李淑華 鄭曉克 王芳 李麗 孫世珺 何丹 彭燕 周建文 何瓊 朱宇辛 王連唐★ 柯尊富★

乳腺癌是嚴(yán)重威脅女性健康的最常見的惡性腫瘤，盡管現(xiàn)有的研究已經(jīng)取得一定進(jìn)展，其發(fā)病率和死亡率仍逐年上升［1?3］。在乳腺癌中，HER?2基因的表達(dá)與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移、預(yù)后和整體生存率密切相關(guān)［4?7］，對(duì)于接受傳統(tǒng)的化療與內(nèi)分泌治療方法耐受或耐藥的患者［8?9］，針對(duì)HER?2基因的靶向藥物赫賽汀（Herceptin）更是為其治療提供了新思路。研究表明20%～30%的浸潤性乳腺癌患者尤其是浸潤性導(dǎo)管癌患者中發(fā)現(xiàn)HER?2基因的擴(kuò)增和/或 HER?2 蛋白的過表達(dá)［10?11］，因此正確檢測(cè)和評(píng)價(jià)乳腺癌HER?2狀態(tài)至關(guān)重要。美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administra?tion，F(xiàn)DA）準(zhǔn)許臨床上進(jìn)行HER?2檢測(cè)的熒光原位雜交（fluoresecencein situhybridization，F(xiàn)ISH）檢測(cè)用于檢查17號(hào)染色體著絲粒（CEP17）和HER?2基因擴(kuò)增情況，F(xiàn)ISH的敏感性和特異性較高，是目前國際公認(rèn)的HER?2基因檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”［10］。

開展HER?2室間質(zhì)控的目的是為了實(shí)現(xiàn)各檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)同一病例檢測(cè)結(jié)果保持一致性和可重復(fù)性，進(jìn)而反映患者HER?2基因的真實(shí)表達(dá)情況。乳腺癌靶向藥物赫賽汀主要應(yīng)用于HER?2基因過表達(dá)的乳腺癌患者，因此患者用藥前必須測(cè)定腫瘤組織中的HER?2基因狀態(tài)，只有通過嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)，乳腺癌患者的靶向治療才能達(dá)到最佳效果。

廣東省的三甲醫(yī)院已相繼運(yùn)用FISH技術(shù)開展臨床上乳腺癌HER?2基因的檢測(cè)，為了對(duì)我省HER?2基因檢測(cè)的基本情況進(jìn)行摸底，發(fā)現(xiàn)和解決各實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中存在的共性及個(gè)性的問題，保證不同實(shí)驗(yàn)室間檢測(cè)的一致性，廣東省病理質(zhì)控中心2015年6月舉行了廣東省HER?2室間質(zhì)控項(xiàng)目（external quality assessment，EQA），對(duì)我省廣州、深圳、汕頭等市的26家醫(yī)院及檢測(cè)機(jī)構(gòu)進(jìn)行了評(píng)估，本文將對(duì)本次質(zhì)控的情況及存在的問題進(jìn)行總結(jié)。

1 材料與方法

1.1 材料

此次質(zhì)控使用的樣本為甲醛固定的乳腺癌石蠟包埋的手術(shù)樣本，選擇HER?2不同陽性模式的石蠟切片作為質(zhì)控片標(biāo)本，共設(shè)立3個(gè)質(zhì)控品，樣本①、②為HER?2基因擴(kuò)增陽性樣本，樣本③為HER?2基因擴(kuò)增陰性樣本。此次供片單位分別為中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院、中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院、廣東省中醫(yī)院3家單位。每家供片單位提供1個(gè)樣本，該樣本提供90張切片，切片厚度均為3～5 μm，保證參與質(zhì)控的各實(shí)驗(yàn)室每個(gè)樣本有3張玻片，一張用于組織學(xué)染色，一張用于HER?2檢測(cè)，一張備用，供片單位將同一病例的首尾2張各做FISH檢測(cè)以確保質(zhì)控片質(zhì)量的一致性。供片單位于質(zhì)控活動(dòng)正式開展15日前將切片及參考結(jié)果上交廣東省臨床病理醫(yī)療質(zhì)量控制中心分子病理質(zhì)控小組，供片單位提供的質(zhì)控品在發(fā)放前需由一家分子病理質(zhì)控小組成員確定的醫(yī)院再次檢測(cè)驗(yàn)證。質(zhì)控結(jié)果由質(zhì)控小組成員采取雙盲形式進(jìn)行結(jié)果判讀。質(zhì)控樣本統(tǒng)一寄發(fā)給各參與實(shí)驗(yàn)室，每家參評(píng)單位在收到質(zhì)控玻片一個(gè)月內(nèi)完成檢測(cè)后，將“室間質(zhì)評(píng)活動(dòng)回報(bào)表”和檢測(cè)的原始玻片在低溫狀態(tài)下快遞郵寄到省臨床病理醫(yī)療質(zhì)量控制中心，質(zhì)評(píng)成績?cè)趯?shí)驗(yàn)室上報(bào)結(jié)果2周后下發(fā)。

