柏強善，陰繼凱，袁利娟，王成果，楊媛，臧莉，孫藝波，李澤，喬健，王青，魯建國

（1. 第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院 普通外科，陜西 西安 710038；2. 第四軍醫(yī)大學(xué) 學(xué)員旅，陜西 西安 710032）

膽囊癌是膽道最常見的惡性腫瘤，占膽道惡性腫瘤的80%～95%[1]。由于癥狀不明顯或者不典型，這種疾病在發(fā)現(xiàn)時往往已經(jīng)進(jìn)展到了晚期，很多患者失去了根治性手術(shù)的機會，導(dǎo)致預(yù)后極差，5年生存率不足5%[2]。因此早期診斷對于改善患者預(yù)后至關(guān)重要。其中腫瘤標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)是最具潛力的研究方向[3]。膽汁是由肝臟產(chǎn)生并經(jīng)過膽道排入腸道的一種體液。膽汁的成分非常復(fù)雜，主要有膽汁酸、膽固醇、磷脂、膽紅素、蛋白質(zhì)和無機鹽離子等。其中，蛋白質(zhì)約占膽汁干重的5%～7%[4-7]。膽汁中可能含有與膽囊癌相關(guān)的蛋白質(zhì)，它們局部濃度高，背景干擾小，因此膽汁蛋白質(zhì)組學(xué)的研究對于發(fā)現(xiàn)膽囊癌相關(guān)的潛在腫瘤標(biāo)志物具有重要價值。然而由于有眾多雜質(zhì)的干擾，膽汁蛋白質(zhì)的研究比其他體液更加困難。目前文獻(xiàn)報道的膽汁蛋白質(zhì)濃度差異很大。究其原因，除了個體差異外，膽汁中復(fù)雜的成分對目前蛋白質(zhì)研究方法的干擾也是重要因素。定量研究之前對其他雜質(zhì)成分的去除很大程度上決定了研究的質(zhì)量。因此，膽汁蛋白質(zhì)的研究直到21世紀(jì)初仍然比較有限，而且局限于一些高豐度蛋白，比如血漿蛋白、黏蛋白等[8]。傳統(tǒng)的膽汁蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法以雙向電泳為主，但是雙向電泳圖譜的分辨率較低[9-10]，很可能漏掉某些具有重要意義的蛋白質(zhì)。近年來，隨著蛋白質(zhì)研究技術(shù)的不斷進(jìn)展，體液的蛋白質(zhì)組學(xué)研究取得了快速發(fā)展，尤其是同位素標(biāo)記相對和絕對定量（isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ），Lable-free等一系列高通量蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法的應(yīng)用，大大推進(jìn)了膽汁蛋白質(zhì)組學(xué)的研究進(jìn)展。上世紀(jì)80年代膽汁中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)不超過50種[7,11]，而截至目前，膽汁中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)種類已經(jīng)超過了3 000種[12]。然而對膽汁來講，其復(fù)雜的成分仍然是阻礙其蛋白質(zhì)組學(xué)研究的一大障礙，膽汁蛋白質(zhì)的分離和純化也是學(xué)術(shù)界不斷探索的目標(biāo)。在本研究中，我們探索建立了一套新的膽汁蛋白質(zhì)分離純化的方法，可以獲得可靠的膽汁蛋白質(zhì)樣品。利用高通量的蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法iTRAQ進(jìn)行蛋白質(zhì)的鑒定分析，克服了二維電泳不能檢出極酸、極堿、低豐度蛋白質(zhì)等缺點，使得蛋白質(zhì)的檢出種類比傳統(tǒng)方法大大提高。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究3例膽囊結(jié)石患者膽囊膽汁取自第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院普外科行取石保膽術(shù)的患者，分別記為S1、S2、S3。3例膽囊癌膽汁取自行膽囊癌根治術(shù)的患者，分別記為C1、C2、C3?；颊呋拘畔⒁姳?。膽汁均于術(shù)中采取無菌程序抽取。抽取后立即放冰上轉(zhuǎn)送至–80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆?。所有患者無急性膽囊炎發(fā)作，所抽取膽汁無膿、血污染。

