魏新燕，黃媛媛，黃亞麗，杜克久

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甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌BH21對葡萄灰霉病菌的拮抗作用

魏新燕1，黃媛媛2，黃亞麗2，杜克久1

（1河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院/國家北方山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，河北保定 071001；2河北省科學(xué)院生物研究所，石家莊 050051）

【目的】甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（）BH21是一株對葡萄灰霉病菌（）有較好拮抗作用的海洋源細(xì)菌，鑒定該菌株脂肽類抗菌物質(zhì)合成基因，檢測脂肽粗提物對葡萄灰霉病菌的拮抗作用，為應(yīng)用該菌株防治葡萄灰霉病提供科學(xué)依據(jù)。【方法】通過特異引物的基因組PCR法檢測甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌BH21菌株合成脂肽的能力；鹽酸沉淀和甲醇抽提法從無菌發(fā)酵液中提取脂肽粗提物；排油圈法檢測脂肽粗提物的表面活性；采用菌絲生長速率法檢測脂肽粗提物對灰霉病菌菌絲生長的抑制作用并計(jì)算有效中濃度EC50；利用高效液相色譜技術(shù)（HPLC）對脂肽粗提物洗脫分離，并采用菌絲生長速率法檢測各組分對葡萄灰霉病菌的抑制能力；采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）分析主要抑菌成分的脂肽類型。采用離體葉片接種法檢測脂肽粗提物對葡萄灰霉病的防治效果?！窘Y(jié)果】選取11對特異引物對菌株BH21基因組擴(kuò)增，其中7對引物擴(kuò)增出預(yù)期核酸片段；擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序、BLAST比對分析，結(jié)果顯示擴(kuò)增產(chǎn)物與相關(guān)菌株脂肽基因相似度為96%—99%，擴(kuò)增產(chǎn)物翻譯的蛋白與相關(guān)菌株的脂肽合成蛋白相似度為96%—100%，表明甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌BH21基因組中含有、、、，該菌株具有合成surfactin、iturin及fengycin等多種脂肽類抗菌物質(zhì)的能力。鹽酸沉淀和甲醇抽提從LB無菌發(fā)酵液中獲得脂肽粗提物，得率為428 mg·L-1。排油圈檢測結(jié)果顯示，脂肽粗提物使橄欖油膜形成排油圈，表明脂肽粗提物具有表面活性。脂肽粗提物對葡萄灰霉病菌菌絲生長具有顯著的抑制作用，脂肽粗提物濃度為440 μg·mL-1時(shí)，對葡萄灰霉病菌菌絲生長的相對抑制率為82.8%。根據(jù)毒力方程計(jì)算，抑制葡萄灰霉病菌菌絲生長的脂肽粗提物EC50為144.39 μg·mL-1。HPLC分離純化脂肽粗提物獲得6個(gè)組分，只有組分BH21-2和BH21-3抑制葡萄灰霉病菌的生長，RP-HPLC色譜圖分析表明組分BH21-2和BH21-3屬于fengycin家族脂肽。葡萄灰霉病離體葉片試驗(yàn)結(jié)果表明，脂肽粗提物濃度為400 μg·mL-1時(shí)，對葡萄葉片灰霉病防病效果為100%；脂肽粗提物濃度為220 μg·mL-1時(shí)，對葡萄葉片病斑擴(kuò)展相對抑制率為94.4%?！窘Y(jié)論】甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌菌株BH21具有合成surfactin、iturin及fengycin等多種脂肽類抗菌物質(zhì)的基因，該菌株脂肽粗提物對葡萄灰霉病菌具有較強(qiáng)的拮抗作用，在葡萄灰霉病生物防治中具有應(yīng)用潛力。

甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌；葡萄灰霉病菌；抗真菌活性；脂肽；葡萄灰霉病

0 引言

【研究意義】葡萄灰霉病是由灰葡萄孢（）引起的真菌病害，不僅在生長期危害，也是葡萄采后重要病害之一[1]。隨著化學(xué)農(nóng)藥的長期、大量使用，其防控效果因葡萄灰霉病菌產(chǎn)生抗藥性而降低，積極開發(fā)微生物農(nóng)藥具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值[1-2]。甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（）是芽孢桿菌屬的一個(gè)新成員[3]，是植物根際促生菌，也是植物病害生物防治中重要組成部分[4-6]。甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌BH21分離自滄州渤海海域，前期研究表明該菌株的無菌發(fā)酵液對葡萄灰霉病菌有較強(qiáng)的抑制作用（另文發(fā)表），明確其抑菌活性物質(zhì)對該菌在灰霉病生物防治上的應(yīng)用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】伏波等[7]研究表明，小麥內(nèi)生細(xì)菌枯草芽孢桿菌（）Em7對葡萄灰霉病菌有良好的抑制作用，離體果實(shí)相對防治效果為78.92%；周泠璇等[8]從紅提葡萄中分離得到5株對葡萄灰霉病菌有較好拮抗作用的內(nèi)生菌，其中內(nèi)生菌枯草芽孢桿菌NR4-1對葡萄灰霉病菌抑菌效果最強(qiáng)，抑菌率為68.7%；Ge等[9]從長白山休眠火山土壤中分離到一株甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌NKG-1，其不僅對番茄幼苗灰霉病具有60%的防治效果，且對番茄植株具有促生作用。芽孢桿菌產(chǎn)生多種抗菌化合物，其中環(huán)脂肽（LPs）是一類具有表面活性劑特性的抗菌物質(zhì)，主要包括伊枯草菌素（iturin）、豐原素（fengycin）和表面活性素（surfactin）等3大類，具有抑菌、促生、誘導(dǎo)防御酶活性等特點(diǎn)[10]。Mora等[11]對64株芽孢桿菌進(jìn)行了脂肽基因鑒定，結(jié)果表明48.4%的菌株含有2—4個(gè)脂肽基因，環(huán)脂肽是拮抗芽孢桿菌的主要抑菌活性物質(zhì)；向亞萍等[12]對55株拮抗芽孢桿菌分泌的脂肽抗生素的定性定量分析結(jié)果表明，芽孢桿菌脂肽類抗生素是抑制植物病原真菌的主要成分，具有多樣性；iturin結(jié)構(gòu)的變化及其分泌量與抑菌活性有相關(guān)性；呂倩等[13]從南海沉積樣品中分離出甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌SHB114，其主要抗菌物質(zhì)為iturin的bacillomycin Lc脂肽化合物；Liu等[14]發(fā)現(xiàn)從堿蓬根際分離的海洋芽孢桿菌（）B-9987產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)是脂肽類物質(zhì)，其中Marinhysin A是一種新結(jié)構(gòu)的環(huán)脂肽類化合物；李德全等[15]驗(yàn)證海藻中分離的枯草芽孢桿菌NH-8拮抗草莓灰霉病的主要活性物質(zhì)為iturin。【本研究切入點(diǎn)】目前，灰霉病的生物防治研究主要集中在番茄[16-17]等草本植物，葡萄等木本植物灰霉病的生物防治研究相對較少，生防微生物大多來自陸生環(huán)境，海洋源甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌在葡萄灰霉病防治中的應(yīng)用鮮有報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】鑒定甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌BH21菌株脂肽類抗菌物質(zhì)合成基因，檢測脂肽粗提物對葡萄灰霉病菌的拮抗作用，推測有效活性成分的脂肽類別，為防控植物灰霉病提供依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2016年在河北省科學(xué)院生物研究所和河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林木病理實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1 供試材料

灰霉病菌菌株B-20由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)從罹病葡萄葉片上分離、鑒定，在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)和保存。

拮抗芽孢桿菌BH21菌株分離于滄州渤海灣海洋樣品，經(jīng)形態(tài)特征、生理生化、16S rDNA和基因序列分析，鑒定為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌，保藏于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物菌種保藏中心（CGMCC No. 11840）。該菌株具有耐高鹽、高濃度甲醇的特性，對灰霉菌具有較強(qiáng)的拮抗作用。BH21菌株菌懸液與25%甘油按1﹕1比例混合，保存于-80℃超低溫冰箱。

