科農(nóng)199與玉米自交系鄭58雜交后的40個(gè)麥穗上收集了506個(gè)幼嫩籽粒，共接種單倍體幼胚43個(gè)，獲得31株單倍體植株（圖1）。單倍體植株移栽后生長(zhǎng)7 d左右時(shí)，用微量移液器在每株植株分蘗節(jié)部位加注2 mL濃度分別為0、5、10和20·L-1秋水仙素溶液進(jìn)行加倍處理，每個(gè)濃度水平處理7—8株。結(jié)果表明，不同濃度秋水仙素溶液處理的小麥單倍體植株都沒(méi)有結(jié)實(shí)（表1），與不加倍處理（對(duì)照）的結(jié)果相同，表明秋水仙素溶液加注分蘗節(jié)部位對(duì)小麥單倍體植株不具有加倍效果。

2.2 葉片涂抹秋水仙素對(duì)小麥單倍體植株加倍效果的影響

小麥品種新春9號(hào)與玉米自交系鄭58雜交56穗，收集620個(gè)幼嫩籽粒，接種單倍體幼胚62個(gè)，獲得了49株單倍體植株（圖2）。移栽到溫室中生長(zhǎng)至拔節(jié)后期時(shí)，分別用濃度為0、5、10和20·L-1秋水仙素溶液涂抹小麥單倍體植株上部葉片進(jìn)行加倍處理，每個(gè)濃度水平處理12—13株。經(jīng)結(jié)實(shí)性調(diào)查和細(xì)胞學(xué)檢測(cè)（圖2），10·L-1秋水仙素濃度處理的小麥單倍體植株有1株結(jié)實(shí)，加倍率為7.7%；0、5和20·L-1秋水仙素濃度處理和對(duì)照處理的單倍體植株都沒(méi)有結(jié)實(shí)，加倍率為0（表2）。表明秋水仙素溶液涂抹小麥單倍體植株葉片雖有加倍效果，但加倍效果很差。

表1 不同濃度秋水仙素溶液分蘗節(jié)加注方法小麥單倍體植株的加倍效果

A：幼胚拯救培養(yǎng)獲得的單倍體植株；B：?jiǎn)伪扼w植株染色體組成（n=21）

表2 不同濃度秋水仙素溶液涂抹小麥單倍體植株的加倍效果

2.3 培養(yǎng)基表面添加秋水仙素對(duì)小麥單倍體試管植株加倍效率的影響

對(duì)小麥品系Fielder進(jìn)行花藥培養(yǎng)，獲得51株單倍體植株。試管苗生長(zhǎng)足夠健壯時(shí)，在培養(yǎng)基表面添加濃度為0、5、10和20·L-1的秋水仙素溶液進(jìn)行加倍處理，每個(gè)濃度水平處理7—15株。經(jīng)結(jié)實(shí)性調(diào)查和細(xì)胞學(xué)檢測(cè)（圖3），秋水仙素溶液4個(gè)濃度處理Fielder花藥培養(yǎng)單倍體植株的加倍率分別為26.7%、42.9%、73.3%和85.7%（表3）。結(jié)果表明，隨著秋水仙素的增加，單倍體植株染色體加倍率提高；與玉米花粉誘導(dǎo)的單倍體相比，來(lái)源于花藥培養(yǎng)的單倍體植株有一定程度的自然加倍率。