1.2 方法

1.2.1 檢測(cè)方法

本次質(zhì)控各實(shí)驗(yàn)室采用熒光原位雜交（FISH）檢測(cè)方法?；境绦虬ńM織切片、脫蠟至水化、預(yù)處理、酶消化、脫水、變性和雜交、洗滌復(fù)染、復(fù)染閱片。操作流程按照每家單位臨床檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)操作程序（standard operating procedure，SOP）進(jìn)行。主要步驟如下：室溫下進(jìn)行組織切片，切片厚度為4 μm；100%乙醇、85%乙醇、70%乙醇梯度酒精進(jìn)行脫水，然后將玻片放至去離子水中；將玻片放入（95±5）℃的去離子水中煮片20～30 min或者將玻片放入80℃的預(yù)處理試劑中，恒溫處理10 min；將組織切片用蛋白酶K或胃蛋白酶工作液中浸泡或滴染消化；依次置于70%乙醇、85%乙醇和100%乙醇中進(jìn)行脫水；自然干燥或置45～50℃烤片機(jī)上干燥玻片，加探針后蓋上蓋玻片并用封片膠密封后放于原位雜交儀中變性雜交，也可利用水浴箱等設(shè)定好的溫度條件進(jìn)行人工變性雜交，變性溫度一般為73～83℃，變性5 min，雜交溫度為37℃或42℃，雜交時(shí)間16～20 h；雜交完成后移去蓋玻片，按照試劑盒說明書中要求的NP40及2×SSC的濃度進(jìn)行雜交后洗滌；70%乙醇處理 5 min，玻片自然干燥后滴加 4′，6?二脒基?2?苯基吲哚（4′，6?diamidino?2?phenylindole，DAPI）復(fù)染封片，避光熒光顯微鏡下進(jìn)行閱片。

1.2.2 判讀標(biāo)準(zhǔn)

判讀標(biāo)準(zhǔn)按照《乳腺癌HER?2檢測(cè)指南（2014版）》，選擇細(xì)胞核大小一致、核邊界完整、DAPI染色均一、細(xì)胞核無重疊、信號(hào)清晰的細(xì)胞。隨機(jī)計(jì)數(shù)至少20個(gè)浸潤癌細(xì)胞核中的雙色信號(hào)，判讀標(biāo)準(zhǔn)：①當(dāng)HER?2/CEP17比值≥2.0時(shí)，為HER?2陽性；HER?2/CEP17比值＜2.0，但平均HER?2拷貝數(shù)/細(xì)胞≥6.0時(shí)也為HER?2陽性。②HER?2/CEPl7比值＜2.0且平均HER?2拷貝數(shù)/細(xì)胞＜4.0時(shí)為HER?2陰性。③HER?2/CEP17比值＜2.0且平均HER?2拷貝數(shù)/細(xì)胞＜6.0，但HER?2拷貝數(shù)/細(xì)胞＞4.0時(shí)HER?2為結(jié)果不確定［12］。

1.2.3 質(zhì)評(píng)考核參數(shù)

