任賀成,馬曉東

(1天津市環(huán)湖醫(yī)院,天津300350；2解放軍總醫(yī)院)

白血病相關蛋白16(LRP-16)基因是近年發(fā)現(xiàn)的一種新的雌激素反應基因，最早發(fā)現(xiàn)于白血病的相關研究中。基因表達序列分析(SAGE)譜分析發(fā)現(xiàn)LRP-16在增殖活躍的雌激素相關正常組織(如睪丸、卵巢等)中高表達[1]。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)在雌激素相關腫瘤組織中，如乳腺癌、宮頸癌、子宮內膜癌、胃癌、結腸癌、前列腺癌、肺癌等，LRP-16多呈高表達，并與腫瘤的惡性生物學行為及不良預后有關[1～13]。腦膜瘤是最常見的顱內腫瘤之一，起源于蛛網膜顆粒的腦膜上皮細胞。腦膜瘤大多數(shù)為良性(WHOⅠ級)；不典型腦膜瘤(WHO Ⅱ級)占所有腦膜瘤的3%～7%；惡性腦膜瘤(WHO Ⅲ級)更少，占所有腦膜瘤的1%～3%。既往研究發(fā)現(xiàn)，性激素與腦膜瘤密切相關。研究發(fā)現(xiàn)性激素可促進體外培養(yǎng)的腦膜瘤細胞生長增殖，其中雌激素作用最明顯；腦膜瘤患者血漿性激素水平也多異于正常。與孕激素(75%)、雄激素(63%)相比，雖然雌激素受體(ER)在腦膜瘤組織中的表達率不高(22%)，但ER的表達與惡性腦膜瘤的不良預后相關[13]。與雌激素相關的LRP-16在腦膜瘤組織中的表達情況尚不明確。本研究旨在初步探討LRP-16在腦膜瘤組織中的表達情況及其意義，為腦膜瘤發(fā)病機制及治療研究提供一個新思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2006年10月～2007年5月解放軍總醫(yī)院神經外科經手術治療并經病理證實的腦膜瘤患者42例(實驗組)，其中男9例、女33例，年齡21～70(49.26±10.8)歲。病理分級：WHO Ⅰ級34例，WHO Ⅱ級3例，WHO Ⅲ級5例。按病理分級分為良性組34例，非良性組8例。以高顱壓癥狀起病者25例，以局部功能障礙起病者17例；病程(7.5±2.3)個月。納入標準：病理診斷為腦膜瘤患者;首次手術患者;年齡18～70歲。排除標準：復發(fā)后再次手術及術前行放、化療者;術中電凝灼燒的患者;合并腫瘤性綜合征的患者(如神經纖維瘤病)。腦外傷急癥手術患者32例(對照組)，男8例、女24例，年齡19～60(48.35±11.2)歲。納入標準:閉合性顱腦損傷并行硬膜擴大修補手術患者；年齡18～70歲。排除標準：開放性顱腦損傷，合并腦膜疾病(如腦膜炎)或顱內腫瘤者。兩組患者的年齡和性別有可比性。均取得患者及家屬同意，并簽署知情同意書。術中取實驗組腦膜瘤組織及對照組正常腦膜組織，標本取下后，分兩份，一份液氮保存供核酸與蛋白質抽提，另一份甲醛固定，切片蠟封供免疫組化檢測。

1.2 組織雄激素受體(AR)、ER、孕激素受體(PR)及增殖細胞核抗原(PCNA)的檢測 采用免疫組化SP法。石蠟切片脫蠟、水化、沖洗，修復；切片加過氧化酶阻斷溶液(50 μL)，室溫下孵育(10 min)，沖洗；加正常非免疫動物血清(50 μL)，孵育(室溫10 min)；除去血清，加一抗(1∶50倍稀釋，50 μL)，4 ℃過夜； PBS沖洗，加生物素標記的二抗，室溫下孵育10 min，沖洗；加鏈霉素抗生物素-過氧化酶溶液，孵育，沖洗；加新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察；蘇木素復染，沖洗返藍；經過梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察結果。以細胞內有棕黃色顆粒者為陽性細胞。顯微鏡(×400)下隨機選4個視野，計算陽性細胞個數(shù)，取平均值。AR、ER、PR染色中陽性細胞數(shù)>10%記為陽性標本，統(tǒng)計陽性標本的個數(shù)用以統(tǒng)計學分析； 計算PCNA陽性細胞占腫瘤細胞的比例(PCNA-LI)，用以表示腦膜瘤細胞的增殖活性。

