張亞平 鄭志高 簡(jiǎn)保磊 朱巍巍

傳統(tǒng)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain re?action，PCR）由于需要3個(gè)不同的熱循環(huán)，還需要對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳或熒光標(biāo)記等多種操作，大大限制了其在口岸檢測(cè)和產(chǎn)地檢測(cè)等現(xiàn)場(chǎng)平臺(tái)上的應(yīng)用。隨著技術(shù)發(fā)展，已經(jīng)開發(fā)了更加方便的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)如核酸序列基礎(chǔ)擴(kuò)增（nucleic acid sequence?based amplification，NASBA）、旋轉(zhuǎn)聚合酶擴(kuò)增（rotational polymerase amplification，RPA）、解旋酶依賴擴(kuò)增（helicase dependent amplification，HDA）、聚合酶螺旋擴(kuò)增（polymerase spiral amplifi?cation，PSR）、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop?mediated iso?thermal amplification，LAMP），其中 LAMP 技術(shù)是最具有代表性的等溫（60～65℃）核酸擴(kuò)增程序。該技術(shù)通過使用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶（BstDNA polymerase）和一套共4條引物進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)首次報(bào)道于2000年，目前已經(jīng)經(jīng)歷了十余年的研究和發(fā)展，廣泛用于單核苷酸多態(tài)性、病毒和病原體檢測(cè)［1］。隨著越來越多的科學(xué)家研究LAMP技術(shù)，使得此技術(shù)使用范圍不再局限于病原微生物的檢測(cè)和定量，LAMP技術(shù)也應(yīng)用于寄生蟲和胚胎鑒定領(lǐng)域。Yeeling等［2］介紹了LAMP技術(shù)檢測(cè)弓形蟲。最近，用于檢測(cè)寄生蟲的LAMP試劑已經(jīng)被商業(yè)化。Zoheir等［3］使用LAMP方法用于牛胚胎性別鑒定。同時(shí)，研究人員也在尋找一些其他能夠與LAMP結(jié)合使用的技術(shù)，使檢測(cè)技術(shù)更加優(yōu)化。例如，Wang等［4］開發(fā)了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增?橫向流動(dòng)試紙條技術(shù)（loop?mediat?ed isothermal amplification ?lateral flow dipstick，LAMP?LFD）用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆，這種新的方法結(jié)合了免疫層析和LAMP技術(shù)，成功地把LAMP技術(shù)應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)。另外，根據(jù)實(shí)際檢測(cè)需求，研究人員對(duì)此技術(shù)進(jìn)行大量改進(jìn)，主要集中在提高特異性、加快反應(yīng)速度、簡(jiǎn)化樣本處理、實(shí)現(xiàn)多重?cái)U(kuò)增以及應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)平臺(tái)等方面。本綜述回顧了近年對(duì)LAMP技術(shù)本身簡(jiǎn)單化、快速化和產(chǎn)物檢測(cè)特異化等方面的改進(jìn)所進(jìn)行的研究，同時(shí)總結(jié)了近期開發(fā)應(yīng)用的新型LAMP檢測(cè)技術(shù)，為環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的發(fā)展和實(shí)際應(yīng)用提供依據(jù)。

1 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的基本原理及優(yōu)勢(shì)

LAMP體系的反應(yīng)溫度之所以在60～65℃范圍內(nèi)，一是因?yàn)锽stDNA聚合酶在此溫度下才具有活性，二是因?yàn)檫@是雙鏈DNA發(fā)生復(fù)性和延伸的中間溫度，DNA會(huì)呈現(xiàn)一種動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)，其中任何一條引物與DNA結(jié)合并發(fā)生擴(kuò)增時(shí)，另一條鏈會(huì)自動(dòng)脫落形成單鏈，在酶的作用下不斷發(fā)生鏈置換反應(yīng)，不斷自我循環(huán)［5］。LAMP反應(yīng)被人為地劃分成2個(gè)擴(kuò)增階段：第一階段為起始階段，主要為了形成第二階段循環(huán)的起始復(fù)合物—“頸環(huán)結(jié)構(gòu)”；第二階段是擴(kuò)增循環(huán)階段，以“頸環(huán)結(jié)構(gòu)”作為第二階段擴(kuò)增反應(yīng)的模板，啟動(dòng)新一輪鏈置換反應(yīng)，最終獲得含有不同數(shù)量的頸環(huán)結(jié)構(gòu)、不同長(zhǎng)度的DNA混合物，且產(chǎn)物是對(duì)靶序列的交替反應(yīng)擴(kuò)增的重復(fù)序列［6］。