根據(jù)各參評(píng)單位上交的資料，質(zhì)控小組各成員從檢測(cè)試劑的種類、消化液種類、消化液的濃度及消化時(shí)間、紅綠信號(hào)比值、檢測(cè)玻片的背景及信號(hào)強(qiáng)度、浸潤癌所占的細(xì)胞比例、玻片是否水煮及水煮時(shí)間、變性及雜交的溫度及時(shí)間、是否有異質(zhì)性等參數(shù)進(jìn)行結(jié)果評(píng)定。

2 結(jié)果

2.1 檢測(cè)試劑種類

本次參控單位使用的檢測(cè)試劑共有雅培（美國）、北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司、廣州安必平醫(yī)藥科技股份有限公司3家公司的試劑，從匯報(bào)的結(jié)果看，3種試劑探針本身對(duì)質(zhì)控結(jié)果的影響無明顯差異。

2.2 消化液種類及時(shí)間

本次質(zhì)控中，消化液使用了胃蛋白酶和蛋白酶K 2種消化酶，12家使用了蛋白酶K，其中11家使用的蛋白酶K濃度為200 μg/mL，消化時(shí)間為0.5～19 min，1家醫(yī)院使用的蛋白酶K濃度為150 μg/mL，消化時(shí)間為10 min。14家使用了胃蛋白酶，濃度為4 mg/mL，消化時(shí)間為5～40 min。通過鏡下觀察信號(hào)雜交情況，2種酶的消化效果無特別明顯差異。

2.3 其它參數(shù)情況

26家參評(píng)單位，除3家未采用水煮的處理方式之外，其余23家均進(jìn)行了水煮的步驟，水煮時(shí)間17～30 min，其中1家用EDTA修復(fù)液進(jìn)行水煮，其余均采用雙蒸水水煮?？傮w變性溫度為73～85℃，變性時(shí)間 5～8 min；雜交溫度 37～42℃，雜交時(shí)間12～20 h。在本次質(zhì)控中，標(biāo)本①有2家醫(yī)院的檢測(cè)報(bào)告中提及標(biāo)本存在腫瘤異質(zhì)性問題，標(biāo)本②有1家醫(yī)院檢測(cè)報(bào)告提及異質(zhì)性問題。

2.4 結(jié)果吻合率

乳腺癌標(biāo)本①結(jié)果吻合率96.15%，HER?2/CEP17比值介于 3.29～8.52，HER?2/CEP17平均值為4.12（圖1），有1家單位結(jié)果報(bào)成簇狀擴(kuò)增，鏡下觀察其玻片的紅色背景下存在非特異雜交信號(hào)，簇狀擴(kuò)增應(yīng)為誤判；乳腺癌標(biāo)本②結(jié)果吻合率84.62%，4家實(shí)驗(yàn)室報(bào)點(diǎn)擴(kuò)增，HER?2/CEP17比值介于7.49～10.27，其余實(shí)驗(yàn)室均報(bào)HER?2基因紅色信號(hào)點(diǎn)成簇（圖2）；標(biāo)本③結(jié)果吻合率100%。HER?2/CEP17 比值介于 1.00～1.79，HER?2/CEP17平均值為1.18（圖3）。

圖1 各參評(píng)實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本①的HER?2/CEP17比值情況Figure 1 The HER?2/CEP17 ratio of specimen ① in each participating laboratory

2.5 背景及信號(hào)強(qiáng)度

在熒光顯微鏡下觀察26家參評(píng)單位的玻片，DAPI通道下觀察輪廓消化過度的有2家，紅色信號(hào)強(qiáng)度較弱有2家，綠色信號(hào)強(qiáng)度較弱有1家。背景及信號(hào)強(qiáng)度結(jié)果不合格者與規(guī)范實(shí)例的典型對(duì)照如圖4，該圖像是使用OLYMPUS BX51熒光顯微鏡在100×油鏡下觀察FISH檢測(cè)的玻片后采集并合成的。參評(píng)單位中有2家單位DAPI輪廓顯示不清，甚至可見紅色與綠色信號(hào)定位于細(xì)胞外（圖4A1，4A2）。紅色信號(hào)強(qiáng)度較弱者2家（圖4B1，4B2），綠色信號(hào)強(qiáng)度較弱者 1 家（圖 4C1，4C2），通過改進(jìn)和完善制片方法可以避免類似結(jié)果發(fā)生。

