曾永秦，逄曉莉，汪 笛，李 蓓，樊立娜，郝 禹，李國立，杜 娟，趙紅心

1 NK細(xì)胞的表型及功能

NK細(xì)胞占外周血淋巴細(xì)胞總數(shù)的10%～15%[1]26。NK細(xì)胞由造血干細(xì)胞發(fā)育而來，其比例以肺＞肝臟＞外周血＞脾臟＞骨髓＞淋巴結(jié)＞胸腺的順序分布，總數(shù)以脾臟＞肺＞骨髓＞外周血＞淋巴結(jié)＞肝臟＞胸腺的順序分布[2]。人與小鼠的NK細(xì)胞有所區(qū)別。根據(jù)CD27/CD11b的表達(dá)，可將小鼠NK細(xì)胞的發(fā)育分成CD11bloCD27lo，CD11bloCD27hi，CD11bhiCD27hi，CD11bhiCD27lo4個發(fā)育階段。而應(yīng)用CD117、CD161、NKp46、CD56 4種抗體，可將人類NK細(xì)胞的發(fā)育粗略分為CD117+CD161-NKp46-CD56-，CD117+CD161+NKp46+CD56-，CD117-CD161-NKp46+CD56+[1]27-283個階段。成熟階段的NK細(xì)胞又可根據(jù)表面分子CD56、CD16表達(dá)密度的不同分為 CD56dimCD16+、CD56brightCD16-、CD56negCD16+3個亞群[3-5]。CD56dimCD16+NK細(xì)胞亞群占外周血NK細(xì)胞的90%，可介導(dǎo)抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC），胞內(nèi)顆粒成分多，以殺傷功能為主；CD56brightCD16-NK細(xì)胞亞群占外周血NK細(xì)胞的10%，是次級淋巴器官中的主要NK細(xì)胞亞群，以分泌細(xì)胞因子為主；而正常人外周血中檢測不到或僅有極少量的CD56negCD16+NK細(xì)胞亞群，且體外研究發(fā)現(xiàn)，該NK細(xì)胞亞群的殺傷能力及細(xì)胞因子分泌能力均低于前兩群[6-7]。

NK細(xì)胞兼具殺傷功能與細(xì)胞因子分泌功能。NK細(xì)胞的功能通過細(xì)胞表面表達(dá)的多種受體實現(xiàn)自我調(diào)節(jié)控制[8-9]。NK細(xì)胞表面表達(dá)如黏附分子、趨化因子受體、細(xì)胞因子受體、NK細(xì)胞受體等多種分子，從功能角度可將NK細(xì)胞表面受體分為活化性受體和抑制性受體，NK細(xì)胞抑制性信號與活化信號之間的平衡決定了NK細(xì)胞與靶細(xì)胞的相互作用。正常情況下，靶細(xì)胞表面自身主要組織相容性復(fù)合物（major histocompatibility complex,MHC）I類分子與NK細(xì)胞表面抑制性受體結(jié)合產(chǎn)生抑制信號，抑制NK細(xì)胞活化，保護(hù)靶細(xì)胞免受NK細(xì)胞攻擊[10]。病理情況下，兩種受體間的平衡被打破，NK細(xì)胞可對靶細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用[11]?；罨允荏w包括天然細(xì)胞毒受體、NKG2家族分子如NKG2D及殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體（killer cell immunoglobulin-like receptor, KIR）-S（短型），抑制性受體家族包括NKG2A和KIR-L（長型），其中KIR2DL同時具有活化和抑制的潛能[12]。

識別靶細(xì)胞后，NK細(xì)胞對其發(fā)揮殺傷功能的方式也有3種。①通過NK細(xì)胞胞漿含有的顆粒成分，包括一些蛋白質(zhì)如穿孔素和蛋白酶如顆粒酶直接裂解靶細(xì)胞[13]；②通過NK細(xì)胞表達(dá)的Fc段受體（CD16）識別與抗原結(jié)合的抗體，進(jìn)而釋放細(xì)胞溶解顆粒發(fā)揮ADCC[14]；③通過一些細(xì)胞因子如IL-12、IL-15、IL-18、IL-2和趨化因子受體5等誘導(dǎo)NK細(xì)胞分泌IFN-γ和TNF-α來控制病毒感染（IFN-γ可以激活巨噬細(xì)胞進(jìn)行吞噬和裂解，TNF-α可以直接促進(jìn)NK細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷）。

