馬寧，朱康佳，毛銀，鄧禹

江南大學 糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122

乙醇酸 (Glycolic acid, Glycolate) 又稱羥基乙酸、甘醇酸，是最簡單的α-羥基酸[1]。近年來，乙醇酸廣泛應用于紡織工業(yè)、醫(yī)學工程材料、化學清洗等許多領域，需求量逐年增加[2-3]。

已報道的生物合成乙醇酸的方法包括微生物酶催化法和全生物合成方法。主要的生物酶催化法包括利用產腈水解酶水解乙醇腈產乙醇酸[4]，產甘油氧化酶氧化乙二醇產乙醇酸[2]，以及利用化學合金鐵硫氧化細菌合成乙醇酸[5]。但是，上述生產乙醇酸的方法需要昂貴或有毒的前體物質，使得生物催化法生產乙醇酸的應用受到限制。為了解決上述問題，研究人員嘗試利用葡萄糖或木糖作為碳源，通過過量表達乙醇酸合成途徑中3個關鍵酶：異檸檬酸裂解酶 (aceA)、乙醛酸還原酶 (ycdW) 和異檸檬酸脫氫酶激酶/磷酸化酶 (aceK)，加強乙醛酸循環(huán)途徑，實現乙醇酸的積累[1,6-8]。Pereira等[9]以木糖為碳源合成乙醇酸，在大腸桿菌中構建木糖代謝途徑并加強乙醛酸循環(huán)，獲得乙醇酸產率為0.63 g/g 木糖 (理論產率的 63%)，在目前所報道的利用木糖生產乙醇酸的研究中，產率達到最高。但以木糖為碳源生產乙醇酸，原料成本高昂，難以滿足工業(yè)生產的需要。Dischert等[10]在大腸桿菌中以葡萄糖為底物，通過加強乙醛酸循環(huán)實現了乙醇酸的積累，產率為 0.132 g/g葡萄糖，低于理論產率(0.85 g/g葡萄糖)，所以本研究的目的在于有效提高乙醇酸的產率。

乙醇酸的生物合成途徑包括 3個關鍵酶 (異檸檬酸裂解酶aceA、乙醛酸還原酶ycdW和異檸檬酸脫氫酶激酶/磷酸化酶aceK) 和2個關鍵反應(異檸檬酸裂解生成乙醛酸和乙醛酸轉化為乙醇酸)，因此，如何調節(jié)3個關鍵酶的表達水平和兩步反應的反應速率是提高乙醇酸產率的關鍵。在本研究中首先利用不同啟動子調節(jié)關鍵基因(aceA、ycdW和acek) 的表達水平，實現各基因間協(xié)調表達；然后過量表達了檸檬酸合成酶(gltA)，進一步加強乙醛酸循環(huán)；敲除了乙醇酸合成的競爭途徑，阻斷乙醇酸合成前體乙醛酸的消耗。最終獲得了工程菌株 Mgly335，其乙醇酸產率達到0.522 g/g葡萄糖 (理論產率的61.4%)。

1 材料與方法

1.1 菌種和質粒

實驗所用菌株及質粒見表1。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法

實驗所用培養(yǎng)基包括 LB培養(yǎng)基 (含 10 g/L胰蛋白胨，5 g/L酵母粉，10 g/L氯化鈉) 和以葡萄糖為唯一碳源的 M9培養(yǎng)基 (6.78 g/L Na2HPO4、3 g/L KH2PO4、1 g/L NH4Cl、0.5 g/L NaCl、2 mmol/L MgSO4、0.1 mmol/L CaCl2) 并加入相應的抗生素 (50 mg/L卡那霉素，50 mg/L鏈霉素，100 mg/L氨芐青霉素)。