供試葡萄品種為維多利亞（Victoria），采自河北省衡水市饒陽縣。

PDA培養(yǎng)基[8]、LB培養(yǎng)基[18]、ZoBell’s 2216E培養(yǎng)基[19]：蛋白胨5 g，酵母膏1 g，F(xiàn)ePO40.1 g，瓊脂粉12 g，陳海水定容至1 L，pH 7.6。

1.2 菌株培養(yǎng)

將保存于4℃的灰霉病菌以菌餅接種于PDA培養(yǎng)基平板中心，（23±1）℃黑暗培養(yǎng)5 d，備用。用接種環(huán)取一環(huán)保存于-80℃冰箱的BH21菌株，接種于ZoBell’s 2216E培養(yǎng)基，（23±1）℃黑暗培養(yǎng)24 h，活化備用。

1.3 芽孢桿菌產(chǎn)脂肽基因檢測

根據(jù)Cao等[20]方法，分別合成ituA1F/ituA1R、bamB1F/bamB1R、bamC2F/bamC2R、ITUCF1/ITUCR3、ituD2F/ituD2R、FenB1F/FenB1R、FNDF1/FNDR1、110F/110R、Sbo1F/Sbo1R、Qk1F/Qk1R和147F/147R等11對引物，并按照各引物擴(kuò)增程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為25 μL：10×PCR Buffer 2.5 μL，2.5 mmol·L-1dNTP 2.0 μL，Taq DNA聚合酶1.25 U，DNA模板（菌懸液）1.0 μL，25 μmol·L-1上下游引物各0.5 μL，加ddH2O至總體積25 μL。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳，染色劑為GoldView。凝膠成像系統(tǒng)GDS-8000檢測，并記錄檢測結(jié)果。將瓊脂糖凝膠電泳檢測符合要求的PCR產(chǎn)物交由上海立菲生物技術(shù)有限公司純化測序。將所得核酸序列通過NCBI的比對工具BLAST進(jìn)行在線比對。

1.4 脂肽粗提物的提取和表面活性檢測

菌株BH21培養(yǎng)：LB培養(yǎng)基、100 mL/250 mL三角瓶裝量、28℃、180 r/min恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)72 h。發(fā)酵液經(jīng)8 000 r/min離心20 min，取上清發(fā)酵液用孔徑為0.22mm無菌過濾器過濾，獲得無菌發(fā)酵液。采取鹽酸沉淀和甲醇抽提法從無菌發(fā)酵液中獲得脂肽粗提物[13]。采用排油圈法[21]檢測粗提物表面活性。將粗提物配置成10 mg·mL-1的甲醇溶解液，用孔徑為0.22mm無菌過濾器過濾。取適量橄欖油，加入蘇丹黑Ⅲ染色劑，混勻。取直徑9 cm的潔凈培養(yǎng)皿，加入60 mL純凈水，緩慢加入染色的橄欖油使水面形成一層油膜。用移液器吸取脂肽粗提物的甲醇溶解液，向培養(yǎng)皿油膜中心持續(xù)滴加，看有無排油圈形成。以滴加甲醇的為對照。

1.5 脂肽粗提物對葡萄灰霉病菌菌絲生長的影響

采用菌絲生長速率法[8]測定脂肽粗提物的生物活性。用無菌水配置成初濃度為22 mg·mL-1的脂肽溶液，并將該水溶液加入融化的PDA培養(yǎng)基中制成脂肽濃度為440、220、110、55 μg·mL-1的脂肽平板，以加等量無菌水的PDA平板為對照。在平板中央接種直徑為8 mm的灰霉病菌菌塊，每處理重復(fù)3次，23℃培養(yǎng)4 d。采用十字交叉法測量菌落直徑，計(jì)算抑制率。相對抑制率（%）=[（對照菌落直徑-脂肽粗提物處理菌落直徑）/對照菌落直徑]×100。根據(jù)濃度對數(shù)（）與菌落生長相對抑制率的概率值（），利用Excel軟件求取脂肽粗提物對灰霉病菌菌絲生長的毒力回歸方程=a+b和相關(guān)系數(shù)（），并計(jì)算抑制菌落生長的有效中濃度EC50。