3 討論

圖2 各參評(píng)實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本②的HER?2/CEP17比值情況Figure 2 The HER?2/CEP17 ratio of specimen ② in each participating laboratory

圖3 各參評(píng)實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本③的HER?2/CEP17比值情況Figure 3 The HER?2/CEP17 ratio of specimen ③ in each participating laboratory

FISH技術(shù)操作中影響染色質(zhì)量的因素較多，如果實(shí)驗(yàn)過程中操作不當(dāng)會(huì)嚴(yán)重影響最終染色結(jié)果，因此只有準(zhǔn)確地檢測(cè)HER?2基因的表達(dá)才能確?；颊呖梢詮陌邢蛑委熤蝎@益。筆者結(jié)合本次質(zhì)控中存在的問題及實(shí)驗(yàn)室在實(shí)際檢驗(yàn)中的情況，針對(duì)在FISH操作過程中一些關(guān)鍵操作步驟進(jìn)行探討。

FISH操作對(duì)組織的前期處理要求比較嚴(yán)格，要求標(biāo)本盡量在離體0.5 h內(nèi)用10%中性甲醛進(jìn)行及時(shí)、有效的固定，由于甲醛可以使DNA或蛋白質(zhì)的氨基團(tuán)間形成亞甲基網(wǎng)橋，這種交聯(lián)作用使細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)的各種生物大分子形成網(wǎng)絡(luò)，利于維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和組織形態(tài)，但這樣會(huì)影響細(xì)胞膜的通透性，阻礙核酸探針的摻入［13］。為了解石蠟組織標(biāo)本經(jīng)甲醛固定后蛋白質(zhì)分子發(fā)生交聯(lián)造成的抗原封閉問題，目前參加質(zhì)評(píng)的各實(shí)驗(yàn)室采用了高溫預(yù)處理的方法，常見的預(yù)處理的方式主要包括水煮法、硫氫化鈉法、亞硫酸氫鈉法等。在上述操作過程中水煮法最為簡便易行，本次質(zhì)控中88%的醫(yī)院采用了水煮的處理方式，該步驟主要通過高溫或化學(xué)處理消除甲醛固定所致的蛋白交聯(lián)，水煮的液體可以是去離子水、超純水或者雙蒸餾水，時(shí)間一般為15～30 min。臨床檢測(cè)中，對(duì)于一些軟組織肉瘤等類型的標(biāo)本及一些抗原封閉嚴(yán)重不利于探針雜交的組織可以嘗試用檸檬酸（pH 6.0）或EDTA（pH 9.0）抗原修復(fù)液進(jìn)行煮沸或高壓修復(fù)。在實(shí)際操作中應(yīng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)室使用的試劑盒、不同的組織標(biāo)本及探針類型采取不同的處理方式來摸索合適的高溫預(yù)處理?xiàng)l件。

圖4 FISH背景及信號(hào)強(qiáng)度檢測(cè)結(jié)果Figure 4 FISH test of background and signal intensity results

在FISH操作中，為了增加組織的通透性，使探針更好地與組織內(nèi)的DNA進(jìn)行雜交，一般采用酶消化的方法以去掉包圍靶核酸的蛋白質(zhì)。之前研究報(bào)道，一般脫落細(xì)胞用胃蛋白酶消化，活檢組織用蛋白酶K，且所有標(biāo)本在摸索條件之前應(yīng)該在顯微鏡下確定其標(biāo)本和形態(tài)類型以便靈活掌握酶的消化程度［14］。但在實(shí)際操作中，也有很多試劑盒推薦用胃酶來消化組織，胃酶比較溫和，用于消化組織也可以起到很好的效果。酶消化的時(shí)間會(huì)因酶種類的不同而有所改變，且由于標(biāo)本固定、組織結(jié)構(gòu)、性質(zhì)不同，即便在相同的熱水浴預(yù)處理、酶消化時(shí)間條件下，其組織細(xì)胞消化的程度也不一致，產(chǎn)生的背景熒光、信號(hào)熒光強(qiáng)度也不同，即信噪比也會(huì)不同［15］。此次質(zhì)控中，由于各實(shí)驗(yàn)室酶的儲(chǔ)存及效價(jià)不同，還有酶的消化方式不同，有些單位將玻片放入考普林瓶用浸泡法進(jìn)行消化，有些單位將消化液滴在玻片的組織上進(jìn)行消化，因此同種類且同濃度的酶在不同醫(yī)院間存在消化時(shí)間上的差異。為避免本次質(zhì)控中一些實(shí)驗(yàn)室出現(xiàn)消化過度的問題，可在玻片消化后置于熒光顯微鏡下的DAPI通道觀察細(xì)胞核是否清晰完整來判定消化效果，如果消化不足，鏡下細(xì)胞邊緣呈云霧狀，會(huì)影響雜交效率使信號(hào)降低甚至無法完成正常雜交造成無信號(hào)；但如果消化過度，鏡下觀察細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)空洞、核膜不完整甚至消失，引起靶核酸減少使雜交效率降低甚至無法雜交。