培養(yǎng)方法：將–80 ℃保藏菌株接種在添加相應抗生素的 LB固體平板上分離活化后，轉接至50 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)過夜，獲得搖瓶發(fā)酵種子液。取 1 mL種子液接種于50 mL M9培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至對數中期 (OD600=0.6-0.8)，加入相應誘導劑(1 mmol/L IPTG或250 μg/L 脫水四環(huán)素) 以誘導目的基因表達。每4-6 h取一次樣，用HPLC檢測乙醇酸產量。所有的搖瓶發(fā)酵設置3個平行，最終結果為3個平行的平均值。

分批發(fā)酵培養(yǎng)方法：甘油保藏的菌種于平板上劃線活化后，挑取單菌落接種于50 mL的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min搖瓶過夜。以1%接種量將活化后的菌種轉接于60 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)6 h作為種子備用，以2%的接種量接種于5 L發(fā)酵罐中 (裝液量為3 L)。發(fā)酵條件如下：攪拌轉速400 r/min，通氣量1 vvm，2 mol/L NaOH維持pH為7.0。

表1 本研究中所用菌株及質粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.3 重組質粒的構建

重組質粒pJNU-1的構建：利用基因組提取試劑盒提取大腸桿菌 MG1655 (DE3) 基因組，并以此為模板通過pJNU-1-ycdWF和pJNU-1-ycdWR進行 PCR擴增目的基因ycdW[10]，37 ℃通過NdeⅠ和XhoⅠ分別雙酶切 PCR擴增的基因片段和pCOLDuet-1質粒2 h后，分別用PCR產物純化試劑盒和膠回收試劑盒回收目的基因和載體片段。T4 DNA連接酶處理目的基因片段與載體片段，16 ℃處理 8-10 h，將上述連接反應液加入100 μL大腸桿菌 JM109轉化感受態(tài)中冰上放置30 min，42 ℃熱激90 s，加入1 mL LB液體培養(yǎng)基，37 ℃搖床孵育 1 h，涂布卡那抗性平板(50 mg/L)。37 ℃培養(yǎng)過夜，通過 veri-pJNU-1 F和veri-pJNU-1 R引物對轉化子進行菌落PCR驗證。并將陽性菌落轉接 LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)12-16 h，利用質粒小提試劑盒提取質粒，用NdeⅠ和XhoⅠ酶切驗證。驗證正確的質粒用NcoⅠ和EcoRⅠ在 37 ℃雙酶切 2 h，同時用NcoⅠ和EcoRⅠ在37 ℃雙酶切PCR擴增的aceAK基因片段2 h。后續(xù)連接轉化實驗步驟同上，用XhoⅠ和EcoRⅠ酶切驗證，最后通過生工生物工程 (上海)股份有限公司測序驗證。

重組質粒pJNU-2的構建：NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切質粒pJNU-1，切膠回收片段 (4 356 bp)，獲得目的基因ycdW和aceAK。NcoⅠ和XhoⅠ酶切質粒pRSFDuet-1，利用膠回收試劑盒回收載體片段。目的基因與載體連接，連接及驗證方法同pJNU-1。

重組質粒pJNU-3的構建：以質粒pGLY-2為模板，通過pJNU-3 F和pJNU-3 R引物PCR擴增目的基因aceAK，切膠回收目的基因片段 (3 319 bp)，獲得目的基因aecAK。EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切質粒pGLY-2[10]，切膠回收載體片段 (3 592 bp)。利用Gibson組裝體系[13]構建重組質粒pJNU-3。驗證方法同pJNU-1，驗證引物見表2。

重組質粒pJNU-4的構建：NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切質粒pJNU-1，切膠回收片段(941 bp)，獲得目的基因ycdW。NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切質粒pCDFDuet-1，獲得載體片段，將目的基因與載體片段連接，構建重組質粒pJNU-4，連接及驗證方法同pJNU-1，驗證引物見表2。