2 NK細(xì)胞的耗竭

NK細(xì)胞在HIV感染和進(jìn)展中起著重要作用，在對NK細(xì)胞功能的研究中，NK細(xì)胞功能的耗竭是其中一個研究熱點。耗竭通常用于描述免疫細(xì)胞功能障礙的狀態(tài)，其特征為免疫細(xì)胞效應(yīng)功能降低。目前，對于T細(xì)胞的耗竭狀態(tài)研究較多，其具有以下特點：耗竭伴隨著表型變化[15]，表觀遺傳修飾[15]和轉(zhuǎn)錄譜的改變[16]，有多種負(fù)調(diào)節(jié)途徑參與T細(xì)胞的耗竭[17]，例如，免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和程序性細(xì)胞死亡蛋白-1（programmed death-1,PD-1）。這些對研究NK細(xì)胞的耗竭提供了思路。例如，①在腫瘤患者中， PD-1在NK細(xì)胞上表達(dá)增多，而 PD-1的過表達(dá)會導(dǎo)致NK細(xì)胞對細(xì)胞因子的反應(yīng)性降低[19]，脫顆粒的能力受損[18-19]，細(xì)胞因子產(chǎn)生不良[18-20]，增殖能力降低，這表明PD-1信號傳導(dǎo)可抑制NK細(xì)胞[19]。②在腎細(xì)胞癌中，外周血中NK細(xì)胞上PD-1表達(dá)增加與疾病階段相關(guān)，手術(shù)切除原發(fā)腫瘤后，PD-1的表達(dá)迅速顯著降低[21]。這些數(shù)據(jù)表明PD-1與NK細(xì)胞的耗竭狀態(tài)緊密相關(guān)。③在對小鼠腫瘤模型的研究中發(fā)現(xiàn)，含Ig和ITIM結(jié)構(gòu)域的T細(xì)胞免疫受體（T cell immunoreceptor with Ig and immunoreceptor tyrosine-based inhibitory domains, TIGIT）與NK細(xì)胞的耗竭相關(guān)，阻斷TIGIT可防止NK細(xì)胞耗竭[22]。④在肝細(xì)胞癌中，高水平表達(dá)的NKG2A與NK細(xì)胞的耗竭相關(guān)，且IL-10可誘導(dǎo)NKG2A的表達(dá)，阻斷IL-10可特異性抑制NKG2A的表達(dá)[23]。⑤在轉(zhuǎn)移性黑素瘤患者中，T細(xì)胞免疫球蛋白與粘蛋白結(jié)構(gòu)域-3（T cell immunoglobulin domain and mucin domain protein-3, TIM-3）可作為晚期黑色素瘤中NK細(xì)胞耗竭的標(biāo)志物[24]，可通過TIM-3靶向治療，逆轉(zhuǎn)NK細(xì)胞的耗竭表型，改善NK細(xì)胞的功能[25]。在病毒感染患者中，TIM-3被證明是NK細(xì)胞的抑制性受體[26]。如在慢性乙型肝炎患者外周血的NK細(xì)胞中，TIM-3的表達(dá)上調(diào)[27]，并抑制了這些患者NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性[27]，證明了TIM-3是NK細(xì)胞的抑制性受體，提示TIM-3可能參與了NK細(xì)胞的功能耗竭。由于這些結(jié)果大部分來源于對腫瘤患者的研究，在HIV感染者中，NK細(xì)胞表達(dá)共抑制分子的情況是否相同仍待進(jìn)一步研究。