表1 患者基本特征Table 1 General profiles of the patients

1.2 試劑和儀器

Cocktail，乙二胺四乙酸（EDTA），四甲基二乙胺（TEMED），二硫蘇糖醇（DTT），甘油購于Amersco公司；胰酶（Trypsin）購于Promega公司；苯甲基磺酰氟（PMSF），三羥甲基氨基甲烷（Tris），十二烷基磺酸鈉（SDS）購于BBI公司；四乙基溴化銨（TEAB），考馬斯亮藍(lán)，溴酚藍(lán)購于Fluka公司；丙酮，異丙醇，iTRAQ標(biāo)簽試劑購于Fisher公司；碘乙酰胺（IAM），牛血清白蛋白（BSA）購于Sigma公司；其余試劑為國產(chǎn)分析純。低溫高速離心機，酶標(biāo)儀為Sigma公司產(chǎn)品；電泳儀，凝膠掃描儀Image Scanner，圖像分析軟件Decyder V5.0均為Amersham公司產(chǎn)品；液相色譜儀LC-20AD和LC-20AB為島津公司產(chǎn)品；串聯(lián)質(zhì)譜儀Q-Exactive為Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品。

1.3 膽汁蛋白質(zhì)的提取和定量

溶解樣品，每個膽汁樣品取1 mL進(jìn)行提取實驗；16 000r/min 4 ℃離心15 min，取上清，加終濃度為1 mmol/L的cocktail、2 mmol/L的EDTA,混勻，置于冰上5 min后，加入終濃度10 mmol/L DTT，冰浴超聲5 min；16 000r/min 4 ℃離心15 min，取上清，將樣品轉(zhuǎn)置10mL離心管，加5倍冷丙酮，加入終濃度10 mmol/L DTT，-20℃沉淀蛋白2 h；15 000r/min 4 ℃離心15 min，棄上清；加5倍冷丙酮，15 000r/min 4 ℃離心15 min，棄上清，重復(fù)3次至上清無色；將沉淀轉(zhuǎn)入2 mL離心管中，加1 mL冷丙酮，加入終濃度10 mmol/L DTT，-20 ℃沉淀蛋白2 h；25 000r/min 4 ℃離心15 min，棄上清；風(fēng)干沉淀，加適量裂解液（有SDS），終濃度為1 mmol/L的PMSF、2 mmol/L的 EDTA,混勻，置于冰上5 min后，加入終濃度10 mmol/L DTT；冰浴超聲5 min；25 000r/min 4 ℃離心15 min，將上清轉(zhuǎn)入新的2 mL離心管中；加終濃度10 mmol/L DTT（蛋白液體積的1%），56 ℃水浴 1 h；冷卻至室溫，加終濃度55 mmol/L IAM（蛋白液體積的1/10），暗室放置45 min；5倍體積冷丙酮沉淀樣品2 h，25 000r/min 4 ℃離心15 min，棄上清；風(fēng)干沉淀，加適量裂解液（無SDS）；加1顆5 mm磁珠，采用Tissue lyser儀器促進(jìn)蛋白質(zhì)溶解（time=120 s、功率=40 Hz/s），25 000r/min 4 ℃離心15 min，上清即為蛋白質(zhì)溶液。

用Bradford法[13]對提取的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行定量，測量3次取平均值。

1.4 SDS-PAGE和蛋白酶解

每樣取20 μg蛋白溶液加入適量上樣緩沖液混勻后95 ℃加熱5 min，25 000r/min離心5 min，取上清點入10% SDS聚丙烯酰胺凝膠的點樣孔中。120 V恒壓電泳120 min；電泳結(jié)束后，考馬斯亮藍(lán)染色2 h，之后加入適量脫色液（40%乙醇，10%乙酸）置于搖床脫色液3次，每次30 min。

每個樣品取100 μg蛋白溶液，按蛋白:酶=40:1的比例加入Trypsin酶2.5 μg，37 ℃酶解4 h。按上述比例再補加Trypsin 1次，37 ℃繼續(xù)酶解8 h。酶解的肽段利用Strata X柱進(jìn)行除鹽，真空抽干。

1.5 肽段標(biāo)記

取出iTRAQ標(biāo)簽試劑，待試劑恢復(fù)至室溫后，每管試劑加入50 μL異丙醇，渦旋震蕩后低速離心。用0.5 mol/L TEAB溶解肽段樣品，并加入到對應(yīng)iTRAQ標(biāo)簽試劑中。不同樣品肽段選用不同的iTRAQ標(biāo)簽。室溫靜置2 h。

1.6 肽段分離

采用島津LC-20AB液相系統(tǒng)，分離柱為5 μm 4.6×250 mm Gemini C18柱對樣品進(jìn)行液相分離。用2 mL流動相A（5%CAN，pH9.8）復(fù)溶抽干的肽段樣品并進(jìn)樣，以1 mL/min的流速梯度洗脫。5%流動相B（95% CAN，pH9.8）10 min，5%至35%流動相B 40 min，35%～95%流動相B 1 min，流動相B持續(xù)3 min，5%流動相B平衡10 min。在214 nm波長下監(jiān)測洗脫峰并每分鐘收集1個組分，結(jié)合色譜洗脫峰圖合并樣品得到20個組分，然后冷凍抽干。