重組質粒 pJNU-5的構建：以大腸桿菌基因組為模板，PCR擴增目的基因gltA，BamHⅠ和Hind Ⅲ雙酶切PCR擴增的基因片段，純化后獲得目的基因片段。BamHⅠ和Hind Ⅲ雙酶切質粒pJNU-4，獲得載體片段，將目的基因與載體片段連接，連接及驗證方法同 pJNU-1，驗證引物見表 2。

1.4 宿主菌株MG1655(DE3) 的改造

采用λ-Red重組法[12]敲除了ldhA(乳酸脫氫酶)、glcB、aceB(蘋果酸合成酶)。菌落PCR驗證基因的正確敲除，所用引物見表2。

具體實施步驟如下。以pKD4為模板，利用引物ko-ldhAF 和ko-ldhAR擴增敲除框，其中包含目的基因兩端同源臂各39 bp、2個FRT位點及卡那抗性基因。將轉化有pKD46的MG1655(DE3)菌株接于LB培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)過夜，再以1%的接種量轉接于50 mL LB培養(yǎng)基，同時加入100 mg/L氨芐青霉素和10 mmol/L阿拉伯糖，30 ℃培養(yǎng)至OD600=0.4-0.6，使pKD46上的3個蛋白充分表達。冰上預冷30 min，5 000 r/min離心收集菌體，然后無菌水離心洗滌1次，10%甘油離心洗滌 2次，將最終菌體濃縮于 500 μL感受態(tài)細胞，每管分裝100 μL，–80 ℃保藏備用。將純化后的敲除框10 μL與100 μL感受態(tài)細胞充分混勻，轉入0.1 cm電轉杯中電擊轉化。電擊后迅速加入1 mL LB培養(yǎng)基，37 ℃孵育1 h，涂布卡那抗性平板 (硫酸卡那霉素濃度為35 mg/L)，37 ℃培養(yǎng)過夜。然后通過菌落 PCR方法 (驗證引物veri-ldhAF和veri-ldhAR) 鑒定陽性克隆。將pCP20電轉入陽性克隆，30 ℃培養(yǎng)8 h后，37 ℃過夜培養(yǎng)，誘導FRT重組酶的表達，同時質粒逐漸丟失。在無抗生素的平板上劃線，再次進行菌落 PCR驗證。相同方法相繼敲除glcB和aceB。

1.5 代謝產物的定量檢測

1 mL發(fā)酵液12 000 r/min離心5 min，取上清用0.22 μm的濾膜過濾，HPLC (Rigol) 定量檢測乙醇酸。檢測條件如下：色譜柱為AminexHPX-87H(Bio-rad, USA)，流動相為 5 mmol/L稀硫酸，流速0.6 mL/min，柱溫50 ℃，進樣量為20 μL，檢測器為示差檢測器[10]。

表2 本研究中所用的引物Table 2 List of DNA oligo nucleotide primers used in the cloning of genes and for qPCR

2 結果與分析

2.1 加強乙醛酸循環(huán)提高乙醇酸產率

因為乳酸脫氫酶 (ldhA) 催化丙酮酸產生乳酸，從而相對減少了進入TCA的碳流[14]，并且乳酸對乙醇酸的定量檢測存在干擾，所以在本研究中首先在大腸桿菌MG1655(DE3)中敲除ldhA，獲得菌株Mgly1 (MG1655(DE3) ΔldhA)，作為本研究的出發(fā)菌株。

2.1.1 調節(jié)目的基因表達水平，增強乙醛酸循環(huán)