LAMP是一種新的檢測(cè)技術(shù)，具有明顯的優(yōu)勢(shì)。第一，與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比，LAMP檢測(cè)的特異性高。4條引物分別用來擴(kuò)增6個(gè)不同靶區(qū)域，一旦任何一個(gè)引物不能準(zhǔn)確匹配，將會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)不能發(fā)生，也就是說理論上將顯著降低非特異擴(kuò)增的發(fā)生［7］。第二，LAMP的靈敏度比傳統(tǒng)PCR擴(kuò)增檢測(cè)高10～100倍，其檢測(cè)限達(dá)到10個(gè)拷貝或者更低。換言之，LAMP技術(shù)可以在很早期階段，或者在臨床癥狀不明階段，檢測(cè)到疾病的發(fā)生［8］。第三，檢測(cè)時(shí)間比傳統(tǒng)PCR擴(kuò)增檢測(cè)縮短很多。LAMP具有高度的擴(kuò)增有效性，其主要?dú)w因于無需復(fù)雜的變溫條件和不同的反應(yīng)程序。LAMP技術(shù)能夠在 15～60 min 內(nèi)，使 DNA 擴(kuò)增 109～1010倍，故與傳統(tǒng)PCR擴(kuò)增相比檢測(cè)時(shí)間能夠縮短1 h左右［9］。最后，LAMP技術(shù)最大的優(yōu)勢(shì)是操作簡(jiǎn)單和可視化檢測(cè)［10］。例如，當(dāng)運(yùn)用LAMP技術(shù)檢測(cè)病原微生物時(shí)，可以直接通過動(dòng)物疾病組織的核酸進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，而不需要進(jìn)行單獨(dú)的細(xì)菌培養(yǎng)和復(fù)雜的核酸提取步驟。同時(shí)，LAMP反應(yīng)僅需一臺(tái)恒溫設(shè)備如水浴鍋或恒溫箱就能滿足對(duì)實(shí)驗(yàn)的基本需求，其反應(yīng)設(shè)備簡(jiǎn)單。另外，LAMP反應(yīng)合成大量核酸分子的過程中，會(huì)產(chǎn)生大量的焦磷酸離子，與反應(yīng)液中Mg2+結(jié)合生成不溶于水的焦磷酸鎂，經(jīng)過離心后可以通過肉眼觀察是否有白色沉淀生成從而鑒定是否發(fā)生核酸擴(kuò)增，也可以在體系中加入適量顏色指示劑如鈣黃綠素、羥基萘酚藍(lán)、SYBR Green I等，通過相應(yīng)的顏色變化直接呈現(xiàn)出擴(kuò)增的結(jié)果。

2 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)改進(jìn)

2.1 操作簡(jiǎn)單化與快速化

LAMP技術(shù)相較于基礎(chǔ)PCR檢測(cè)技術(shù)最具特色的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單、快速。目前，LAMP技術(shù)的改進(jìn)主要集中在進(jìn)一步增強(qiáng)和發(fā)揮這2方面的優(yōu)勢(shì)。

LAMP反應(yīng)簡(jiǎn)單化目標(biāo)之一是簡(jiǎn)化加熱方法。因?yàn)長(zhǎng)AMP技術(shù)是一個(gè)等溫?cái)U(kuò)增方法，LAMP可以通過一個(gè)簡(jiǎn)單的加熱器如加熱盒和水浴槽來進(jìn)行。因此，非電力依賴的加熱系統(tǒng)使LAMP能夠在任何時(shí)間和任何地方進(jìn)行。LaBarre等［11］最近設(shè)計(jì)了一個(gè)非電力依賴的水浴系統(tǒng)，利用一個(gè)變相材料，使用化學(xué)產(chǎn)熱。Curtis等［12］同樣開發(fā)了一個(gè)相似的化學(xué)加熱器，并成功用于HIV病毒檢測(cè)。另外，Hatano等［13］憑借一個(gè)可任意使用的口袋取暖器利用LAMP技術(shù)成功檢測(cè)炭疽，并驗(yàn)證他們的系統(tǒng)是一個(gè)快速、可靠的檢測(cè)方法。Nkouawa等［14］使用一個(gè)保溫的熱水瓶進(jìn)行了LAMP分析，并報(bào)道此系統(tǒng)能夠成功用于檢測(cè)人類糞便樣品中的鏈狀帶絳蟲。這些都是簡(jiǎn)化LAMP技術(shù)加熱步驟的方法。