1.6 脂肽粗提物對離體葡萄葉片灰霉病的防治效果

采用離體組織接種法[22]，用無菌水分別制成440、220、110、55、27.5 μg·mL-1的脂肽溶液。選取大小相近葡萄健康葉片，分別用不同濃度的脂肽溶液將葡萄葉片兩面浸濕5 min，晾干，以無菌水處理的葡萄葉片為對照。在葉片正面的3個(gè)不同部位接種直徑為0.8 cm的灰霉病菌菌餅（培養(yǎng)7 d，具有大量孢子）。22℃保濕4 d，記錄發(fā)病情況及病斑直徑，利用SPSS軟件分析防治效果。

1.7 脂肽粗提物洗脫分離及抑菌檢測

1.7.1 脂肽粗提物洗脫分離 采用高效液相色譜進(jìn)行BH21產(chǎn)生的脂肽物質(zhì)的洗脫分離，色譜柱為TricornTM10/300 column；流動(dòng)相：A液95%去離子水，5%乙腈，0.1%三氟乙酸，B液5%去離子水，95%乙腈，0.1%三氟乙酸；洗脫條件：0.1% HFA乙腈，0→100% 線性洗脫120 min；檢測波長：215 nm；流速：3 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 mL；柱溫：室溫。使用之前將A液和B液超聲處理30 min，以去除液體中的氣泡。

1.7.2 分離物各組分對灰霉病菌的抑制作用 根據(jù)各組混合物洗脫時(shí)，A液和B液所占比例，配置相對應(yīng)的洗脫液（均值）作為對照。采用瓊脂擴(kuò)散法檢測分離物各組分對灰霉病菌的抑制作用。具體操作：向PDA平板中央接種直徑為8 mm的灰霉病菌菌餅，距中心3 cm處打孔，分別加入50 μL洗脫液和相對溶劑，（23±1）℃黑暗培養(yǎng)。

1.7.3 脂肽分離物有效組分分析 將對灰霉病菌有抑制作用的脂肽分離物通過反相高效液相色譜分析。色譜柱：waters Xbridge Peptide BEHC18，300 A，5 μm；流動(dòng)相：0.1% HFA Water，0.1% HFA乙腈；洗脫條件：0.1% HFA乙腈，0→100% 梯度洗脫80 min；檢測波長：215 nm；流速：1 mL·min-1；進(jìn)樣量：1 mL；柱溫：30℃。

2 結(jié)果

2.1 BH21菌株脂肽基因的檢測

2.1.1 Iturin合成的相關(guān)基因序列分析 引物ituA1F/ituA1R、bamB1F/bamB1R、ITUCF1/ITUCR3和ituD2F/itud2R的PCR分別得到880、512、560、643 bp核酸片段，與Cao等[20]報(bào)道的大小相近。Nucleotide blast工具分析結(jié)果表明，4對引物獲得的核酸序列分別與inturin合成基因、、、相關(guān)，與相關(guān)菌株相似度為97%—99%（表1）。核酸序列產(chǎn)物分別為iturin A合成酶A、bacillomycin D合成蛋白BmyB、iturin A合成酶C、D，與相關(guān)菌株相似度為96%—98%。

2.1.2 Fengycin合成的相關(guān)基因序列分析 引物FNDF1/FNDR1擴(kuò)增獲得288 bp核酸片段，Nucleotide blast工具分析結(jié)果表明，此核酸片段與解淀粉芽孢桿菌（subsp.）SQR9的相似度為99%（表1），其產(chǎn)物是fengycin合成酶FenD。FNDF1/FNDR1擴(kuò)增產(chǎn)物翻譯的蛋白序列與枯草芽孢桿菌MBI600FenD蛋白序列的相似度為100%。