由圖 1可知，異檸檬酸裂解酶 (aceA) 和乙醛酸還原酶 (ycdW) 為乙醇酸合成途徑中的關鍵酶。異檸檬酸裂解酶 (aceA) 催化異檸檬酸合成乙醛酸，乙醛酸還原酶 (ycdW) 催化乙醛酸合成乙醇酸[15-16]。此外，還有一個與乙醇酸積累密切相關的酶：異檸檬酸脫氫酶激酶/磷酸化酶 (aceK)，其可以使異檸檬酸酶磷酸化，從而使異檸檬酸不能轉化為α-酮戊二酸，轉而生成乙醛酸 (乙醇酸的前體)[17-18]。所以在本研究中首先用T7啟動子過量表達以上3個關鍵基因：ycdW、aceA和aceK，構建質粒pJNU-1 (pCOLADuet-1-ycdW- aceAK)，并將其導入Mgly1 (MG1655(DE3) ΔldhA)，得到工程菌株Mgly11，其乙醇酸產量為 (1.086±0.151) g/L，產率為 (0.200±0.023) g/g葡萄糖 (理論產率的23.5%)。Mgly11的乙醇酸產量和產率都不高，為了進一步加強乙醛酸循環(huán)，改用高拷貝質粒pRSFDuet-1過表達 3個關鍵基因，構建了質粒pJNU-2 (pRSFDuet-1-ycdW-aceAK)，將其轉入Mgly1中，獲得工程菌株Mgly12，其乙醇酸產量為 (0.953±0.079) g/L，產率為 (0.189±0.017) g/g葡萄糖 (理論產率的 22.2%)。與 Mgly11相比，Mgly12中增加目的基因的拷貝數并沒有提高乙醇酸的產率，反而降低了5%。SDS-PAGE分析中發(fā)現Mgly11和Mgly12中異檸檬酸裂解酶表達量不足 (圖 2)，這可能是乙醇酸產率不高的原因之一[19]。Martin等[20]的研究中，利用pTet啟動子過量表達乙醇酸合成途徑中的 3個基因 (ycdW、aceA、aceK)，并積累了1.4 g/L的乙醇酸。所以本研究中利用pTet啟動子來過量表達異檸檬酸裂解酶 (aceA) 和異檸檬酸脫氫酶激酶/磷酸化酶(aceK)，構建質粒pJNU-3 (pHHD01K-aceAK) 和pJNU-4 (pCDFDuet-1-ycdW) 并將其轉入 Mgly1中，獲得菌株 Mgly134，其乙醇酸產量為(1.602±0.195) g/L，產率為 (0.24±0.030) g/g葡萄糖 (理論產率的28.2%)，較Mgly11提高了20%，但是仍然遠低于理論產率。

圖1 大腸桿菌中乙醇酸合成途徑Fig.1 Glycolate synthesis pathway in Escherichia coli.GLC: glucose; PYR: pyruvate; CIT: citric acid; AKG:α-ketoglutaric acid; SUCC: succinyl-COA; SUC: succinate; FUM: fumaric acid; MAL: malate; OAA: oxaloacetate;GLYX: glyoxylate.

2.1.2 增加進入TCA的碳流，增強乙醛酸

檸檬酸合成酶 (gltA) 作為乙醛酸及三羧酸循環(huán)的共用酶，可以催化草酰乙酸和乙酰輔酶 A合成檸檬酸，增加乙酰輔酶A進入三羧酸循環(huán)的流量，從而增強三羧酸循環(huán)，間接增強支路乙醛酸循環(huán)[21-22]。而且在Mgly134分批發(fā)酵中有一定乙酸的積累 [(1.051±0.207) g/L]，推測在削弱TCA的過程中可能造成乙酰輔酶A的積累，從而導致乙酸的積累。所以在本研究中將gltA過量表達，構建質粒pJNU-5 (pCDFDuet-1-ycdW-gltA)，并和 pJNU-3 (pHHD01K-aceAK) 共轉入 Mgly1中，得到重組菌株Mgly135，發(fā)酵結果如圖3所示，其乙醇酸產量為 (2.058±0.144) g/L，產率為(0.326±0.023) g/g葡萄糖 (理論產率的38.3%)，Mgly134提高了 35.8%，而且在分批發(fā)酵中乙酸積累量明顯減少 (圖3)。