最近，新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室開發(fā)一個(gè)新DNA聚合酶，叫做Bst2.0或WarmStart Bst2.0。Tanner等［15］評(píng)估了這些新的聚合酶在LAMP檢測(cè)中的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)Bst2.0與野生的Bst DNA聚合酶相比，能夠催化更快的LAMP反應(yīng)速度。這些發(fā)現(xiàn)表明，開發(fā)新的DNA聚合酶是改進(jìn)LAMP技術(shù)快速化的關(guān)鍵因素。

超速提?。╬rocedure for the ultra?rapid extrac?tion，PURE）方法是一種從新鮮唾液中直接提取結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，TB）細(xì)胞的技術(shù)［16］。該技術(shù)通過使用一種吸附粉末來移除樣品中的DNA抑制劑，從而保護(hù)樣品中的DNA。并且，此技術(shù)無需復(fù)雜的設(shè)備如離心機(jī)，可以在發(fā)展中國(guó)家落后的地區(qū)使用。Nakauchi等［17］研究了一個(gè)方便使用的檢測(cè)流感病毒的提取試劑，把咽喉或鼻拭子在此試劑中攪拌幾次，即可提取流感病毒基因組RNA，同時(shí)還能消除RNA抑制劑。與其他實(shí)驗(yàn)室所進(jìn)行的前處理方法相比，這一技術(shù)無需加熱和離心。目前，這一提取試劑僅限于流感病毒的提取。Aydin?Schmidt等［18］開發(fā)了高通量DNA提取系統(tǒng)的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（high throughput DNA extraction system for loop mediated isothermal amplification，HTP?LAMP），用于檢測(cè)無癥狀人群瘧原蟲，通過商品化的和計(jì)算機(jī)控制的高通量DNA提取系統(tǒng)能夠同時(shí)提取96個(gè)樣品，其提取液可直接用于LAMP檢測(cè)，并在2 h內(nèi)獲得檢測(cè)結(jié)果。與傳統(tǒng)PCR檢測(cè)結(jié)果相比，HTP?LAMP檢測(cè)靈敏度為 40.8%（95%CI：27.0～55.8），特異性為 99.9%（95%CI：99.8～100）［18］。超速提取方法能夠大大縮短樣品中核酸的提取時(shí)間，從而提高LAMP的檢測(cè)速度，適合在大樣本檢測(cè)中使用。

2.2 檢測(cè)特異化

目前，通過簡(jiǎn)單的目視檢測(cè)技術(shù)來判斷LAMP擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果已經(jīng)有很大發(fā)展［19?20］。然而，近年來已經(jīng)開始關(guān)注不同的判斷方法［21］。在LAMP反應(yīng)體系中加入熒光標(biāo)記探針，反應(yīng)完成后，再加入低分子量的陽離子多聚物乙烯亞胺（polyethyleni?mine，PEI），產(chǎn)生PEI?DNA?probe復(fù)合物沉淀，在紫外燈下通過觀察顏色變化即可實(shí)現(xiàn)特異性檢測(cè)［22］。Seetang?Nun 等［23］將納米金顆粒標(biāo)記的DNA探針與LAMP相結(jié)合，建立了通過肉眼觀察鑒定白斑綜合征病毒（white spot syndrome virus，WSSV）的LAMP方法，此方法靈敏度可達(dá)200個(gè)拷貝，還可以用紫外可見光光譜進(jìn)行定量。Na?gatani等［24］最早將電化學(xué)方法應(yīng)用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)LAMP反應(yīng)，他們將絲網(wǎng)印刷碳電極浸入離心管中并用亞甲基藍(lán)作為雜交指示劑，擴(kuò)增產(chǎn)物與亞甲基藍(lán)結(jié)合后向電極表面緩慢彌散，引起峰電流的降低，從而進(jìn)行半實(shí)時(shí)定量。Satoh等［25］報(bào)告了一個(gè)通過電化學(xué)活性嵌入劑檢測(cè)特異DNA序列的方法，這一技術(shù)用于臨床檢測(cè)人乳頭狀瘤病毒（human papillomavirus，HPV），命名為“Clinichip HPV”。Siddique等［26］開發(fā)了一種基于groEL基因的遺傳標(biāo)記的LAMP檢測(cè)技術(shù)，用于檢測(cè)受污染海鮮和水體中副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyti?cus），其檢測(cè)限為100 fg/μL，高于PCR檢測(cè)的100倍。以上這些方法都能顯著提高LAMP技術(shù)檢測(cè)的特異性。