2.1.3 Sufactin合成的相關(guān)基因序列分析 引物110F/110R擴(kuò)增獲得307 bp核酸片段，此核酸片段與解淀粉芽孢桿菌SQR9的相似度為96%（表1），其產(chǎn)物是sufactin合成酶SrfAB。110F/110R擴(kuò)增產(chǎn)物翻譯的蛋白序列與枯草芽孢桿菌SQR9的SrfAB蛋白序列相似度為96%。

表1 PCR產(chǎn)物核酸序列與相關(guān)基因的相似度

2.1.4 假定蛋白YndJ合成的相關(guān)基因序列分析 引物147F/147R擴(kuò)增獲得215 bp核酸片段，此核酸片段與枯草芽孢桿菌SQR9的相似度為99%（表1），其產(chǎn)物是假定蛋白合成酶YndJ。擴(kuò)增產(chǎn)物翻譯的蛋白序列與枯草芽孢桿菌SQR9的YndJ蛋白序列相似度為96%。

2.2 脂肽粗提物的提取和表面活性檢測

采用鹽酸沉淀和甲醇抽提法從菌株BH21發(fā)酵液中提取脂肽粗提物，冷凍干燥后確定該粗提物的得率為428 mg·L-1。滴加該粗提物的甲醇溶解液可以在橄欖油油膜上形成排油圈，而甲醇對照則不能產(chǎn)生排油圈，進(jìn)一步驗(yàn)證該提取物為脂肽類物質(zhì)，具有較強(qiáng)的表面活性。

2.3 BH21脂肽粗提物對葡萄灰霉病菌菌絲生長的抑制作用

葡萄灰霉病菌菌塊在含不同濃度BH21脂肽粗提物的PDA培養(yǎng)基上23℃培養(yǎng)4 d后，與對照相比，試驗(yàn)濃度的BH21脂肽物質(zhì)均對灰霉病菌菌絲生長有一定的抑制作用，而且隨著脂肽濃度的增加，菌絲生長受到的抑制作用增強(qiáng)，其中440 μg·mL-1脂肽物質(zhì)對灰霉病菌菌絲生長的抑制率為82.8%（表2）。根據(jù)濃度對數(shù)（）與菌落生長相對抑制率的概率值（），菌株BH21脂肽粗提物對灰霉菌菌絲生長抑制的毒力方程為=1.097+3.1157，相關(guān)系數(shù)（2=0.921），根據(jù)此方程計(jì)算菌株BH21產(chǎn)生的脂肽類混合物對灰霉病菌菌絲抑制的EC50為144.39 μg·mL-1。

表2 BH21脂肽粗提物對灰霉病菌菌絲生長的抑制作用

2.4 BH21脂肽粗提物對離體葡萄葉片灰霉病的防治效果

采用不同濃度的BH21脂肽粗提物稀釋液處理葡萄葉片，保濕培養(yǎng)4 d后進(jìn)行灰霉病病斑的測定（圖1、表3）。與對照相比，不同濃度的脂肽粗提物稀釋液對葡萄葉片灰霉病都有明顯防治效果，脂肽粗提物濃度越高，病斑直徑越小，其中濃度為440 μg·mL-1的BH21脂肽溶液的防治效果最好，接種部位不發(fā)病。根據(jù)病斑直徑計(jì)算BH21脂肽粗提物對灰霉病病斑擴(kuò)展相對抑制率為32.8%—100%，防治效果顯著（表3）。

1: 440 μg·mL-1; 2: 220 μg·mL-1; 3: 110 μg·mL-1; 4: 55 μg·mL-1; 5: 27.5 μg·mL-1

表3 BH21脂肽粗提物對離體葡萄葉片灰霉病病斑數(shù)和病斑擴(kuò)展的影響

同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示在＜0.05水平差異顯著

Data with different lowercases in the same column indicate significant difference at＜0.05 level