1.7 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜

將抽干的肽段樣品用流動相A（2%ACN，0.1%FA）復(fù)溶，20 000r/min離心10 min后，取上清進(jìn)樣。通過納升液相色譜儀進(jìn)行分離。樣品首先進(jìn)入Trap柱富集并除鹽，隨后與自裝C18柱串聯(lián)，以300 nL/min流速分離。納升液相分離末端直接連接質(zhì)譜儀。經(jīng)過液相分離的肽段通過nanoESI源離子化后進(jìn)入到串聯(lián)質(zhì)譜儀Q-Exactive進(jìn)行DDA（data-dependent acquisition）模式檢測。

2 結(jié) 果

2.1 樣品完整性檢測

將提取的蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳和考馬斯亮藍(lán)染色后，膠圖條帶豐富、清晰，無明顯降解和彌散，證明樣品完整性良好（圖1）。

圖1 膽汁蛋白質(zhì)樣品聚丙烯酰胺凝膠電泳Figure 1 SDS-PAGE of bile protein samples

2.2 樣品濃度檢測

提取的蛋白質(zhì)樣品經(jīng)過濃度檢測，達(dá)到了進(jìn)行iTRAQ實驗的濃度要求，所有樣品蛋白總量均滿足3次以上實驗的需求（表2）。

表2 膽汁蛋白質(zhì)樣品濃度檢測Table 2 Detection of concentrations of the bile protein samples

2.3 肽段標(biāo)記情況

來自每一個膽汁標(biāo)本的蛋白質(zhì)樣品用一個標(biāo)簽標(biāo)記，具體如表3所示。所有樣品標(biāo)記成功率均在85%以上，達(dá)到了iTRAQ實驗所要求的標(biāo)記成功率。

表3 蛋白質(zhì)樣品肽段標(biāo)記結(jié)果Table 3 Peptide labeling results of protein samples

2.4 蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果

經(jīng)過質(zhì)譜鑒定，在“1%FDR”過濾標(biāo)準(zhǔn)下，一共鑒定到1 323個蛋白。差異蛋白以變化倍數(shù)＞1.5和P＜0.05兩個條件篩選。經(jīng)篩選，膽囊癌患者膽汁與膽囊結(jié)石患者膽汁相比，173個蛋白質(zhì)表達(dá)明顯上調(diào)，345個蛋白質(zhì)表達(dá)明顯下調(diào)。單個樣本間蛋白質(zhì)差異情況如表4所示。對這些差異蛋白質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析和驗證將有可能篩選出具有診斷或預(yù)后判斷意義的關(guān)鍵蛋白質(zhì)。

表4 單個樣本間差異蛋白數(shù)列表Table 4 List of differentially expressed proteins among singlesamples

3 討 論

蛋白質(zhì)組指一個細(xì)胞或一個組織基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)，從這一水平上去探索生命現(xiàn)象和規(guī)律已成為研究生命科學(xué)的重要手段。經(jīng)過20幾年的發(fā)展，定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法也不斷成熟，為蛋白質(zhì)差異表達(dá)分析提供了更可靠、動態(tài)范圍更廣的研究手段，也使得生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)成為了蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重點。目前，體液蛋白質(zhì)組學(xué)的研究已經(jīng)成為了發(fā)現(xiàn)腫瘤標(biāo)志物最具潛力的研究方向[14-15]。由于膽汁與膽道疾病的發(fā)病部位長期直接接觸，病變組織會通過多種機制將疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)釋放到膽汁中，例如死亡或受損細(xì)胞脫落或者直接分泌。相較于血液上萬種蛋白質(zhì)的規(guī)模，膽汁蛋白質(zhì)局部濃度高，背景干擾小，與病變部位接觸更直接。加之釋放到血液中的蛋白質(zhì)已經(jīng)被嚴(yán)重稀釋，因此把膽汁作為蛋白質(zhì)組學(xué)的研究對象比血液更有潛力發(fā)現(xiàn)重要的疾病相關(guān)蛋白質(zhì)[16]。