3 新型環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

對(duì)蛋白生物標(biāo)志物的高靈敏度和特異性檢測(cè)，在臨床疾病診斷和治療預(yù)后中顯得非常重要。粘蛋白1（mucin 1 protein），作為一種腫瘤標(biāo)志物，存在于許多惡性腫瘤中，如結(jié)直腸癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、卵巢癌、膀胱癌等［27?29］。粘蛋白1在人正常上皮細(xì)胞表達(dá)非常低，因此對(duì)其進(jìn)行靈敏度和特異性檢測(cè)在早期腫瘤診斷中就顯得非常必要。最近，Joo等［30］報(bào)道了不同的免疫環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（immuno?LAMP）平臺(tái)用于檢測(cè)蛋白質(zhì)。免疫環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)包含2個(gè)主要步驟，信號(hào)擴(kuò)增和超敏檢測(cè)。為了提高蛋白檢測(cè)的特異性和靈敏度，使用親和配體用于靶蛋白分子的識(shí)別［31?32］。配體為系列合成的DNA或RNA分子，具有高特異性和高親和性。Cao等［33］通過高親和粘蛋白1配體，開發(fā)出一種配體介導(dǎo)的免疫環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，用于定量檢測(cè)人血清樣品中粘蛋白1。其重要步驟為，生物素標(biāo)記的粘蛋白1固定在鏈霉親和素磁珠上，與粘蛋白1配體孵育；游離的粘蛋白1配體通過磁珠分離，蛋白結(jié)合的配體結(jié)構(gòu)通過加熱后解離；最后，解離的配體作為F3引物，通過re?al?time immuno?LAMP 技術(shù)進(jìn)行定量。因此，im?muno?LAMP核酸擴(kuò)增信號(hào)等同于F3引物的量，并且間接反映粘蛋白1的量。此種方法檢測(cè)限可達(dá)120個(gè)分子。

由于食物來源病原體微生物能夠引起嚴(yán)重的疾病，并可能導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟(jì)損失，因此通過分子檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)食物來源病原體來預(yù)防嚴(yán)重?fù)p失是非常必要的［34?35］。Seo 等［36］研究開發(fā)了一種高通量、微型離心裝置、基于比色法的食品來源病原體的檢測(cè)方法。開發(fā)的離心微型裝置包括一個(gè)樣品容器，一個(gè)螺旋形樣品注射微通道，24個(gè)腔室（每個(gè)2.5 μL），交叉毛細(xì)管閥門和24個(gè)反應(yīng)室。裝載樣品后行850 r/min離心，使得樣品溶液分布到24個(gè)等體積的腔室內(nèi)。然后，腔室內(nèi)的樣品可以被注射到反應(yīng)室內(nèi)，5 000 r/min離心，離心裝置放置于66℃溫箱中進(jìn)行靶基因的擴(kuò)增。對(duì)于基因擴(kuò)增方法，使用LAMP技術(shù)對(duì)3種食物來源病原體（大腸桿菌O157：H7，鼠傷寒沙門氏菌和副溶血性弧菌）進(jìn)行檢測(cè)。通過鉻黑T（eriochrome black T，EBT）介導(dǎo)的顏色變化（從紫色到天藍(lán)色）來確定病原體的存在，通過綠/紅（G/R）和藍(lán)/紅（B/R）比值來區(qū)分陽性結(jié)果和陰性結(jié)果，整個(gè)分析過程在1 h內(nèi)完成。DNA的檢測(cè)限為500個(gè)拷貝，細(xì)菌的檢測(cè)限為100個(gè)細(xì)菌數(shù)。因此，這種設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單和制造容易的微型裝置通過自動(dòng)控制2次不同轉(zhuǎn)速的離心，在60 min內(nèi)進(jìn)行基因等溫?cái)U(kuò)增，并且通過肉眼進(jìn)行比色法判斷結(jié)果的方法，為食品工業(yè)提供了一種理想的病原體檢測(cè)方法。