A：幼胚拯救培養(yǎng)獲得的單倍體植株；B：?jiǎn)伪扼w植株染色體組成（n=21）；C：加倍單倍體植株染色體組成（2n=42）

2.4 培養(yǎng)基表面添加不同除草劑對(duì)小麥單倍體試管植株加倍效果的影響

2.4.1 培養(yǎng)基表面添加不同除草劑對(duì)小麥與玉米雜交單倍體植株加倍效果的影響 小麥品系中國(guó)春與玉米自交系鄭58種雜交獲得118株單倍體植株，小麥品系CB037與玉米自交系鄭58種雜交獲得28株單倍體植株。試管苗生長(zhǎng)足夠健壯時(shí)，在培養(yǎng)基表面添加濃度為30、60和120 μ·L-1甲基胺草磷、炔苯酰草胺和氟樂(lè)靈溶液進(jìn)行染色體加倍，同時(shí)設(shè)置不加倍處理做為對(duì)照。植株成熟后經(jīng)結(jié)實(shí)性調(diào)查和細(xì)胞學(xué)檢測(cè)，對(duì)照處理沒(méi)有結(jié)實(shí)，3個(gè)濃度甲基胺草磷和氟樂(lè)靈溶液處理中國(guó)春?jiǎn)伪扼w植株都沒(méi)有結(jié)實(shí)，3個(gè)濃度炔苯酰草胺溶液處理中國(guó)春?jiǎn)伪扼w植株的加倍率分別為0、28.6%和0，3個(gè)濃度炔苯酰草胺溶液處理CB037單倍體植株的加倍率分別為57.1%、75.0%和100%（表4）。結(jié)果表明，培養(yǎng)基表面添加60 μ·L-1炔苯酰草胺溶液對(duì)中國(guó)春與玉米雜交單倍體植株具有加倍效果，30—120 μ·L-1炔苯酰草胺溶液對(duì)CB037與玉米雜交誘導(dǎo)的小麥單倍體植株具有加倍效果，另外2種除草劑各種濃度對(duì)小麥與玉米雜交產(chǎn)生的小麥單倍體植株都不具有加倍效果。

A：花藥愈傷組織誘導(dǎo)；B：?jiǎn)伪扼w植株；C：?jiǎn)伪扼w植株染色體組成（n=21）；D：加倍單倍體植株染色體組成（2n=42）

表3 培養(yǎng)基表面添加不同濃度秋水仙素溶液后小麥花藥培養(yǎng)單倍體植株加倍效果

表4 不同濃度與種類除草劑處理不同小麥基因型與玉米雜交誘導(dǎo)小麥單倍體植株加倍情況

2.4.2 培養(yǎng)基表面添加不同加倍試劑對(duì)小麥與黑麥雜交雙單倍體植株加倍效果的影響 小麥品系中國(guó)春與甘肅黑麥雜交后收獲種子，室溫下放置2個(gè)月后將成熟胚進(jìn)行離體培養(yǎng)直接成苗。試管苗生長(zhǎng)比較健壯時(shí)，在培養(yǎng)基表面添加濃度為30、60和120 μ·L-1甲基胺草磷、炔苯酰草胺和氟樂(lè)靈溶液，以及濃度為5、10和20·L-1秋水仙素溶液進(jìn)行染色體加倍，同時(shí)設(shè)置不加倍處理做為對(duì)照。經(jīng)結(jié)實(shí)性調(diào)查和細(xì)胞學(xué)檢測(cè)（圖4），對(duì)照處理沒(méi)有結(jié)實(shí)，3個(gè)濃度甲基胺草磷、氟樂(lè)靈和秋水仙素溶液處理中國(guó)春與甘肅黑麥雜交雙單倍體植株都沒(méi)有結(jié)實(shí)，30和60 μ·L-1炔苯酰草胺溶液處理雙單倍體植株也沒(méi)有結(jié)實(shí)，120 μ·L-1炔苯酰草胺溶液處理雙單倍體植株的加倍率為9.0%（表5）。