2.5 菌株BH21脂肽粗提物的分離及抑菌效果檢測

2.5.1 脂肽粗提物洗脫分離 根據(jù)制備型液相色譜的峰值，BH21脂肽粗提物中共有6個(gè)明顯的單峰，根據(jù)峰值共收集了6個(gè)樣品，依據(jù)收集順序分別命名為組分1、組分2、……、組分6。根據(jù)各峰出現(xiàn)時(shí)洗脫液的成分比例，計(jì)算得到相應(yīng)洗脫液的平均值（表4）。

2.5.2 各組分對灰霉病菌生長的抑制作用 接種培養(yǎng)4 d后，各組分及其相對應(yīng)的洗脫液對灰霉菌菌絲的生長均有一定的抑制作用，并且洗脫液的揮發(fā)也使灰霉病菌生長受到抑制。組分1、4、5、6與其相對應(yīng)的洗脫液1、4、5、6對灰霉菌絲的抑制作用基本相同，說明這4個(gè)成分無抑菌活性。組分2和組分3對灰霉菌抑制作用明顯大于其相應(yīng)的緩沖液（圖2），其中組分2的抑菌帶寬度為（6.3±0.6）mm，組分3的抑菌帶寬度為（2.8±0.3）mm，由此判斷組分2和組分3在菌株BH21對灰霉病菌的拮抗中起主要作用，且組分2的抑菌活性大于組分3，將這兩個(gè)活性成分分別命名為BH21-2和BH21-3。

圖2 脂肽粗提物分離物對灰霉病菌的拮抗活性

2.5.3 脂肽粗提物分離物BH21-2和BH21-3的反相高效液相色譜檢測 將組分BH21-2和BH21-3分別進(jìn)行RP-HPLC檢測，結(jié)果表明組分BH21-2、BH21-3保留時(shí)間范圍分別在43—51、48—55 min，兩個(gè)組分各包含多個(gè)小峰，兩者之間還有部分重疊（圖3）。此出峰時(shí)間與相似條件下fengycin類脂肽出峰時(shí)間相符（34—56 min）[30]，因此推斷組分BH21-2和BH21-3均為fengycin類脂肽。

圖3 BH21-2和BH21-3反相高效液相色譜圖

3 討論

灰霉病生防菌株的篩選一直是灰霉病安全防控研究的重點(diǎn)，隨著陸地拮抗微生物篩選和研究的深入，人們將目光轉(zhuǎn)向生境獨(dú)特的海洋微生物資源[31]。高偉等[32]研究發(fā)現(xiàn)，從渤海潮間帶鹽生植物堿蓬根際分離的海洋芽孢桿菌B-9987對番茄灰霉病具有良好的拮抗作用；李德全等[15]從南通近海海藻中分離到枯草芽孢桿菌NH-8，該菌能夠增強(qiáng)草莓系統(tǒng)抗性，促進(jìn)草莓植株生長。然而，由于活體微生物資源的應(yīng)用效果受外界條件影響較大，對拮抗菌株所產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)的分離、鑒定具有更為重要的意義。其中脂肽是芽孢桿菌產(chǎn)生的一類重要抑菌活性物質(zhì)，呂倩等分別從海洋細(xì)菌發(fā)酵液中獲得了具有抑菌活性的bacillomycin Lc和Marinhysin A等脂肽類物質(zhì)[13-14]。李德全等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，海洋枯草芽孢桿菌NH-8中的主要抗菌物質(zhì)為iturin，其粗提物對灰霉菌的抑菌率為82.7%。本研究的拮抗菌株BH21是從滄州渤海灣海洋樣品中分離的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌，其菌體和無菌發(fā)酵液對灰霉病菌均具有較強(qiáng)的拮抗作用，表明該菌株具有產(chǎn)生胞外抑菌物質(zhì)的能力，初步研究表明該發(fā)酵液具有明顯的表面活性，推測該菌產(chǎn)生的活性物質(zhì)有可能為脂肽類物質(zhì)（另文發(fā)表）。