綜上所述，利用pTet啟動子過量表達異檸檬酸裂解酶 (aceA) 和異檸檬酸脫氫酶激酶/磷酸化酶 (aceK)，同時利用 T7啟動子過量表達乙醛酸還原酶 (ycdW)，有效增強了乙醇酸合成途徑。與單獨利用T7啟動子過量表達3個目的基因相比，乙醇酸產量提高了 47.5%，產率提高了 20%。在此基礎上過量表達檸檬酸合成酶 (gltA)，搖瓶發(fā)酵中乙醇酸的產量為 2.058 g/L (圖 4)，產率為0.326 g/g 葡萄糖 (理論產率的38.3%)，進一步提高了35.8%。

圖2 SDS-PAGE比較不同重組菌株中目的蛋白表達水平Fig.2 Comparison of target proteins in different recombinant strains by SDS-PAGE.M: marker; 1: Mgly1;2: Mgly11; 3: Mgly12; 4: Mgly134; 5: Mgly135; 6:Mgly335.Glyoxylate reductase reductase (ycdW):35.4 kDa; Isocitrate lyase (aceA): 47.5 kDa.

圖3 Mgly135搖瓶發(fā)酵結果Fig.3 Fermentation results of Mgly335 in shaked flask.Analysis of the cell growth and production of glycolate and acetate of Mgly135 were shown in the figure.And the abscissa means to time after induction.

圖4 不同重組菌株搖瓶發(fā)酵中乙醇酸產量和產率的比較Fig.4 Comparison of glycolic acid production in various metabolite strains.Strains were cultivated in shake flasks with fermentation medium.Final glycolate yield and production of various metabolite strains was displayed using histogram and line chart respectively.

2.2 改造菌株提高乙醇酸產率

在大腸桿菌中，乙醛酸除參與乙醇酸的合成，還可以與乙酰輔酶A在蘋果酸合成酶 (glcB和aceB) 催化下生成蘋果酸，從而競爭了乙醇酸合成的前體——乙醛酸[23]。Choi等[24]的研究中，以木糖和葡萄糖為碳源，敲除蘋果酸合成酶后，乙醇酸產量從1.46 g/L增加到2.31 g/L。因此本研究中，在菌株Mgly1 (MG1655(DE3)ΔldhA) 中敲除了蘋果酸合成酶基因glcB和aceB(驗證結果如圖5所示)，獲得菌株Mgly3，并將重組質粒pJNU-5 (pCDFDuet-1-ycdW-gltA)和 pJNU-3(pHHD01K-aceAK) 共轉入 Mgly3中，得到工程菌株 Mgly335，搖瓶結果中乙醇酸產量為(2.822±0.203) g/L，產率為 (0.522±0.032) g/g葡萄糖(圖6)，達到理論產率的61.4%，較Mgly135提高了60%。

2.3 工程菌株Mgly335分批發(fā)酵生產乙醇酸

2.3.1 Mgly335分批發(fā)酵

甘油保藏的菌種于平板上劃線活化后，挑取單菌落接種于50 mL的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min搖瓶過夜。以1%接種量將活化后的菌種轉接于 60 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)6 h作為種子備用，以2%的接種量接種于5 L發(fā)酵罐中 (裝液量為3 L)。發(fā)酵條件如下：攪拌轉速400 r/min，通氣量1 vvm，2 mol/L NaOH維持pH為7.0。

圖5 菌落PCR驗證基因敲除結果Fig.5 Confirming correct knockout of genes by colony PCR.Confirming correct knockout of ldhA was shown in lane 1 and 2.1: MG1655(DE3) (1 618 bp); 2: MG1655(DE3)ΔldhA (809 bp).Confirming correct knockout of glcB was shown in lane 3 and 4.3: MG1655(DE3) ΔldhA (2 705 bp); 4:MG1655(DE3) ΔldhAΔglcB (2 029 bp).Confirming correct knockout of aceB was shown in lane 5 and 6.5:MG1655(DE3) ΔldhAΔglcB (2 156 bp); 6: MG1655(DE3)ΔldhAΔglcBΔaceB (1 097 bp).