表5 不同種類與濃度的化學(xué)試劑處理中國(guó)春與甘肅黑麥雜交雙單倍體植株加倍情況

A：中國(guó)春與甘肅黑麥雜交植株染色體數(shù)目（n=28）；B：中國(guó)春與甘肅黑麥雜交種加倍后染色體數(shù)目（2n=56）

3 討論

秋水仙素誘導(dǎo)染色體加倍的作用機(jī)制已比較清楚，即抑制處于有絲分裂中期細(xì)胞中紡錘絲的形成[26]，復(fù)制的染色體沒(méi)有分離。相對(duì)而言，關(guān)于甲基胺草磷、氟樂(lè)靈、炔苯酰草胺等除草劑誘導(dǎo)染色體加倍機(jī)理的研究還不夠明確。研究表明，甲基胺草磷和氟樂(lè)靈抑制了細(xì)胞微管的組裝，干擾了有絲分裂的正常進(jìn)行，具有一定加倍效果[27]；甲基胺草磷阻礙紡錘絲的形成，促進(jìn)細(xì)胞微核的產(chǎn)生[28-29]；炔苯酰草胺具有阻止細(xì)胞有絲分裂啟動(dòng)和紡錘絲形成的雙重作用，將細(xì)胞分裂停留在中期[30]，具有較好的加倍效果。在加倍玉米花粉來(lái)源單倍體愈傷組織的研究中發(fā)現(xiàn)，炔苯酰草胺能加倍玉米染色體[31]。在玉米單倍體植株三葉期至五葉期利用不同濃度除草劑（甲基胺草磷、炔苯酰草胺及氟樂(lè)靈）滴心處理進(jìn)行染色體加倍，發(fā)現(xiàn)3種除草劑濃度20—160 mmol·L-1都有加倍效果，其中，80 mmol·L-1甲基胺草磷加倍效果最好，且對(duì)不同玉米自交系單倍體植株的加倍效果存在顯著差異[20]。

本研究中，利用不同濃度秋水仙素溶液涂抹小麥與玉米雜交產(chǎn)生小麥單倍體植株拔節(jié)后期新生葉片，僅10·L-1秋水仙素處理獲得了7.7%的加倍率，其他處理沒(méi)有發(fā)現(xiàn)結(jié)實(shí)植株。為了摸索簡(jiǎn)易、高效加倍單倍體植株的方法，用培養(yǎng)基表面添加不同濃度秋水仙素溶液對(duì)小麥與玉米雜交產(chǎn)生小麥單倍體植株移栽后進(jìn)行分蘗節(jié)加注處理，沒(méi)有獲得結(jié)實(shí)植株。同時(shí)，用不同濃度秋水仙素溶液對(duì)小麥花藥培養(yǎng)單倍體植株試管苗進(jìn)行培養(yǎng)基表面添加處理，10和20·L-1秋水仙素濃度處理獲得了70%以上的加倍率，高于目前報(bào)道的分蘗節(jié)浸泡加倍方法[11, 16-19]。表明培養(yǎng)基表面添加秋水仙素加倍小麥單倍體植株效果理想，葉片涂抹秋水仙素加倍小麥單倍體植株效果很差，分蘗節(jié)加注秋水仙素對(duì)小麥單倍體植株不具有加倍效果。培養(yǎng)基表面添加秋水仙素還具有操作簡(jiǎn)單、環(huán)境污染少的優(yōu)點(diǎn)。

為了尋找加倍小麥單倍體植株的環(huán)境友好型加倍試劑，參考玉米中的研究結(jié)果，利用不同濃度甲基胺草磷、炔苯酰草胺、氟樂(lè)靈及秋水仙素溶液分別對(duì)小麥與玉米雜交產(chǎn)生的小麥單倍體植株和小麥與黑麥雜交產(chǎn)生的雙單倍體植株進(jìn)行了培養(yǎng)基表面添加處理，30—120 μmol·L-1炔苯酰草胺處理CB037與玉米雜交產(chǎn)生的小麥單倍體植株獲得了57.1%—100%的加倍率，處理中國(guó)春與玉米雜交產(chǎn)生的小麥單倍體植株僅120 μmol·L-1炔苯酰草胺濃度獲得了28.6%的加倍率，甲基胺草磷和氟樂(lè)靈不同濃度處理均沒(méi)有加倍成功，表明炔苯酰草胺對(duì)小麥單倍體植株具有加倍效果，60—120 μmol·L-1炔苯酰草胺是培養(yǎng)基表面添加方式加倍小麥單倍體植株的適宜濃度，這與惠國(guó)強(qiáng)等[20]在玉米中獲得的結(jié)果不完全一致。利用炔苯酰草胺加倍中國(guó)春和CB037單倍體植株的加倍效果存在顯著差異，不同小麥基因型間加倍效率的差異可能與遺傳因素有關(guān)，這與除草劑加倍玉米單倍體植株的結(jié)果一致[20]，說(shuō)明染色體加倍率可能也是一種可遺傳的性狀。不同小麥基因型加倍效率的差異可能也與加倍處理后植株生長(zhǎng)的環(huán)境條件和生長(zhǎng)習(xí)性有關(guān)。由于獲得中國(guó)春和CBO37單倍體植株的時(shí)期不同步，分別進(jìn)行了加倍處理，且中國(guó)春?jiǎn)伪扼w植株在人工氣候條件下生長(zhǎng)發(fā)育緩慢、植株不夠健壯。處理小麥與黑麥雜交產(chǎn)生的雙單倍體植株僅120 μmol·L-1炔苯酰草胺濃度獲得了9.0%的加倍率，另外2種除草劑和秋水仙素不同處理均沒(méi)有加倍成功，表明炔苯酰草胺對(duì)小麥與黑麥雙單倍體植株也具有加倍效果。相比小麥單倍體植株，小麥與黑麥雙單倍體植株加倍率非常低，這可能與不同小麥單倍體植株的遺傳組成有關(guān)。小麥與黑麥雙單倍體植株來(lái)源小麥雌配子與黑麥雄配子的結(jié)合，含有小麥單倍染色體組和黑麥單倍染色體組，可能具有相對(duì)高的遺傳穩(wěn)定性，對(duì)加倍試劑處理具有較強(qiáng)的耐受性。為了提高炔苯酰草胺對(duì)小麥與黑麥雙單倍體植株的加倍效果，我們進(jìn)一步增加了其處理濃度（0.5—5.0m·L-1炔苯酰草胺

