張玲楷，李永鋒，謝利豹，孫元，王曉，仇華吉

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，黑龍江 哈爾濱 150069

豬瘟 (Classical swine fever，CSF) 是由豬瘟病毒 (Classical swine fever virus，CSFV) 引起的一種嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的毀滅性傳染病。臨床上主要以高熱稽留、廣泛性出血和高死亡率為主要特征[1]。世界動物衛(wèi)生組織 (OIE)將其列入 OIE疫病名錄，為須申報的動物傳染病。我國制定的《國家中長期動物疫病防治規(guī)劃 (2012–2020年)》將其列為五種優(yōu)先防治的“一類動物疫病”之一。盡管美國、加拿大和新西蘭等部分發(fā)達(dá)國家消滅了該病，但它仍是世界和我國養(yǎng)豬業(yè)的重要威脅[2-3]。

CSFV是有囊膜的單股正鏈RNA病毒，為黃病毒科瘟病毒屬成員，基因組長約12.3 kb，含有一個開放閱讀框 (ORF)，在宿主和病毒酶系統(tǒng)的作用下，形成4種結(jié)構(gòu)蛋白 (C、Erns、E1和E2)和 8種非結(jié)構(gòu)蛋白 (Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)[4-5]。

豬圓環(huán)病毒病 (Porcine circovirus-associated disease，PCVAD) 是由豬圓環(huán)病毒 2型 (Porcine circovirus 2，PCV2) 引起的多種病癥的總稱。PCV2主要侵害免疫系統(tǒng)，降低機體的抵抗力和免疫應(yīng)答反應(yīng)，導(dǎo)致感染的豬只產(chǎn)生免疫抑制和繼發(fā)感染其他病原微生物，從而使死亡率明顯上升[6]。該病可導(dǎo)致仔豬斷奶后多系統(tǒng)綜合征、皮炎和腎病綜合征、繁殖障礙、腸道疾病、仔豬先天性震顫和仔豬滲出性皮炎等疾病，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。根據(jù)基因組序列不同，PCV2分為PCV2a、PCV2b、PCV2c和PCV2d四個基因型，近幾年出現(xiàn)的PCV2d已逐漸成為優(yōu)勢基因型[7-8]。

近年來，隨著養(yǎng)豬規(guī)模的擴大，CSF的流行和發(fā)病特點以及表現(xiàn)形式也發(fā)生了很大變化，急性和典型性CSF病例在逐漸減少，多以非典型性、慢性及隱性 CSF形式出現(xiàn)[9]。研究發(fā)現(xiàn)，CSFV常與其他病毒性、細(xì)菌性或寄生蟲性病原混合感染，其中尤其以 PCV2、豬繁殖與呼吸綜合征病毒 (PRRSV)、偽狂犬病病毒 (PRV) 等病毒性疾病混合感染最常見[10]。豬群感染 PCV2、PRRSV和PRV后，不僅可直接危害豬只健康，還可侵害豬體的免疫系統(tǒng)，造成免疫抑制，降低豬體對CSFV等病原體的抵抗力和對疫苗的反應(yīng)性。研究表明，PCV2、PRV、PRRSV單獨或混合感染豬體后會影響CSF疫苗的免疫效果，導(dǎo)致CSFV在豬體內(nèi)的長期存留，引起持續(xù)感染[11]。

豬瘟兔化弱毒疫苗株 (C株或 HCLV株) 是我國學(xué)者在20世紀(jì)50年代通過將CSFV強毒株在兔體內(nèi)連續(xù)傳480余代后培育而成的[12]。C株是一株非常安全有效的弱毒疫苗，可同時誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫，對各種年齡的家豬和野豬均安全[12]；用C株接種后2–4 d，即能對不同基因型的CSFV株均提供有效保護[13-14]。因此，從安全性和免疫原性上看，C株具有作為活病毒載體的潛力和優(yōu)勢。

本研究中，我們在C株感染性克隆Npro蛋白的氨基酸13和14之間引入PCV2的主要保護性抗原Cap基因，獲得能夠穩(wěn)定表達(dá)Cap蛋白的重組病毒，并評價該重組病毒在家兔體內(nèi)的生物學(xué)特性和免疫原性，為研制豬瘟和豬圓環(huán)病毒病二價疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、細(xì)胞和病毒

C株的感染性克隆pCSFV-HCLV和包含Cap基因的質(zhì)粒 pMD18T-Simple-VP2-2A-Cap由本實驗室保存。SK6細(xì)胞用含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基 (不含牛病毒性腹瀉病毒和牛病毒性腹瀉病毒的抗體)培養(yǎng)，并放置于含5% CO2的37 ℃溫箱中。C株 (HCLV株) 以及從感染性cDNA克隆拯救出的C株 (rHCLV) 均在SK6細(xì)胞中培養(yǎng)，豬圓環(huán)滅活疫苗LG株購自維科生物技術(shù)有限公司。