電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）是一種敏感性檢測(cè)方式，其在電極表面產(chǎn)生高能狀態(tài)并且促進(jìn)電子轉(zhuǎn)移，這種電子轉(zhuǎn)移現(xiàn)象能夠通過激發(fā)光而作為一種強(qiáng)度信號(hào)被檢測(cè)［37］。［Ru（bpy）3］Cl2是一種常用的ECL發(fā)光體。各種ECL生物傳感器需要核酸表面固化。最近，有研究報(bào)道了一種無需固化的ECL技術(shù)，通過設(shè)計(jì)2個(gè)輔助探針進(jìn)行 micro?RNA 檢測(cè)［38］。Roy 等［39］研究了LAMP聯(lián)合ECL技術(shù)對(duì)DNA檢測(cè)和定量分析，經(jīng)由LAMP反應(yīng)擴(kuò)增的目的DNA，通過靜電作用與碳電極表面的［Ru（bpy）3］+2結(jié)合，再通過三丙胺（TPrA）觸發(fā)ECL反應(yīng)從而發(fā)出熒光。他們把這種新技術(shù)用于檢測(cè)不同物種肉中特異序列的DNA水平。例如，從野豬肉中檢測(cè)到1 pg/μL（3.43×10?1copies/μL）的靶 DNA。對(duì)枯草桿菌（Bacillus subtilis）DNA 樣品的檢測(cè)限為 10 pg/μL（2.2×103copies/μL）。因此，這種方法的優(yōu)勢(shì)是快速檢測(cè)、最低限度的儀器使用以及更少的試劑使用。把具有高敏感性和特異性的ECL技術(shù)與LAMP快速擴(kuò)增技術(shù)結(jié)合起來成為一種有效的定量核酸檢測(cè)技術(shù)，這種技術(shù)滿足現(xiàn)代核酸檢測(cè)中快速、敏感性、特異性、易于操作以及設(shè)備微型化的要求。

目前LAMP技術(shù)主要的缺點(diǎn)是結(jié)果評(píng)估的間接性，其擴(kuò)增產(chǎn)物通過電泳、SYBR Green I染色、沉淀、羥基萘酚藍(lán)染色、濁度法、鈣黃綠素/Mn2+染色以及探針法等方法進(jìn)行確認(rèn)。這些都不能很好區(qū)分陽性產(chǎn)物和非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，從而導(dǎo)致假陽性。分子信標(biāo)（molecular beacons）具有只與目的DNA片段結(jié)合后才產(chǎn)生熒光信號(hào)的特點(diǎn)，因此作為一種直接的擴(kuò)增產(chǎn)物指示劑，能夠避免假陽性的問題。Liu等［40］研究了一種新型的分子信標(biāo)指示的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法（molecular beacon loop?mediated isothermal amplification method，MB?LAMP），明確了LAMP技術(shù)中分子信標(biāo)作為評(píng)估工具的最優(yōu)條件：長(zhǎng)度為25～45 bp，濃度為0.6～1 pmol/μL，反應(yīng)溫度為 60～65℃，并且 MB?LAMP 檢測(cè)靈敏度能夠達(dá)到1×10?6ng/μL。使用分子信標(biāo)指示的LAMP技術(shù)有效降低了檢測(cè)結(jié)果假陽性率。

在食品工業(yè)中，快速檢測(cè)食品來源病原體對(duì)阻止污染食物中病原體擴(kuò)散具有重要意義。Liu等［41］開發(fā)了一種多重實(shí)時(shí)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法（multiplex real?time loop?mediated isothermal ampli?fication，ml?LAMP），在一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)檢測(cè)沙門氏菌（Salmonella）和副溶血弧菌DNA。在65℃擴(kuò)增60 min后，通過不同的熔解溫度（Tm）來區(qū)分?jǐn)U增產(chǎn)物。使用19種已知的菌株驗(yàn)證多重LAMP技術(shù)特異性，發(fā)現(xiàn)此方法能夠100%地區(qū)分不同菌株，其檢測(cè)限與多重PCR相似。因此，多重LAMP技術(shù)在食品工業(yè)檢測(cè)中具有明顯的優(yōu)勢(shì)，能夠同時(shí)檢測(cè)多種病原菌，節(jié)約了大量時(shí)間和成本。