圖6 Mgly335搖瓶發(fā)酵結果Fig.6 Fermentation results of Mgly335 in shaked flask.Analysis of the cell growth and production of glycolate of Mgly335 were shown in the figure.The yield of glycolic acid of Mgly335 reached 0.522 g/g glucose,which was up to 61.4% of the theoretical maximum yield from glucose of 0.85 g/g glucose.And the abscissa means to time after induction.

接種后37 ℃培養(yǎng)至OD600為0.8左右時，將發(fā)酵溫度降到30 ℃，加入250 ng/mL aTc (脫水四環(huán)素) 和1 mmol/L IPTG誘導目的基因表達，發(fā)酵結果如圖 7A所示。加入誘導劑后乙醇酸開始積累，接種29 h后，葡萄糖耗盡，乙醇酸產量達到最大為3.888 g/L，產率為0.474 g/g 葡萄糖，并且在發(fā)酵過程中無乙酸等雜酸的積累。

2.3.2 Mgly335補料分批發(fā)酵

圖7 Mgly335分批發(fā)酵結果Fig.7 The results of Mgly335 in batch fermentation.Analysis of the cell growth and production of Mgly335 in a 5 L bioreactor.The production of glycolic acid reached 3.888 g/L with 0.474 g/g glucose yield in batch fermentation and 11.909 g/L with 0.496 g/g glucose in fed-batch, which were shown in A and B respectively.

種子液制備和發(fā)酵條件同分批發(fā)酵，發(fā)酵結果如圖7B所示，接種6 h后加入誘導劑，此階段細胞處于對數期，比生長速率較高，乙醇酸和乙酸基本同步積累。接種后 15 h時葡萄糖耗盡，開始進行恒速補料，補料速度為0.3 g/(L·h)，細胞開始處于“饑餓”狀態(tài)，在補入的葡萄糖耗盡的同時細胞開始以已經積累的乙酸作為碳源，乙酸在21 h時被耗盡，同時細胞的比生長速率較之前略有降低。在63 h時菌體量達到峰值，之后菌體量開始緩慢下降，表示細胞生長進入衰亡期。在這一階段，由于細胞不再繼續(xù)生長和繁殖，代謝量也相應減少，葡萄糖和乙酸開始積累，而乙醇酸產量的增速也明顯減慢，在 77 h時達到最大值11.909 g/L，產率為 0.496 g/g 葡萄糖 (理論產率的 58.3%)。

3 討論

乙醇酸是分子量最小的果酸，它在化學清洗、生物降解、日用化工等行業(yè)得到了廣泛的應用，其需求量也在逐年增加。全生物方法合成乙醇酸與化學方法相比，具有反應條件溫和、對環(huán)境影響小等優(yōu)點，因此成為現在研究的熱點。Cam等[6]在大腸桿菌中利用木糖為底物獲得4.3 g/L乙醇酸，產率為0.43 g/g木糖。Alkim[7]通過改造大腸桿菌的木酮糖磷酸途徑和乙醛酸循環(huán)，以木糖和葡萄糖為混合碳源獲得3.73 g/L乙醇酸，產率為0.497 g乙醇酸/g糖。而以葡萄糖為底物較木糖相比合成乙醇酸具有底物廉價、產品純度高等突出優(yōu)點。乙醇酸的生物合成途徑包括3個關鍵酶 (異檸檬酸裂解酶、乙醛酸還原酶和異檸檬酸脫氫酶激酶/磷酸化酶) 和兩個關鍵反應 (異檸檬酸裂解生成乙醛酸和乙醛酸轉化為乙醇酸)。Dhamankar 等[11]在大腸桿菌 MG1655(DE3) 中以葡萄糖為底物，利用 T7啟動子過量表達乙醇酸合成途徑中的 3個關鍵基因 (ycdW、aceA、aceK) 實現了乙醇酸的積累，產量為0.7 g/L，產率為0.0875 g/g葡萄糖；而利用pTet啟動子過量表達3個基因，獲得乙醇酸產量為1.43 g/L，產率為0.178 g/g葡萄糖，低于理論產率 (0.85 g/g葡萄糖)。本研究中利用不同拷貝數的表達質粒和更換啟動子的方法共同調節(jié)上述 3個關鍵基因的表達水平，用強啟動子 pTet過量表達aceAK，提高異檸檬酸裂解酶的表達量，同時用T7啟動子過量表達ycdW(乙醛酸還原酶)，乙醇酸產量為1.602 g/L，產率為0.24 g/g葡萄糖，雖然乙醇酸產量值略高于上述文獻報道，但是其產率卻明顯提高，這說明在生物法合成乙醇酸的過程中過量表達關鍵基因的同時，調節(jié)3個關鍵酶的表達水平和平衡兩步關鍵反應的速率也是提高乙醇酸產率的重要因素。因此，本研究為提高乙醇酸產量和產率提供了新策略，并可將此策略應用于提高其他有機酸的生物合成。