目前對HIV感染及腫瘤患者的NK細(xì)胞功能研究可能提示，在HIV感染過程中，大量擴(kuò)增的CD56negCD16+NK細(xì)胞亞群可能是NK細(xì)胞的耗竭形式，其分泌細(xì)胞因子與殺傷功能都顯著下降。引起NK細(xì)胞耗竭的因素有以下幾種：①癌癥患者NK細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞溶解分子（如顆粒酶、穿孔素、凋亡相關(guān)因子配體和TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體）的低表達(dá)[28]，可使細(xì)胞溶解活性降低；②在HIV感染者中，NK細(xì)胞活化性受體NKG2D及其下游信號分子DAP10表達(dá)的減少，或由IL-10引起的抑制性受體NKG2A表達(dá)的上調(diào)都可引起NK細(xì)胞功能的耗竭[29]；③某些共抑制分子表達(dá)增多導(dǎo)致NK細(xì)胞功能耗竭。

總之，對可引起NK功能耗竭的分子特征的深入研究，不僅提供了對此種免疫狀態(tài)下NK細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的解釋，更可發(fā)現(xiàn)一些基于NK細(xì)胞的抗腫瘤、抗感染的治療靶點及免疫療法。

3 HIV感染引起NK細(xì)胞亞群分布與功能的改變

HIV感染細(xì)胞后，可使細(xì)胞表面MHC-I類分子表達(dá)下調(diào)，從而逃避CD8+T細(xì)胞的殺傷作用，理論上這會導(dǎo)致NK細(xì)胞啟動“缺失自我”機(jī)制對靶細(xì)胞進(jìn)行殺傷[30]，但事實并非如此。HIV僅選擇性下調(diào)人類白細(xì)胞抗原（human leucocyte antigen, HLA）-A、HLA-B，但仍保留HLA-C、HLA-E分子的表達(dá)，從而同時逃避CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞的殺傷[31]。除了使被感染細(xì)胞的分子表達(dá)發(fā)生改變，HIV還能對NK細(xì)胞產(chǎn)生影響。

許多研究表明隨著HIV感染者病程的進(jìn)展，NK細(xì)胞會出現(xiàn)不同程度的數(shù)量減少和功能缺損，這可體現(xiàn)在NK細(xì)胞表達(dá)分子如CD56及表達(dá)的受體改變上。例如，在HIV急性感染期中唾液酸結(jié)合免疫球蛋白樣凝集素陽性（Siglec-7+）的NK細(xì)胞，因Siglec-7表達(dá)的明顯下調(diào)出現(xiàn)Siglec-7-CD56dimNK細(xì)胞亞群，而其余方面并無明顯改變。在HIV慢性感染中，在病毒血癥的持續(xù)作用下，NK細(xì)胞的數(shù)量和功能的改變更為顯著。

如表1所示，功能上無反應(yīng)性的CD56negCD16+NK細(xì)胞亞群的擴(kuò)增以及主導(dǎo)免疫監(jiān)視作用的CD56dimCD16+NK細(xì)胞亞群的大量減少可能是NK細(xì)胞功能受損的主要原因[39]。同時，CD56brightCD16-NK細(xì)胞亞群介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)功能的異常也會影響適應(yīng)性免疫功能的正常發(fā)揮。所以NK細(xì)胞數(shù)量的減少和功能的受損可能在HIV感染后期整個免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)紊亂，功能耗竭，最終進(jìn)展為AIDS的過程中扮演了重要角色。