現(xiàn)場(chǎng)血液樣本的采集、運(yùn)輸、保存等常受到一些條件的限制，尤其是當(dāng)采集樣本數(shù)較多時(shí)，因此亟需探索易于運(yùn)輸、保存、又利于病原體核酸提取的樣本采集方法或措施。FTA卡（flinders technol?ogy associates，F(xiàn)TA）是由特制的濾紙經(jīng)強(qiáng)力變性劑、螯合劑浸泡而成，細(xì)胞與FTA卡接觸后被裂解，其核酸與纖維基質(zhì)結(jié)合，維持樣品中核酸的完整性，保護(hù)核酸免于降解，從而起到保存作用。Peng等［42］開發(fā)了一種聯(lián)合FTA技術(shù)的LAMP檢測(cè)方法，用于植物來源的北方根節(jié)線蟲（Meloido?gyne hapla）檢測(cè)，其檢測(cè)限是普通PCR檢測(cè)的100倍。Wu等［43］同樣運(yùn)用結(jié)合FTA技術(shù)的LAMP檢測(cè)方法檢測(cè)了田鼠巴貝蟲（Babesia microti）感染情況，其檢出限為0.687 fg/μL，而傳統(tǒng)的PCR最低檢測(cè)限為0.687 pg/μL，且20份樣品的陽性符合率為100%，說明此方法特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡(jiǎn)便、快速，適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。近年新型環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)總結(jié)見表1。

表1 近年新型環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)Table 1 Summary of new loop?mediated isothermal amplification technology in recent years

4 展望

LAMP技術(shù)是一種創(chuàng)新性基因擴(kuò)增方法，用來取代熱循環(huán)中的高端設(shè)備，其鏈置換反應(yīng)在等溫條件即可完成。由于其諸多優(yōu)勢(shì)已被廣泛用于核酸檢測(cè)的各個(gè)領(lǐng)域，因此LAMP技術(shù)逐步發(fā)展成為成熟、可靠的分子生物學(xué)診斷分析技術(shù)。另外，LAMP技術(shù)在蛋白生物標(biāo)志物檢測(cè)、食物來源病原體微生物檢測(cè)和轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)方面的發(fā)展，使其作為一個(gè)簡(jiǎn)單、快速的檢測(cè)方法在許多國(guó)家，特別是發(fā)展中國(guó)家廣泛應(yīng)用。然而，LAMP技術(shù)也有一些不容忽視缺點(diǎn)，比如反應(yīng)過程易受污染、檢測(cè)特異性不高，容易出現(xiàn)假陽性，因此LAMP技術(shù)的優(yōu)化道路還很漫長(zhǎng)。在未來的技術(shù)開發(fā)中，需要進(jìn)一步的研究來降低假陽性率，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性，使得以LAMP技術(shù)為基礎(chǔ)的核酸檢測(cè)具有更廣的應(yīng)用前景。

［1］Mori Y，Kanda H，Notomi T.Loop?mediated isother?mal amplification（LAMP）：recent progress in re?search and development［J］.J Infect Chemother，2013，19（3）：404?411.

［2］Yeeling L，Meganathan P，Sonaimuthu P，et al.Spe?cific，sensitive，and rapid diagnosis of active toxoplas?mosis by a loop?mediated isothermal amplification method using blood samples from patients［J］.JClin?Microbiol，2010，48（10）：3698?3702.

［3］Zoheir KMA，Allam AA.A rapid method for sexing the bovine embryo［J］.Animal Reproduction Sci，2010，119（1?2）：92?96.

［4］Wang X，Teng D，Guan Q，et al.Detection of round?up ready soybean by loop?mediated isothermal amplifi?cation combined with a lateral?flow dipstick［J］.Food control，2013，29（1）：213?220.

［5］Liu A，Guan G，Du P，et al.Loop?mediated isother?mal amplification（LAMP）method based on two spe?cies?specific primer sets for the rapid identification of Chinese Babesia bovis and B.Bigemina［J］.Parasi?tolInt，2012，61（4）：658?663.

［6］Li Y，F(xiàn)an P，Zhou S，et al.Loop?mediated isothermal amplification（LAMP）：a novel rapid detection plat?form forpathogens［J］. MicrobialPathogenesis，2017，107（3）：54?61.

［7］Sheet OH，Grabowski NT，Klein G，et al.Develop?ment and validation of a loop mediated isothermal am?plification（LAMP）assay for the detection of Staphy?lococcus aureus，in bovine mastitis milk samples［J］.MolCellProbes，2016，30（5）：320?325.

［8］Nzelu CO，Caceres AG，Guerrero?Quincho S，et al.A rapid molecular diagnosis of cutaneous leishmaniasis by colorimetric malachite green?loop?mediated isother?mal amplification（LAMP）combined with and FIA card as a direct sampling tool［J］.Acta Trop，2016，153：116?119.