1.2 感染性克隆pHCLV-Cap的構(gòu)建

我們以感染性克隆pCSFV-HCLV為骨架構(gòu)建重組感染性克隆pHCLV-Cap (圖1)。簡言之，用表1中列出的引物通過重疊PCR將Cap基因插入到Npro蛋白第13位和第14位氨基酸之間。然后，將PCR產(chǎn)物通過分子克隆技術(shù)克隆至pCSFV-HCLV獲得pHCLV-Cap，并用多種核酸限制性內(nèi)切酶和序列測定對獲得的pHCLV-Cap進(jìn)行鑒定。

1.3 重組病毒rHCLV-Cap的拯救

我們用之前報道的方法[15]拯救重組 C株rHCLV-Cap。具體操作步驟如下：將6 μg pHCLV-Cap轉(zhuǎn)染至SK6細(xì)胞，然后將細(xì)胞傳代15次。通過3次反復(fù)凍融收獲病毒。用CSFV抗原捕獲試劑盒檢測重組病毒 rHCLV-Cap第 1–15代 Erns蛋白的表達(dá)。通過 RT-PCR從拯救出的病毒上清中提取的病毒基因組中擴增Npro-Cap融合基因、E2、NS5B或者其他基因，并進(jìn)行測序鑒定。

1.4 間接免疫熒光試驗

將拯救的病毒rHCLV-Cap接種于生長至70%單層的 SK6細(xì)胞中，2 h后用磷酸鹽緩沖溶液(PBS) 洗2遍，然后加入新鮮的含2%胎牛血清的DMEM，在5% CO2、37 ℃環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后棄上清，用4 ℃預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液 (PBS) 洗細(xì)胞2次，然后用-20 ℃預(yù)冷的無水乙醇固定細(xì)胞20 min，加入針對CSFV E2蛋白的單克隆抗體HQ06或PCV2 Cap單克隆抗體3A5，37 ℃作用2 h后用PBS洗滌3次，加入1∶100稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG (Sigma公司)，置于濕盒中37 ℃作用45 min，用PBS分別洗滌3次后，置于倒置熒光顯微鏡下觀察。

圖1 全長感染性克隆pHCLV-Cap的構(gòu)建策略Fig.1 Strategy for the construction of pHCLV-Cap.

表1 構(gòu)建pHCLV-Cap所用的引物Table 1 Primers used for construction of pHCLV-Cap

1.5 重組病毒的生長曲線測定

將rHCLV-Cap和C株分別以感染復(fù)數(shù) (MOI)為0.1的劑量接種于鋪有SK6細(xì)胞的24孔板中，37 ℃感染2 h后，棄去病毒液，更換新的培養(yǎng)液，再將細(xì)胞放在含5% CO2的37 ℃溫箱中培養(yǎng)。每12 h反復(fù)凍融收獲病毒，用Reed-Münch方法通過間接免疫熒光試驗檢測收獲病毒的滴度[16]，并用TCID50/mL表示。實驗重復(fù)3次，然后計算出平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.6 家兔接種試驗

動物實驗已經(jīng)過中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所動物福利委員會的批準(zhǔn)，其許可證為SYXK (黑龍江) 2011022。我們將27只14周齡新西蘭白兔隨機分為5組，每組6只 (除D組3只外)。A 組家兔通過耳緣靜脈接種 104TCID50rHCLV-Cap， B組接種104TCID50rHCLV，C組接種104TCID50C株，D組皮下接種LG株，E組接種1 mL的DMEM。接種之后，每6 h記錄家兔的直腸溫度來監(jiān)測它們的定型熱反應(yīng)，接種后第3天從A、B、C和E組中隨機選取3只家兔進(jìn)行安樂處死，采集家兔脾臟，用熒光定量RT-PCR檢測家兔脾臟中病毒的RNA拷貝數(shù)；在接種后3 w，對D組的3只家兔及其他組剩余的3只家兔進(jìn)行加強免疫，免疫劑量及途徑同初次免疫。

充分利用廢水再利用，不但有效節(jié)約用水，還可以變廢水為可再利用資源，有效緩解資源匱乏和環(huán)境污染帶來的壓力，從社會效益和經(jīng)濟效益都適合大力推廣。在循環(huán)水系統(tǒng)中，如今方案帶來的經(jīng)濟效益較少還不能真實的展示出來，但是隨著國家對水資源價格和污水排放愈加重視和投入，經(jīng)濟效益將會越來越顯著。

整個試驗過程中，每隔3天采集所有組家兔的血清，將采集到的家兔血清樣本用CSFV抗體ELISA檢測試劑盒 (IDEXX) 和 PCV2抗體ELISA檢測試劑盒分別檢測抗 E2抗體和抗 Cap抗體。