另外，本研究在利用各個(gè)濃度甲基胺草磷、炔苯酰草胺、氟樂(lè)靈和秋水仙素溶液加倍小麥與黑麥雙單倍體植株中均出現(xiàn)了一定比率維持在幼苗生長(zhǎng)狀態(tài)的植株，這些植株在溫室中生長(zhǎng)了4個(gè)月（2016年9月—2017年1月）沒(méi)有拔節(jié)，而其他植株都正常完成了生命周期。將這些植株移栽到花盆中放在室外生長(zhǎng)，也一直沒(méi)有拔節(jié)，而它們的雙親中國(guó)春和甘肅黑麥都屬春性。目前這些植株在低溫生長(zhǎng)室進(jìn)行春化處理，擬深入研究這些畸形苗發(fā)生的分子機(jī)制。

相比花藥培養(yǎng)，利用玉米花粉誘導(dǎo)小麥單倍體植株幾乎沒(méi)有小麥基因型的依賴性，試驗(yàn)操作也比較簡(jiǎn)單，但小麥單倍體胚誘導(dǎo)率是該技術(shù)進(jìn)一步利用的限制因素。陳新民等[18,26]報(bào)道不同玉米基因型誘導(dǎo)不同小麥基因型單倍體胚的成胚率一般為15%—20%。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所小麥遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)小麥單倍體胚的頻率一直比較低（5%—10%），也嘗試?yán)糜衩渍T導(dǎo)系和處理液中添加阿拉伯葡聚糖蛋白（arabinogalactan proteins，AGP）等方式提高成胚率[32]，結(jié)果仍然不盡理想。將繼續(xù)探討提高成胚率的技術(shù)，以提高小麥單倍體育種和轉(zhuǎn)基因育種（加速轉(zhuǎn)基因材料純合）的效率。

4 結(jié)論

培養(yǎng)基表面添加10—20 mmol·L-1秋水仙素溶液對(duì)小麥單倍體植株加倍效果明顯，而且簡(jiǎn)單易行；葉片涂抹秋水仙素溶液加倍效率較低，分蘗節(jié)加注秋水仙素溶液不能加倍小麥單倍體植株。在選用的3種除草劑中，只有炔苯酰草胺對(duì)小麥單倍體植株具有加倍效果；培養(yǎng)基表面添加60—120 μ·L-1濃度的炔苯酰草胺溶對(duì)小麥單倍體植株加倍作用明顯。

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（責(zé)任編輯 李莉）

Effects of Different Chemicals and Treatment Methods on Chromosome Doubling of Haploid Wheat Plants