［9］Zhao X，Li Y，Wang L，et al.Development and appli?cation of a loop?mediated isothermal amplification method on rapid detection Escherichia coli O157 strains from food samples［J］.MolBiolRep，2010，37（5）：2183?2188.

［10］ Zhao X，Wang L，Chu J，et al.Rapid detection of Vibrio parahaemolyticus，strains and virulent factors by loop?mediated isothermal amplification assays［J］.Food SciBiotechnol，2010，19（5）：1191?1197.

［11］ LaBarre P，Hawkins KR，Gerlach J，et al.A simple，inexpensive device for nucleic acid amplification with?out electricity：toward instrument?free molecular diag?nostics in low?resource settings［J］.Plos One，2011，6（5）：e19738.

［12］ Curtis KA，Rudolph DL，Nejad I，et al.Isothermal amplification using a chemical heating device for point?of?care detection of HIV?1［J］.Plos One，2012，7（2）：e31432.

［13］ Hatano B，Maki T，Obara T，et al.LAMP using a dis?posable pocket warmer for anthrax detection，a highly mobile and reliable method for antibioterrorism［J］.Jpn J Infect Dis，2010，63（1）：36?40.

［14］ Nkouawa A，Sako Y，Li T，et al.A loop?mediated isothermal amplification method for a differential iden?tification of Taenia tapeworms from human：applica?tion to a field survey［J］.Parasitol Int，2012，61（4）：723?725.

［15］ Tanner NA，Zhang Y，Evans TC Jr.Simultaneous multiple target detection in real?time loop?mediated iso?thermal amplification［J］.Biotechniques，2012，53（2）：81?89.

［16］ Mitarai S，Okumura M，Toyota E，et al.Evaluation of a simple loop?mediated isothermal amplification test kit for the diagnosis of tuberculosis［J］.Int J Tuberc Lung Dis，2011，15（9）：1211?1217.

［17］ Nakauchi M，Yoshkawa T，Nakai H，et al.Evalua?tion of reverse transcription loop?mediated isothermal amplification assays for rapid diagnosis of pandemic in?fluenza A/H1N1 2009 virus［J］.J Med Virol，2011，83（1）：10?15.

［18］ Aydin?Schmidt B，Morris U，Ding XC，et al.Field evaluation of a high throughput loop mediated isother?mal amplification test for the detection of asymptomat?ic plasmodium infections in Zanzibar［J］.Plos One，2017，1（12）：1?14.

［19］ Martineau RL，Murray SA，Ci S，et al.Improved per?formance of loop?mediated isothermal amplification as?say via swarm priming［J］.Analytical Chemistry，2017，89（1）：625?632.

［20］ Zhou H，Zhao M，Li X，et al.Clinical evaluation of the isothermal amplification assays for the detection of four common respiratory viruses in children with pneu?monia［J］.Arch Virol，2017，162（5）：1311?1318.

［21］ Pillai DR，Labarre P，Burton R，et al.Evaluation of non?instrumented nucleic acid amplification by loop?mediated isothermal amplification（NINA?LAMP）for the diagnosis of malaria in Northwest Ethiopia［J］.Malaria Journal，2015，14（1）：44.

［22］ Reddy G，Rao PV，Sharma S，et al.Rapid detection and differentiation of dengue virus serotypes by NS1 specific reverse transcription loop?mediated isothermal amplification（RT?LAMP）assay in patients presenting to a tertiary care hospital in Hyderabad，India［J］.Journal of Virological Methods，2015，211（4）：22?31.

［23］ Seetang?Nun Y，Jaroenram W，Sriurairatana S，et al.Visual detection of white spot syndrome virus using DNA?functionalized gold nanoparticles as probes com?bined with loop?mediated isothermal amplification［J］.Mol Cell Probes，2013，27（2）：71?79.

［24］ Nagatani N，Yamanaka K，Saito M，et al.Semi?real time electrochemical monitoring for influenza virus RNA by reverse transcription loop?mediated isothermal amplification using a USB powered portable potentio?stat［J］.Analyst，2011，136（24）：5143?5150.

［25］ Satoh T，Matsumoto K，F(xiàn)ujii T，et al.Rapid genotyp?ing of carcinogenic human papillomavirus by loop?me?diated isothermal amplification using a new automated DNA test（Clinichip HPVTM）［J］.J Virol Methods，2012，188（1?2）：83?89.