1.7 阻斷ELISA

免疫前以及免疫后每3天采血，分離血清。用豬瘟抗體檢測試劑盒 (IDEXX公司，批號C281) 和PCV2 Cap抗體檢測試劑盒 (Synbiotics公司，批號 SCIRCO1N17) 檢測抗體水平，具體操作方法見說明書。

1.8 定量PCR/RT-PCR

我們通過熒光定量 RT-PCR檢測家兔脾臟中的病毒RNA水平[17]。具體方法如下：25 μL緩沖液的反應(yīng)體系中包含3 μL cDNA，2.5 μL 10× ExTaq緩沖液，2 μL dNTPs (各含 2.5 mmol/L)，各 1 μL HCLV-F 和 HCLV-R (10 μmol/L)，0.5 μL HCLV-JOE(10 μmol/L) 探針和 2 U Hot Star EXTaqDNA 聚合酶。循環(huán)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s和60 ℃退火/延伸45 s (40個循環(huán))。每個樣本的實驗進(jìn)行3次重復(fù)。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算病毒基因組的RNA拷貝數(shù)。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用 SPSS統(tǒng)計學(xué)軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，比較各組間的差異。其中，P≥0.05為差異不顯著，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組病毒rHCLV-Cap的獲得

將重組感染性克隆 pHCLV-Cap轉(zhuǎn)染SK6細(xì)胞拯救重組病毒 rHCLV-Cap，用 IDEXX豬瘟病毒抗原檢測ELISA試劑盒對第1–15代的SK6細(xì)胞上清檢測，結(jié)果顯示，所拯救的第10–15代的重組病毒的Erns蛋白抗原為陽性 (圖2)。

圖2 重組病毒rHCLV-Cap抗原捕獲ELISA的檢測Fig.2 Detection of the recombinant virus rHCLV-Cap by antigen-capture ELISA.

按照病毒 RNA提取說明書提取病毒基因組RNA后，通過RT-PCR擴增并測序目的基因，結(jié)果表明重組病毒基因組 RNA包含Npro-Cap基因并與預(yù)期大小一致 (約1.2 kb)，測序結(jié)果顯示，Npro-Cap基因不存在任何突變。以上結(jié)果表明，我們獲得了包含Cap基因的重組病毒rHCLV-Cap。

2.2 外源蛋白在重組病毒rHCLV-Cap中的表達(dá)

為了鑒定獲得的重組病毒rHCLV-Cap中Cap蛋白的表達(dá)，將rHCLV-Cap感染SK6細(xì)胞48 h后，通過間接免疫熒光檢測Cap蛋白，結(jié)果顯示，用鼠源抗Cap單抗檢測到感染重組病毒rHCLV-Cap的細(xì)胞產(chǎn)生特異性熒光 (圖 3)。結(jié)果表明，重組病毒rHCLV-Cap能夠表達(dá)外源Cap蛋白。

2.3 重組病毒的生長動力學(xué)和遺傳穩(wěn)定性

我們評估了rHCLV-Cap的體外生長特性。重組病毒rHCLV-Cap與親本病毒，有著相似的生長能力 (圖4)，這表明Cap基因的插入不影響重組病毒的生長能力。

圖3 間接免疫熒光試驗檢測 Cap蛋白在重組病毒rHCLV-Cap中的表達(dá)Fig.3 The expression of the Cap protein in the recombinant virus rHCLV-Cap examined by IFA.

圖4 重組病毒rHCLV-Cap的生長曲線Fig.4 Growth property of the recombinant virus rHCLV-Cap in SK6 cells.

為了評價插入的Cap基因在病毒基因組中的遺傳穩(wěn)定性，我們將拯救成功的 rHCLV-Cap在SK6細(xì)胞上連續(xù)傳20代。將第15–20代rHCLV-Cap的Npro-Cap基因通過RT-PCR擴增并測序。結(jié)果表明，所有子代病毒中均可擴增到預(yù)期大小約1.2 kb的目的基因 (圖 5)。另外，測序結(jié)果顯示，Cap基因在各代rHCLV-Cap的基因組中均保持完整和正確性。

2.4 重組病毒在家兔體內(nèi)的生物學(xué)特性和免疫原性

為了檢驗rHCLV-Cap在家兔體內(nèi)的生物學(xué)特性和免疫原性，不同組的家兔接種指定的病毒，在接種后的不同時間點檢測接種家兔的體溫和血清中的抗體水平。接種C株或rHCLV的家兔都在接種后24 h或36 h出現(xiàn)發(fā)熱，持續(xù)18–24 h，并且重組病毒rHCLV-Cap同樣能保持引起定型熱反應(yīng)的生物學(xué)特性。值得注意的是，免疫重組病毒的家兔在免疫后10 d可以產(chǎn)生抗E2抗體 (表2)，并持續(xù)升高 (圖 6)。這些數(shù)據(jù)表明，rHCLV-Cap在家兔體內(nèi)具有與C株一致的生物學(xué)特性和免疫原性。然而接種重組病毒在家兔體內(nèi)不能較好地誘導(dǎo)產(chǎn)生抗Cap抗體 (圖7)。