然而膽汁的蛋白質(zhì)組學(xué)研究面臨兩個主要的障礙。一是與血液、唾液、尿液等其他體液相比，膽汁的收集比較困難，除非通過手術(shù)或者逆行性膽胰管造影（ERCP）才可以獲取。二是膽汁成分非常復(fù)雜，其中的有機化合物和膽汁酸鹽等成分會嚴(yán)重干擾蛋白質(zhì)的分離與鑒定。傳統(tǒng)的基于等電點的分離方法（包括雙向電泳）都會因為聚焦不良而受到影響。國內(nèi)外一些學(xué)者利用雙向電泳的方法對膽汁蛋白質(zhì)的研究做過一些探索。他們對膽汁蛋白質(zhì)的分離、純化方法以及雙向電泳的條件等進(jìn)行了建立和優(yōu)化，取得了一定的成果，但是由于技術(shù)方法固有的缺陷[17]，雙向電泳的分辨率并不理想，只能得到數(shù)百個蛋白質(zhì)點，而酶解后鑒定到的蛋白質(zhì)數(shù)量更加有限[9,18-21]。另外，蛋白質(zhì)的質(zhì)譜檢測范圍也有一定的限制。一些高豐度蛋白會壓制其他低豐度蛋白的信號使其難以檢出。色譜法也可能被一些雜質(zhì)成分競爭性非特異性結(jié)合而干擾。國外有學(xué)者采用差速離心法提取膽汁蛋白質(zhì)，進(jìn)而進(jìn)行高通量蛋白質(zhì)組學(xué)研究，獲得了較為理想的結(jié)果[22-23]。然而其實驗條件過于苛刻，最高離心速度達(dá)200 000g，大多數(shù)實驗室難以達(dá)到這樣的實驗條件。另外離心法也比較費時、費力，一次處理較多樣本時工作量較大。

要克服以上困難，在進(jìn)行蛋白質(zhì)組的分析鑒定之前，簡單、可靠的膽汁蛋白質(zhì)樣品的分離、純化就顯得十分重要。然而這里存在一個矛盾，即蛋白質(zhì)提純效果不好會影響鑒定及分析的效果，純化可以去除干擾蛋白質(zhì)鑒定的非蛋白物質(zhì)，使得一些低豐度蛋白得到富集。但是過多的提取步驟則可能損失一部分蛋白質(zhì)，使一些與疾病相關(guān)的重要蛋白質(zhì)不能被鑒定到。因此如何把握二者之間的平衡就是一個值得探索的問題。本研究經(jīng)過摸索，建立了一套膽汁蛋白質(zhì)樣品分離純化的方法。提取的蛋白質(zhì)樣品經(jīng)過質(zhì)量檢測，達(dá)到了進(jìn)行下一步實驗的要求，并取得了滿意的效果。

另外由于蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)的飛速發(fā)展，傳統(tǒng)的雙向電泳的方法由于分辨率低等一些固有的缺陷，目前已經(jīng)處于被逐漸淘汰的邊緣，取而代之的是iTRAQ、Lable-free等高通量的強大蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法。iTRAQ技術(shù)利用多種同位素試劑標(biāo)記蛋白多肽N末端或賴氨酸側(cè)鏈基團(tuán)，經(jīng)高精度質(zhì)譜儀串聯(lián)分析，可同時比較多達(dá)8種樣品之間的蛋白表達(dá)量，是近年來定量蛋白質(zhì)組學(xué)常用的高通量篩選技術(shù)[24]。與傳統(tǒng)研究方法相比，iTRAQ具有明顯的技術(shù)優(yōu)勢，它能夠檢測出低豐度蛋白、強堿性蛋白以及分子量＜10 kD或＞200 kD的蛋白，分辨率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于雙向電泳，而且操作方便，效率高，大大縮短了實驗時間。

近年來由于研究手段的不斷革新，蛋白質(zhì)組學(xué)的研究又進(jìn)入了一個快速發(fā)展的時期。2004年，Kristiansen等[25]利用SDS-PAGE、凝集素親和層析、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜等手段，從一個膽管癌患者的膽汁中鑒定出了87種蛋白質(zhì)。這是最早的膽汁蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。在接下來的數(shù)年中，膽汁蛋白質(zhì)譜被逐漸擴(kuò)大[23,26-28]，目前發(fā)現(xiàn)膽汁蛋白質(zhì)種類已經(jīng)超過了3 000種，并且通過比較蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，發(fā)現(xiàn)了MAC-2BP、SSP411、NGAL、CEAM6、S100A2、α-1-抗胰蛋白酶等一批與惡性膽道梗阻相關(guān)的蛋白質(zhì)分子[29-34]。

本研究建立了簡單、可靠的膽汁蛋白質(zhì)分離、純化步驟，采用了iTRAQ的方法對分離提取的良惡性膽囊疾病的膽汁蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行了定量分析，鑒定出了1 323個蛋白質(zhì)，比國內(nèi)用傳統(tǒng)方法鑒定出的蛋白質(zhì)種類大有提高，并且實現(xiàn)了蛋白質(zhì)的精確定量，發(fā)現(xiàn)了良惡性膽囊疾病膽汁蛋白質(zhì)的顯著差異，對于進(jìn)一步的疾病標(biāo)志物的篩選和驗證具有重要應(yīng)用價值。

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