本研究在上述基礎過量表達檸檬酸合成酶編碼基因 (gltA)，結果顯示工程菌株Mgly135獲得了2.058 g/L乙醇酸，產率為0.326 g/g 葡萄糖 (理論產率的38.3%)，乙醇酸產率提高了36%，這表明直接調節(jié)乙醛酸循環(huán)并不是唯一提高乙醇酸產率的策略，可以通過加強三羧酸循環(huán)進而增加乙醛酸循環(huán)的代謝流，從而實現乙醇酸產率的提高。這也為進一步的研究提供新的思路，即可以通過改善前體通路進而提高乙醇酸的產率和合成效率。

Choi等[24]的研究中，敲除蘋果酸合成酶編碼基因 (glcB和aceB) 后，以木糖和葡萄糖為混合碳源進行發(fā)酵培養(yǎng)后，乙醇酸產量從1.46 g/L增加到 2.31 g/L。本研究在敲除乳酸脫氫酶(ldhA)、過量表達乙醇酸合成途徑中的 3個關鍵基因 (ycdW、aceA、aceK) 和過量表達檸檬酸合成酶編碼基因 (gltA) 的基礎上進一步敲除了蘋果酸合成酶編碼基因 (glcB和aceB)，得到工程菌株 Mgly335，以葡萄糖為唯一碳源進行發(fā)酵培養(yǎng)后，乙醇酸產量為2.822 g/L，產率為0.522 g/g葡萄糖，進一步提高了乙醇酸的產量和產率。這說明阻斷旁路代謝途徑的同時減少乙醇酸合成前體——乙醛酸的消耗，能夠增加進入乙醇酸合成途徑的碳流，進一步提高了乙醇酸的產量及產率。同時這一結果也提示可能還有其他旁路代謝途徑對乙醇酸的合成產生影響，因此，后續(xù)實驗中我們將對乙醇酸及其前體乙醛酸的其他代謝途徑作進一步研究[25]。

Mgly335工程菌補料分批發(fā)酵后，發(fā)酵77 h時乙醇酸產量達到最大值 11.909 g/L，產率為0.496 g/g葡萄糖 (理論產率的58.3%)，使乙醇酸產量大幅度提高，為乙醇酸的規(guī)模化生產提供了基礎。分批發(fā)酵中乙醇酸的產率較搖瓶發(fā)酵略低，所以在后續(xù)研究中，我們將探究各種發(fā)酵影響因素[26]，如不同碳源、氮源、溶氧、pH、誘導時間、微量元素含量等對乙醇酸產量和產率的影響，以得到更高的乙醇酸產量和產率，并將改進后的方法用于工業(yè)化生產，以便節(jié)約生產成本，提高生產效率，減少生產對環(huán)境的影響。

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