YIN MiQi1, ZHANG ShuangXi2, FAN ChunKun3, WANG KunYang1, WANG Jing1, WANG Ke1, DU LiPu1, YE XingGuo1

（1Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences/National Key Facility for Gene Resources and Genetic Improvement, Beijing 100081;2Crop Research Institute, Ningxia Academy of Agri-Forestry Sciences, Yinchuan 750105;3Agricultural Institute, Tibet Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences, Lasa 850032）

【Objective】The treatment of tillering node with colchicine in a pump solution has long been widely used for chromosome doubling of haploid wheat plants before transplanting. However, this method has some disadvantages, for example, complicated manipulation and environmental or container pollution. Moreover, colchicine is some toxic, and large amount of application is not cost effective. The purposes of this study were to develop a simple, safe and efficient method for chromosome doubling of wheat haploid plants, and to evaluate a chemical that is suitable for the replacement of colchicine for chromosome doubling in wheat. 【Method】The haploid wheat plants were obtained by anther culture for wheat line Fielder, and by crossing with the maize inbred line Zheng58 for wheat cultivars/lines Kenong199, Xinchun9, Chinese Spring and CB037chromosome elimination. Wheat line Chinese Spring was also crossed with rye line Gansu Heimai to produce wheat-rye double haploid plants. Chromosome doubling of different wheat haploid plants was conducted using the colchicine solutions at the concentrations of 0, 5, 10, and 20 mmol·L-1through tiller node adding after transplanting, leaf painting after transplanting, and medium surface adding before transplanting. Additionally, the supplement of amiprophos-methyl, trifluralin, and propyzamide at the concentrations of 0, 30, 60 and 120 μ·L-1on medium surface adding was used to double chromosomes of the wheat haploid plants and the wheat-rye double haploid plants. The efficiency of chromosome doubling by different treatment methods was compared and the optimal concentrations of different chemicals were determined. 【Result】Results indicated that the application of different concentrations of colchicine (0, 5, 10, and 20 mmol·L-1) by tiller node adding couldn’t be able to double the wheat haploid plants from the cross of wheat and maize, so it is not useful in chromosome doubling of wheat haploid plants. A doubling frequency of 7.7% was found when 10 mmol·L-1colchicine was applied by leaf painting for the wheat haploid plants from maize pollen induction at jointing stage, but no haploid plant was doubled with other three concentrations of colchicine solutions, suggesting that this treatment method was also not useful for the doubling of the wheat haploid plants. The frequencies of chromosome doubling for the wheat haploid plants generated from anther culture treated with the four colchicine concentrations by medium surface adding were 26.7%, 42.9%, 73.3%, and 85.7%, respectively. It is demonstrated that the supplement of colchicine solution on medium surface adding resulted in the highest efficiency of chromosome doubling for the wheat haploid plants and the optimal concentration is at least 20 mmol·L-1. The frequency of chromosome doubling for the haploid plants generated from the cross of wheat and maize by medium surface adding of propyzamide at the concentrations of0, 30, 60, and 20 μ·L-1was0, 0-57.1%, 28.6%-75.0%, and 0-100%. however, the other two herbicides used by this method were not effective in chromosome doubling. The frequency of chromosome doubling by medium surface adding of 120 μ·L-1propyzamide for the wheat-rye double haploid plants was 9.0%. No seed was produced by the other three concentrations of propyzamide and the other three agents (amiprophos-methyl, trifluralin, and colchicine). 【Conclusion】It is concluded that propyzamide at the concentration of 60-120 μ·L-1produced promising results of chromosome doubling for the wheat haploid plants. The medium surface adding of colchicine and propyzamideat appropriate concentrations is effective and easily adopted to double chromosomes of wheat haploid plants.

wheat; haploid plants; distant hybridization; anther culture; doubling agents

2017-09-12；

2017-12-28

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2016YFD0102001）、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程

尹米琦，Tel：010-8210-5173；E-mail：yinmiqi@sohu.com。張雙喜，Tel：0956-84001033；E-mail：shxzhang@163.com。尹米琦和張雙喜為同等貢獻(xiàn)作者。

葉興國(guó)，Tel：010-8210-5173；E-mail：yexingguo@caas.cn