本研究采用鹽酸沉淀和甲醇抽提的方法進(jìn)行BH21發(fā)酵液中的脂肽類物質(zhì)的分離，通過平板和離體葉片試驗(yàn)方法測定了不同濃度脂肽粗提物對灰霉病菌生長和葉面病害的防治能力。離體試驗(yàn)是能夠快速、準(zhǔn)確反應(yīng)菌株拮抗效果的試驗(yàn)方法，在拮抗菌株和抑菌物質(zhì)篩選中多被采用[33-34]。本研究為了盡快確定BH21脂肽類粗提物的抑菌效果，采用葡萄離體葉片測定了脂肽粗提物對灰霉病的防治效果，在接種灰霉菌塊的情況下，不同濃度的粗提物均對灰霉病有良好的防治作用，400 μg·mL-1稀釋液對離體葡萄葉片的灰霉病防治效果為100%、55 μg·mL-1時(shí)的防治效果為55.0%，防病效果好于相關(guān)研究結(jié)果[15]。

對菌株產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步純化和鑒定是明確菌株拮抗機(jī)理的基礎(chǔ)，對菌株脂肽類合成基因的檢測可以確定菌株存在何種物質(zhì)的合成能力。研究發(fā)現(xiàn)，脂肽類物質(zhì)主要包括surfactin、iturin和fengycin等3大類，隨著對這些物質(zhì)合成基因研究的深入，研究者設(shè)計(jì)出多對特異性引物以進(jìn)行菌株脂肽類物質(zhì)的合成能力和種類的測定[35]。Cao等[20]應(yīng)用已發(fā)表和自己設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，鑒定出枯草芽孢桿菌SQR9中含有、、、、、、、和等9個(gè)脂肽合成基因；Mora等[11]則利用特異引物探針篩選出具有脂肽合成基因的拮抗菌株。本研究采用PCR方法并利用11對特異引物檢測菌株BH21中是否存在脂肽物質(zhì)的合成基因，確定菌株BH21含有、、、、、和，推測該菌株具有合成多種脂肽類物質(zhì)的能力。此外，在選擇的11對引物中只有7對引物擴(kuò)增出與目標(biāo)大小相近的產(chǎn)物，未得到擴(kuò)增產(chǎn)物的4對引物分別為Sbo1F/Sbo1R（枯草芽孢桿菌素的）、FenB1F/ FenB1R（豐原素的）、bamC2F/bamC2R（芽孢菌霉素的）、Qk1F/Qk1R（枯草桿菌蛋白酶）。這4對引物雖多次調(diào)整擴(kuò)增程序或始終無擴(kuò)增產(chǎn)物或產(chǎn)生非特異性片段，推測其沒有特異產(chǎn)物的原因，其一可能由于菌株BH21沒有相似的基因序列，也可能是基因序列與特異引物不匹配，而后者則有可能是由于海洋細(xì)菌中含有特異成分所引起的。

那么，菌株BH21發(fā)酵液的甲醇粗提物中拮抗灰霉病菌的脂肽物質(zhì)有幾類呢？本研究通過制備型HPLC進(jìn)行了脂肽粗提物的分離，并將不同出峰時(shí)間的脂肽分離物進(jìn)行抑制灰霉病菌的活性驗(yàn)證。對峙試驗(yàn)結(jié)果表明組分2和組分3具有明顯的抑菌活性，其中組分2抑菌能力最強(qiáng)。反相高效液相色譜圖顯示組分2和組分3與fengycin類脂肽[29]出峰時(shí)間相符合，特異引物PCR也驗(yàn)證菌株BH21含有fengycin類脂肽合成基因。然而，組分2和組分3中均含有多個(gè)小峰，其分子結(jié)構(gòu)仍需采用核磁共振等方法進(jìn)行鑒定。另外，其他4種組分的功能性質(zhì)、菌株所具有的iturin和surfactin類脂肽合成基因是否表達(dá)需要進(jìn)一步研究。

甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌SHB114[13]是來自南海深海沉積物的一株對黃瓜炭疽病菌（）有較強(qiáng)抑制作用的生防菌株，其產(chǎn)生的脂肽為iturins類的bacillomycin LC。本文的菌株BH21同樣是一株海洋源甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌，其對葡萄灰霉病菌有效的活性成分是fengycin類脂肽，不僅為葡萄灰霉病的生物防控提供了備選資源，同時(shí)也擴(kuò)展了海洋源甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的抑菌范圍。