4 NK細(xì)胞在HIV感染中的作用

在HIV感染中，NK細(xì)胞不同程度地通過3種方式對機(jī)體起到保護(hù)性作用，了解其發(fā)生機(jī)制可為HIV的治療提供新的思路和方向。

4.1 受體調(diào)控的殺傷作用 一方面，利用細(xì)胞因子、造血生長因子和免疫調(diào)節(jié)劑可以促進(jìn)NK細(xì)胞加強(qiáng)殺傷分子如穿孔素、顆粒酶的表達(dá)和功能。另一方面， NK細(xì)胞的功能受活化性受體和抑制性受體的調(diào)控。此外，活化性受體的表達(dá)往往與更緩慢的疾病進(jìn)展相關(guān)：①研究發(fā)現(xiàn)，在HIV感染個體中，活化性受體KIR3DS1和HLA-Bw4-80I（在位點80處具有異亮氨酸的HLA-Bw4抗原）與更緩慢的疾病進(jìn)展相關(guān)[40]。同時，對HIV急性感染攜帶HLA-Bw4-80I個體的體外病毒抑制和擴(kuò)增實驗研究也證實了KIR3DS1+NK細(xì)胞對HIV進(jìn)展有抑制作用[41-42]。盡管具體機(jī)制尚不清楚，但KIR3DS1+NK細(xì)胞可減緩HIV感染患者的疾病進(jìn)展是明確的。此外，在HIV感染的Bw4-純合個體中，KIR3DL1-CD69+NK細(xì)胞的數(shù)量與病毒載量設(shè)定點呈負(fù)相關(guān)，并且大量早期激活和增殖的KIR3DL1-CD69+NK細(xì)胞在急性HIV感染中起到保護(hù)作用，是延緩疾病進(jìn)展的潛在因素[43]。②NK細(xì)胞表達(dá)的CD226分子，在與其配體CD112及CD155結(jié)合后，能提高NK細(xì)胞的殺傷活性。研究發(fā)現(xiàn)，在HIV感染人群中，CD226的表達(dá)明顯高于正常人[44]，這說明它對HIV感染的免疫應(yīng)答起到了作用，但具體功能和機(jī)制還須進(jìn)一步探索。在多發(fā)性骨髓瘤的小鼠模型中，用抗4-1BB單克隆抗體可增強(qiáng)NK細(xì)胞上活化標(biāo)志物CD69的表達(dá)，以NK細(xì)胞依賴性方式增強(qiáng)對疾病控制[45]，但相同的方法在抗HIV治療中是否可行，還待進(jìn)一步研究。受體調(diào)控的殺傷作用是NK細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的一個重要方式，深入研究并理解其作用機(jī)制將對如何提高活化性受體在NK細(xì)胞的表達(dá)，從而提升NK細(xì)胞的殺傷能力，延緩HIV感染病程進(jìn)展具有積極意義。

4.2 NK細(xì)胞介導(dǎo)的ADCC NK細(xì)胞介導(dǎo)的ADCC作為NK細(xì)胞殺傷功能的一個重要組成部分，其作用越來越受到重視。在RV144疫苗試驗中，發(fā)現(xiàn)了ADCC對于控制HIV復(fù)制的保護(hù)性作用。研究表明，ADCC的效率與特定抗體特征相關(guān)，包括糖基化，可以通過對其修飾以增強(qiáng)NK細(xì)胞的募集和激活。值得注意的是，ADCC也會受到病毒逃逸的限制，病毒輔助蛋白Vpu可拮抗抗病毒因子tetherin，改變病毒聚集體的釋放并阻止ADCC介導(dǎo)的病毒識別。由此，抑制Vpu與tetherin相互作用的小分子抑制劑有望成為一種新的干預(yù)手段，且可用具有聚糖和亞基特征的抗體最大化ADCC，進(jìn)一步增強(qiáng)抗病毒功能。同時，在對HIV感染的精英控制者與普通感染者的對比研究中發(fā)現(xiàn)，普通感染者的病毒輔助蛋白Nef可更為顯著地降低HIV-1感染細(xì)胞NKG2D配體的表達(dá)，且NKG2D配體表達(dá)水平與HIV-1感染細(xì)胞對ADCC的易感性相關(guān)。這表明NKG2D配體在 ADCC中起關(guān)鍵作用[46]。此外，HIV感染細(xì)胞因明顯下調(diào)MHC I類分子可被NK細(xì)胞識別并殺傷，但存在一部分HIV 株感染的細(xì)胞下調(diào)MHC I類分子水平較弱，導(dǎo)致NK細(xì)胞對其的直接殺傷能力與ADCC減弱，但用IFN-γ預(yù)刺激后，這部分HIV株感染的細(xì)胞仍對ADCC敏感，這表明IFN-γ預(yù)刺激可通過ADCC顯著增加NK細(xì)胞對HIV-1感染細(xì)胞的清除能力[47]。