1.3 組織LRP-16蛋白的檢測 采用Western blotting法。主要步驟包括①組織總蛋白的提?。毫呀庖涸? ℃下12 000 r/min離心20 min，取上清再在4 ℃下12 000 r/min離心20 min。②樣品蛋白含量的測定：標準品以0 μg調零在分光光度計上OD595比色，以測得的OD值為橫坐標，對應的蛋白濃度為縱坐標制成標準曲線；樣品在分光光度計上OD595比色，以測得的OD值計算蛋白濃度。③SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳：灌膠時，沿玻璃加入，分離膠的高度到玻璃板的2/3即可。上樣時樣品濃度與對照濃度相等，用微量進樣器貼壁吸取樣品，將樣品吸出不要吸進氣泡。電泳時電泳儀電壓調至100 V，當染料溴酚蘭進入分離膠后，將電壓調高到130 V，繼續(xù)電泳使溴酚蘭至玻璃板下沿。④轉膜。⑤封閉、抗體孵育及曝光：按說明書加入一抗、二抗。掃描結果保存為圖片文件，用Image J軟件測量LRP-16和內參 (β-actin)顯影條帶的灰度值，以二者灰度值比(LRP-16/β-actin)作為樣本中LRP-16的相對表達水平。

1.4 組織LRP-16 mRNA的檢測 采用RT-PCR法。主要步驟包括：①RNA抽提和純化：RNA的濃度=OD260×稀釋倍數(shù)×0.04 μg/μL，OD260/280 在1.8～2.1視為抽提的RNA的純度很高。②逆轉錄反應：反應體系100 mL(上述RNA溶液38.5 mL，10×RT buffer 10 mL，MgCl2(25 mmol/L) 22 mL，dNTP mixture(2.5 mmol/L) 20 mL，random hexamers(50 mmol/L) 5 mL，Rnase抑制劑(20 U/mL) 2 mL，逆轉錄酶(50 U/mL) 2.5 mL。反應程序：25 ℃ 10 min，42 ℃ 45 min，95 ℃ 5 min，4 ℃保存。③引物設計和合成：以GAPDH的值校正特異擴增基因的量，各基因擴增所用的引物序列如下：LRP-16-165 F：5′-GCGGACCTCGGCGGGAGTTGG-3′；LRP-16-903 R：5′-CAGCCGGTCCACCTTGTCCTTGT-3′；GAPDH F:5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3′；GAPDH R：5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。④熒光實時定量PCR反應體系和反應條件：SYBR?Green PCR Master Mix 12.5 μL，1 mmol/L正向、反向引物各2.5 μL，模板(RT產物1∶5稀釋)2.0 μL，H2O 5.25 μL，總體積為25.0 μL；以NTC、NRTC為陰性對照。反應條件：95 ℃ 8.5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，60～95 ℃ 20 min。⑤將不同濃度定量模板的對數(shù)和相應CT值作圖，做標準曲線。用已知不同濃度的RNA反轉錄成cDNA制作標準曲線。濃度分別為10、20、30、40 ng/μL。以目的基因與GAPDH的比值(LRP-16/GAPDH)表示LRP-16 mRNA的相對表達量。

2 結果

2.1 兩組LRP-16、AR、ER、PR、PCNA表達比較 實驗組LRP-16灰度值為0.729±0.249，高于對照組(0.015±0.005)(P<0.01)。實驗組LRP-16 mRNA的相對表達量為0.205±0.134，高于對照組(0.003±0.001)(P<0.01)。實驗組PR陽性率為69.0%(29/42)，PCNA-LI為88.1%(37/42)，對照組未檢測到PR和PCNA陽性標本。所有標本未檢測到AR、ER染色。

2.2 腦膜瘤組織LRP-16 mRNA表達與患者PR、PCNA及WHO病理分級的關系 良性組LRP-16 mRNA的相對表達量為0.169±0.081，非良性組為0.361±0.200，兩者比較，P<0.05。PR陽性患者及PR陰性患者LRP-16 mRNA相對表達量分別為0.216 ± 0.142、0.180 ± 0.115，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。實驗組LRP-16 mRNA與PCNA-LI呈正相關(rs=0.769，P<0.01)。因所有標本未檢測到AR、ER染色，LRP-16表達與AR、ER的相關關系未行探討。