圖5 RT-PCR檢測Cap基因在重組病毒rHCLV-Cap中的遺傳穩(wěn)定性Fig.5 The stability of the Cap gene in the recombinant virus rHCLV-Cap tested by RT-PCR.

表2 重組病毒接種后家兔的定型熱反應(yīng)和脾臟中復(fù)制情況Table 2 Fever response and viral replication of the rabbits inoculated with the recombinant virus

圖6 重組病毒免疫家兔后的抗E2特異性抗體Fig.6 Anti-E2 antibodies of the rabbits immunized the recombinant virus rHCLV-Cap.

3 討論

圖7 重組病毒免疫家兔后的抗Cap特異性抗體Fig.7 Anti-Cap antibodies of the rabbits immunized the recombinant virus rHCLV-Cap.

在本研究中，我們以PCV2Cap基因作為模式基因來評價 C株作為活病毒載體的潛力。Cap蛋白是 PCV2的主要結(jié)構(gòu)蛋白和免疫保護性抗原，能刺激動物機體產(chǎn)生針對 PCV2的特異性免疫應(yīng)答。國內(nèi)外研制的針對Cap蛋白的亞單位疫苗對不同基因型的 PCV2感染具有良好的免疫保護力[18]。目前的研究表明，CSFV中僅 Npro蛋白和 C蛋白可以允許外源基因的插入，而且在Npro蛋白中插入外源基因?qū)?CSFV生長特性影響較小[19-20]。本研究中將Cap基因插入Npro蛋白中并成功拯救出一株能夠穩(wěn)定表達(dá)Cap基因且保持親本病毒生長特性的重組病毒。

將C株和rHCLV-Cap通過耳緣靜脈接種家兔來評價其免疫原性，接種的家兔表現(xiàn)出定型熱反應(yīng)。在本實驗室之前的研究中，C株的3′-非編碼區(qū) (UTR) 被CSFV石門株的UTR替換后不會誘導(dǎo)產(chǎn)生定型熱反應(yīng)，但是會保持其免疫原性[21]。在本研究中，Cap基因的插入不僅沒有改變C株在家兔體內(nèi)的致病性，而且也未影響C株的免疫原性。值得注意的是，重組病毒能夠誘導(dǎo)家兔產(chǎn)生針對CSFV E2的特異性抗體。

然而，重組病毒并不能誘導(dǎo)家兔產(chǎn)生較穩(wěn)定的抗Cap抗體。我們分析其主要的原因有兩種，其一是重組病毒表達(dá)的 Cap蛋白定位在細(xì)胞核內(nèi)。這與之前的Cap蛋白的亞定位研究結(jié)果保持一致，是由于Cap蛋白N端有一段41個氨基酸殘基組成的核定位信號[22]。其二是重組病毒的滴度只有104TCID50，重組病毒的滴度不能夠表達(dá)足夠量的Cap蛋白。前人研究發(fā)現(xiàn)CSFV感染細(xì)胞主要是通過Erns和E2蛋白與細(xì)胞表面蛋白的相互作用[23]。研究證實硫酸乙酰肝素是病毒蛋白Erns吸附宿主細(xì)胞的一個受體，Erns蛋白第476位絲氨酸突變?yōu)榫彼崮軌蛟鰪姴《緦λ拗骷?xì)胞的吸附能力[24]；E2蛋白上第37位的天冬氨酸突變?yōu)樘於０?，能夠增強病毒拮抗?xì)胞抗病毒應(yīng)答的能力[25]。因此，在后續(xù)研究中我們需去除 Cap蛋白核定位信號并提高病毒滴度來優(yōu)化重組病毒，并在家兔和豬只上進(jìn)行免疫效力評價。

總之，本研究以C株為活病毒載體構(gòu)建表達(dá)PCV2 Cap蛋白的重組病毒rHCLV-Cap，此重組病毒在家兔體內(nèi)保持與C株一致的生物學(xué)特性，并且能夠誘導(dǎo)家兔產(chǎn)生針對CSFV E2的抗體。然而不能誘導(dǎo)家兔產(chǎn)生針對Cap的抗體。今后我們將通過提高重組病毒的病毒滴度和表達(dá)分泌型Cap蛋白的形式優(yōu)化重組病毒。

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