4 結(jié)論

來自海洋環(huán)境的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌菌株BH21具有產(chǎn)生多種抗菌脂肽的潛力，發(fā)酵液脂肽粗提物對葡萄灰霉病菌具有較強(qiáng)的拮抗作用，其有效活性成分為fengycin類脂肽，在葡萄灰霉病生物防治中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

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（責(zé)任編輯 岳梅）

Antagonism ofstrain BH21 to

WEI XinYan1, HUANG YuanYuan2, HUANG YaLi2, DU KeJiu1

(1College of Forestry, Hebei Agricultural University/National Engineering Research Center for Agriculture in Northern Mountainous Areas, Baoding 071001, Hebei;2Institute of Biology, Hebei Academy of Sciences, Shijiazhuang 050051)

【Objective】strain BH21 is a marine derived bacterium that has a good antagonistic effect on. The objective of this study is to identify the lipopeptide synthesis genes of the strain BH21 and investigate the antagonism of the crude extracts of lipopeptide to, and to provide a scientific basis for the prevention and control of. 【Method】To determine the mechanisms of the antagonistic strain, PCR was used to screen strain BH21 for genes involved in biosynthesis of antimicrobial lipopeptide. Crude lipopeptide was extracted from the culture broth by hydrochloric acid precipitation and methanol extraction. surface activity of the crude lipopeptide was determined by oil spreading method. The inhibition ability of the crude lipopeptide on mycelial growth ofwas investigated by mycelial growth rate method and EC50was calculated. The crude lipopeptide was separated by liquid chromatography (HPLC) and the inhibition ability of each component towas detected by the mycelium growth rate method. Reversed phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) was used to analyze the types of the main antifungal components. the effect of the crude lipopeptide on the control ofin grape was detected by tissue inoculation. 【Result】A total of 11 pairs of specific primers were used for genomic amplification of strain BH21, and 7 gene fragments of the size expected to be correlated with biocontrol activities were efficiently amplified. after amplification, sequencing and BLAST analysis, the results showed that the similarity between the amplified products and the related lipopeptide genes was 96%-99%, the similarity between the protein produced by the nucleic acid fragment and the lipopeptide synthesized protein of the related strain was 96%-100%, which showed that the genome of strain BH21 contained,,,,,andgenes and the strain had the ability to synthesize antimicrobial lipopeptide such as surfactins, iturins and fengycins. Antifungal lipopeptide produced by BH21 was extracted by hydrochloric acid precipitation and methanol extraction, and the yield was 428 mg·L-1. The results of the oil spreading test showed that the crude lipopeptide had surface activity. The crude lipopeptide significantly inhibited mycelial growth ofwhen theconcentration was 440 μg·mL-1, the relative inhibition rate of mycelial growth ofwas 82.8%, and the effective medium concentration EC50was 144.39 μg·mL-1. Six fractions were collected with elution time through HPLC, only BH21-2 and BH21-3 inhibited the growth of. RP-HPLC chromatogram analysis showed that the components BH21-2 and BH21-3 belong to the fengycin family. Grape leaftest results showed that when the concentration of crude lipopeptide was 440 μg·mL-1,the control effect againstgrapegray leaf spot was 100%, while the concentration was 220 μg·mL-1, the relative inhibitory rate of grape leaf lesion was 94.4%.【Conclusion】The strain BH21 has the genes for synthesizing antimicrobial lipopeptide such as surfactins, iturins and fengycins, and the lipopeptide extracted from this strain has strong antagonism to, so it has potential application in the biological control of.

;; antifungal activity; lipopeptide; grapegray mold

2017-07-31；

2017-10-06

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2016YFC0501303）、河北省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃重點(diǎn)基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（15962904D）

魏新燕，E-mail：bdweixinyan@163.com。

黃亞麗，Tel：0311-83014618；E-mail：huangyali2291@163.com。通信作者杜克久，Tel：0312-7528491，E-mail：dukejiu@126.com