4.3 NK細(xì)胞的分泌功能 除了NK細(xì)胞的殺傷功能，其分泌調(diào)節(jié)功能在控制HIV感染中的作用也不容忽視。NK細(xì)胞分泌的IFN-γ可促進(jìn)其他免疫細(xì)胞如樹突細(xì)胞的成熟，成熟的樹突細(xì)胞又可分泌IL-2、IL-15、IL-18等促進(jìn)NK細(xì)胞的增殖和分化。在HIV慢性感染中，這種相互作用受到極大損害，但在經(jīng)過抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療后，此種相互作用的功能可得到部分恢復(fù)[48]，此種功能的恢復(fù)是否與患者病情的控制相關(guān)仍待進(jìn)一步研究。而在未經(jīng)抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療的個體中，對PD-1與IL-10共阻斷可恢復(fù)HIV特異性CD4+T細(xì)胞功能，進(jìn)而通過IL-2和IL-12依賴途徑增強(qiáng)NK細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌功能[49]。該研究提示了逆轉(zhuǎn)適應(yīng)性免疫的耗竭可以改善固有免疫，并且免疫檢查點調(diào)節(jié)可作為HIV感染者的輔助治療手段。

4.4 NK細(xì)胞有望清除病毒儲存庫 病毒儲存庫的存在仍然是AIDS治療所面臨的一個巨大的挑戰(zhàn)。在淋巴結(jié)中，B細(xì)胞濾泡大部分缺乏包括NK細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞在內(nèi)的抗病毒殺傷細(xì)胞。因此，B細(xì)胞濾泡中的濾泡輔助性T細(xì)胞可以作為病毒的儲存庫。此外還發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞中也可能存在病毒儲存庫[50]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，在感染猴免疫缺陷病毒的非洲綠猴中，在趨化因子受體CXCR5或IL-15的存在下，NK細(xì)胞的數(shù)量在B細(xì)胞濾泡中明顯增多，進(jìn)而可控制病毒在其中的復(fù)制[51]。該發(fā)現(xiàn)為清除HIV儲存庫指出了一個新的方向。是否可以在人體重現(xiàn)該模型，通過CXCR5的表達(dá)使NK細(xì)胞進(jìn)入B濾泡細(xì)胞，并清除其中的病毒，值得更深入地思考和探討。

5 結(jié) 語

隨著對NK細(xì)胞研究的擴(kuò)展與深入，也為AIDS的治療提供了許多新思路，NK細(xì)胞在控制HIV感染病程中扮演了重要角色。最近研究報道，一種廣譜中和抗體可以有效抑制患者血液中的HIV載量，這為預(yù)防、治療甚至治愈AIDS提供了可能性，而廣譜中和抗體的治療效能又依賴于NK細(xì)胞的ADCC；在趨化因子受體CXCR5或IL-15的存在下，NK細(xì)胞可進(jìn)入B細(xì)胞濾泡，進(jìn)而可控制病毒在其中的復(fù)制，有望清除病毒儲存庫；同時，無功能的耗竭型NK細(xì)胞可被逆轉(zhuǎn)為有殺傷功能的NK細(xì)胞，能有效提高機(jī)體控制病毒的能力，進(jìn)而有效清除HIV。目前仍有許多問題亟待解決，如在HIV慢性感染中，NK細(xì)胞的亞群分布會發(fā)生顯著改變，而此種改變始于NK細(xì)胞發(fā)育的哪一階段，其受調(diào)控的機(jī)制等尚不明確；在腫瘤研究中得出的研究結(jié)果以及在小鼠模型或其他動物模型中得出的研究結(jié)果能否在人類身上重現(xiàn)，從而為治療HIV感染提供切實有效的方法等。治愈AIDS是一個巨大的挑戰(zhàn)，NK細(xì)胞在HIV感染中的重要作用值得更深入地研究與探索。