乳腺癌是一種典型存在異質(zhì)性的腫瘤，并且腫瘤的組織學(xué)和遺傳特性都具有異質(zhì)性［16?17］，因此，現(xiàn)有臨床數(shù)據(jù)表明并不是所有的HER?2陽性患者都能從抗HER?2靶向治療中獲益［18］。腫瘤異質(zhì)性是影響靶向藥物療效和復(fù)發(fā)的重要因素，靶向藥物選擇性殺傷依賴靶分子的腫瘤細(xì)胞，采用曲妥珠單抗治療后，如果腫瘤主要由HER?2高表達(dá)的腫瘤這類型細(xì)胞組成，靶向藥物殺滅大多數(shù)腫瘤細(xì)胞，獲得較好的短期療效，但不依賴此途徑的腫瘤細(xì)胞則可能存活而逐漸形成耐藥細(xì)胞群［19］。在日常檢測(cè)中，為避免異質(zhì)性的問題一定要規(guī)范地閱片，病理醫(yī)生在對(duì)至少20個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù)之前應(yīng)該掃描整張玻片，如果存在第二群細(xì)胞有更高的HER?2信號(hào)數(shù)/細(xì)胞，并且這群細(xì)胞由切片上超過10%的腫瘤細(xì)胞組成，應(yīng)另對(duì)這群細(xì)胞中至少20個(gè)不重疊的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)并報(bào)告，同時(shí)要對(duì)該群細(xì)胞占所有浸潤性腫瘤細(xì)胞的比例進(jìn)行報(bào)告［20］。此次質(zhì)控中出現(xiàn)參評(píng)單位的結(jié)果存在對(duì)異質(zhì)性的報(bào)告不統(tǒng)一、報(bào)告中紅綠信號(hào)比例不同以及浸潤癌占腫瘤細(xì)胞比例不同的問題，分析原因一方面是因?yàn)槭炠|(zhì)控標(biāo)本在連續(xù)切片過程中，隨著切片數(shù)量的增加，組織中的腫瘤細(xì)胞含量及結(jié)構(gòu)發(fā)生變化所致，一方面是該質(zhì)控樣本的確本身存在異質(zhì)性問題，如選擇不同區(qū)域閱片會(huì)存在差異。因此，在臨床檢測(cè)中，一旦發(fā)現(xiàn)腫瘤異質(zhì)性，應(yīng)規(guī)范地在報(bào)告中指出。

綜上所述，要保證HER?2檢測(cè)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)嚴(yán)格按照各實(shí)驗(yàn)室操作流程，保證染色過程中的溫度、緩沖液及清洗液的濃度和pH值、探針的配制等參數(shù)準(zhǔn)確，確保樣本處理、各檢測(cè)流程及判讀等各個(gè)步驟均規(guī)范化操作，只有通過不斷健全室間質(zhì)控系統(tǒng)，科學(xué)設(shè)計(jì)基礎(chǔ)與臨床實(shí)驗(yàn)流程步驟和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，配合孰知各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的檢測(cè)團(tuán)隊(duì)，定期進(jìn)行監(jiān)查活動(dòng)，才能確保臨床乳腺癌HER?2基因的檢測(cè)持續(xù)準(zhǔn)確、可靠，從而更好地為臨床診療服務(wù)。

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