3 討論

LRP-16基因是一種新的人類基因，1999年發(fā)現(xiàn)于白血病的相關研究中，故得名“白血病相關蛋白”。該基因定位于染色體11q12.1，含外顯子11個，轉錄本長1 225 bp，編碼325個氨基酸，翻譯產物是一種核蛋白，屬于macro domain家族。SAGE譜分析發(fā)現(xiàn)在各種人類細胞內LRP-16均有表達，增殖活躍的組織(睪丸、卵巢等)或腫瘤細胞中，該基因呈高表達[1]。LRP-16是一種雌激素反應基因，雌激素、雄激素可以上調其表達水平。

研究發(fā)現(xiàn)，LRP-16過表達可以促進乳腺癌MCF-7細胞增殖，抑制LRP-16表達可限制MCF-7細胞的增殖；同時LRP-16與MCF-7細胞的體外黏附、侵襲與遷移能力有關[11]。對人乳腺癌研究也發(fā)現(xiàn)，LRP-16 mRNA的表達量與乳腺癌直徑呈正相關，同時LRP-16 mRNA與乳腺癌的臨床分期、淋巴結轉移等有關[4,9]。對于子宮內膜癌Ishikawa細胞，LRP-16過表達能提高其體外侵襲能力，可能通過下調E-鈣黏著素起作用[12]。對于漿液性卵巢腫瘤的研究提示，LRP-16在卵巢癌中的表達高于交界性腫瘤，并與其臨床分期呈正相關[2,5]。對于前列腺癌，LRP-16過表達能夠促進前列腺癌DU145細胞的生長。LRP-16基因的表達與非小細胞肺癌的分化程度有關[10]。臨床病理研究發(fā)現(xiàn)，LRP-16與肺部神經內分泌腫瘤的分型、臨床分期和患者生存期有關[3]。對于消化系統(tǒng)惡性腫瘤，LRP-16在胃癌、結腸癌中均呈高表達，并與腫瘤的臨床病理分期、大小、浸潤深度、淋巴結轉移和遠處轉移相關，過表達LRP-16提示不良預后[6,7]。

腦膜瘤是最常見顱內腫瘤之一，起源于蛛網膜顆粒的腦膜上皮細胞。雖然大多數(shù)為良性，但惡性者并不罕見。腦膜瘤與性激素密切相關。女性腦膜瘤患者多于男性，絕經期前后女性性激素變化，此時期是女性腦膜瘤的高發(fā)年齡。腦膜瘤常于妊娠期而生長加速，可能與妊娠期性激素增加有關。腦膜瘤可并發(fā)于其他性激素相關腫瘤，如乳腺癌。本研究結果顯示，實驗組LRP-16基因在mRNA及蛋白水平的表達均高于對照組；并且LRP-16 mRNA在非良性腦膜瘤中的表達高于良性腫瘤。提示LRP-16基因可能與腦膜瘤的發(fā)生發(fā)展有關，且可能與惡性的腦膜瘤關系更為密切。PCNA-LI是評價細胞增殖活性的良好指標。本研究顯示LRP-16 mRNA在腦膜瘤中的表達與PCNA-LI呈正相關，提示LRP-16表達與腦膜瘤的細胞增殖呈正相關關系。這些結果與既往研究發(fā)現(xiàn)的LRP-16與性激素腫瘤相關、并與腫瘤的惡性生物學行為相關的特點相符合。雖然本研究顯示PR陽性組腦膜瘤組織中的LRP-16 mRNA表達高于PR陰性組，但這一發(fā)現(xiàn)并無統(tǒng)計學意義。遺憾的是本文腦膜瘤標本中AR、ER均為陰性。陰性結果可能與下列因素有關：既往研究提示AR、ER在腦膜瘤組織中陽性率不高，ER與惡性腦膜瘤有關，而本組腦膜瘤例數(shù)較少，惡性腦膜瘤更少；實驗試劑、實驗方法和技術經驗方面的因素造成假陰性結果。

總之，本研究結果提示，腦膜瘤組織中LRP-16基因的表達升高，LRP-16的表達與腦膜瘤的細胞增殖和病理分級有關。然而本研究仍有許多不足之處，如研究對象例數(shù)較少，實驗設計簡單等。LRP-16與腦膜瘤的關系有待于進一步深入研究。

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