［26］ Siddique MP，Jang WJ，Lee JM，et al.groEL is a suit?able genetic marker for detecting Vibrio parahaemolyti?cus by loop?mediated isothermal amplification assay［J］.Lett Appl Microbiol，2017，2（65）：106?113.

［27］ Raina D，Kosugi M，Ahmad R，et al.Dependence on the MUC1?C oncoprotein in non?small cell lung cancer cells［J］.MolCancer Ther，2011，10（5）：806?816.

［28］ Cao H，F(xiàn)ang X，Liu P，et al.Magnetic?immuno?loop?mediated isothermal amplification based on DNA en?capsulating liposome for the ultrasensitive detection of P?glycoprotein［J］.Sci Rep，2017，7（1）：9312.

［29］ Cao H，F(xiàn)ang X，Li H，et al.Ultrasensitive detection of mucin 1 biomarker by immune?loop?mediated iso?thermal amplification［J］.Talanta，2017，164：588?592.

［30］ Pourhassan?Moghaddam M，Rahmati?Yamchi M，Ak?barzadeh A，et al.Protein detection through different platforms of immune?loop?mediated isothermal amplifi?cation［J］.Nanoscale ResLett，2013，8（1）：485.

［31］ Bernard ED，Nguyen KC，Derosa MC，et al.Develop?ment of a bead?based aptamer/antibody detection sys?tem for C?reactive protein［J］.AnalBiochem，2015，472：67?74.

［32］ Li Q，Wang Y，Shen G，et al.Split aptamer mediated endonuclease amplification for small?molecule detec?tion［J］.ChemCommun，2015，51（20）：4196?4199.

［33］ Cao H，Ye D，Zhao Q，et al.A novel aptasensor based on MUC?1 conjugated CNSs for ultrasensitive detection of tumor cells［J］.Analyst，2014，139（19）：4917?4923.

［34］ Liu CY，Song HQ，Zhang RL，et al.Specific detec?tion of Angiostrongylus cantonesis in the snail Achati?na fulica using a loop?mediated isothermal amplifica?tion（LAMP）assay［J］.Mol Cell Probes，2011，25（4）：164?167.

［35］ Safavieh M，Ahmed MU，Tolba M，et al.Microfluid?ic electrochemical assay for rapid detection and quanti?fication of Escherichia coli［J］.Biosens Bioelectron，2012，31（1）：523?528.

［36］ Seo JH，Park BH，Oh SJ，et al.Development of a high?throughput centrifugal loop?mediated isothermal amplification microdevice for multiplex foodborn pathogenic bacteria detection［J］.Sensor and Actua?tors B，2017，246：146?153.

［37］ Su M，Wei W，Liu SQ.Analytical applications of the electrochemiluminescence of tris（2，2’?bipyridyl）ru?thenium（II）coupled to capillary/microchip electropho?resis：A review［J］.Analytica Chimica Acta，2011，704（1?2）：16?32.

［38］ Liu T，Chen X，Hong CY，et al.Label?free and ultra?sensitive electrochemiluminescence detection of mi?croRNA based on long?range self?assembled DNA nanostructures［J］.Microhimica Acta，2014，181（7）：731?736.

［39］ Roy S，Rahman IA，Ahmed MU.Paper?based rapid detection of pork and chicken using LAMP?magnetic bead aggregates［J］.Analytical Methods，2016，8（11）：2391?2399.

［40］ Liu W，Huang S，Liu N，et al.Establishment of an ac?curate and fast detection method using molecular bea?cons in loop?mediated isothermal amplification assay［J］.Sci Rep，2017，7：40125.

［41］ Liu N，Zou D，Dong D，et al.Development of a mul?tiplex loop?mediated isothermal amplification method for the simultaneous detection of Salmonella spp.and Vibrio parahaemolyticus［J］.Sci Rep，2017，7：45601.

［42］ Peng H，Long H，Huang W，et al.Rapid，simple and direct detection of Meloidogyne hapla from infected root galls using loop?mediated isothermal amplification combined with FTA technology［J］.Sci Rep，2017，7：44853.

［43］ Wu F，Cai Y，Qin Z，et al.Development of loop?me?diated isothermal amplification（LAMP）assay com?bined with FTA card for detecting Babesia microti［J］.Chinese Journal of Zoonoses，2016，32（5）：435?441.