褚建祎，張祥林

(錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121000)

磁共振成像技術(shù)(Magnetic Resonance Imaging，MRI)具有三維高質(zhì)量軟組織成像，高空間分辨率、無放射性輻射損傷等優(yōu)點，已成為臨床醫(yī)學影像診斷最常用和最重要手段[1-2]。同時，造影劑(contrast agents)的使用能夠有效提高 MRI 診斷的對比度、分辨率和靈敏度，統(tǒng)計表明，30%以上的 MRI診斷需要使用造影劑增強檢查[3]。目前最常見的造影劑多為基于 Gd3+，F(xiàn)e3+/Fe2+的順磁性物質(zhì)，如釓噴酸葡胺(Gd-DTPA)和鐵羧葡胺(Resovist)。

隨著納米技術(shù)的發(fā)展，基于Gd基的超小納米粒子得到了良好的發(fā)展。由于納米尺寸效應的優(yōu)勢，使其具有良好的藥代動力學及較長的體內(nèi)存留時間，并且能夠顯著提高弛豫率和靈敏度，可以作為杰出的T1增強造影劑。以往有研究工作表明，GdF3[4]、GdPO4[5]、NaGdF4[6]用做MRI造影增強，均顯示良好的分散性，穩(wěn)定性和較高的弛豫率，能夠明顯的縮短水分子縱向弛豫時間。本文擬利用溶劑法一步制備超小Gd2O3納米粒子，Gd2O3納米粒子表面單位體積Gd3+離子密度為最大，因為其弛豫率最高，可極大提高MRI造影增強的靈敏度。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

乙酸釓Gd(OAC)3(99.99%)，二甲基亞砜(DMSO)，四甲基氫氧化銨(TMAH)，羧基端-三乙二醇，二氯甲烷均購買于Sigma-Aldrich公司，纖維素透析袋(截留分子量：1 000)及尼龍超濾膜(孔徑：0.2 μm)購買于Spectrum Labs公司。Gd2O3納米粒子的形貌和尺寸通過FEI Tecnai G2型透射電子顯微鏡進行觀察。將制備好的納米粒子的懸浮液超聲分散后，取一滴滴于銅網(wǎng)上，自然干燥。1.4 T Bruker minispec mq 60 NMR分析儀用于測量Gd2O3納米粒子的弛豫率，同時MagnetomVerio 3.0 TMRI 掃描儀(Siemens，德國)對Gd2O3納米粒子進行體外成像研究。最后納米粒子水溶液中的Gd濃度由Perkin Elmer 公司Optima 4300 DV型電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀測定。

1.2 方法

1.2.1 制備 Gd2O3納米粒子。首先將67 mg，0.02 mmol Gd(OAc)3溶于3 mL DMSO溶液，超聲分散后，將含有100 mg，0.056 mmol的四甲基氫氧化銨的1 mL乙醇溶液逐滴加入上述DMSO溶液中。全部加入之后，磁性攪拌上述混合液2 h。加入5 mL乙醇到上述溶液中，輕輕攪拌。然后利用高速離心機在12 000 rpm下離心10 min，收集產(chǎn)物為Gd2O3納米粒子，利用離心和乙醇對產(chǎn)物超小Gd2O3納米粒子進行反復清洗3次。最后將獲得的Gd2O3納米粒子分散到1 mL的二氯甲烷中。

1.2.2 表面功能修飾Gd2O3納米粒子 將40 mg，0.05 mmol的羧基端-三乙二醇溶于1 mL的二氯甲烷中，然后在室溫下滴加到Gd2O3納米粒子的溶液中，將混合溶液封口，磁力攪拌過夜后至溶液變得澄清。將6 mL的環(huán)己烷加入到反應器中，此時產(chǎn)生大量的絮狀沉淀。利用高速離心機在12 000 rpm下離心10 min，羧基端-三乙二醇修飾的Gd2O3納米粒子(F-Gd2O3)。收集產(chǎn)物，反復利用環(huán)己烷/二氯甲烷對產(chǎn)物進行沉淀和溶解3次，從而獲得了將產(chǎn)物通過尼龍超濾膜(0.22 μm)，真空干燥40 h，從而獲得了性質(zhì)穩(wěn)定的功能化Gd2O3納米粒子。利用Optima 4300 DV 型電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀對納米粒子中的Gd3+離子進行測量，所占比重大約為47%。

1.2.3 功能化Gd2O3納米粒子穩(wěn)定性測試 將制備的功能化Gd2O3納米粒子溶于pH=7.4的PBS溶液中，將其置于室溫下進行放置，利用動態(tài)光散射儀分別對1、3、5、7、14、21 d時對溶液中納米粒子的水合離子半徑進行測量，反映功能化Gd2O3納米粒子的聚集狀態(tài)，從而檢驗納米粒子的穩(wěn)定性。

1.2.4 功能化Gd2O3納米粒子的弛豫率測定 將功能化Gd2O3納米粒子分別配制成一系列的水懸浮液，濃度依次為0.05 mmol/L(記為mM)、0.10、0.20 mM、0.40 M、0.80 M，同時將pH=7.4的PBS溶液作為對照組，利用1.4 T Bruker minispec mq 60 NMR分析儀對其在40 ℃時的弛豫速率1/T1進行測量，并且對1/T1(S-1)和Gd(mM)進行作圖，從而得出縱向弛豫率r1。

1.2.5 MRI成像 配置不同濃度的能化Gd2O3納米粒子，分別為0.06、0.1、0.5 mM，同時用水做對照劑。利用MagnetomVerio 3.0T MRI 掃描儀對樣品進行MRI的T1加權(quán)成像，MRI 成像采用T1加權(quán)自旋回波序列(SE)，參數(shù)設(shè)置如下：TR 482 ms，TE 16 ms；層厚1 mm，層間距5.2 mm；數(shù)據(jù)矩陣436×512。

2 結(jié) 果

2.1 功能Gd2O3納米粒子的形貌與性質(zhì)分析

制備的功能化Gd2O3納米粒子的形貌與粒徑可通過TEM和HRTEM進行觀測(圖1)。功能化Gd2O3納米粒子的形態(tài)規(guī)則，呈球形，粒徑均勻分布，大小約為2.5 nm 范圍內(nèi)，具有較強的尺寸優(yōu)勢和高的表面積。另外，通過羧基端-三乙二醇的表面連接，使其能夠極好地溶解在水溶液中，并且能夠在室溫下穩(wěn)定存在，對其水合半徑的測試結(jié)果表明，在測定期間內(nèi)，納米粒子的水合半徑?jīng)]有明顯變化，表明表面羧基端-三乙二醇的修飾能夠有效的防止納米粒子因表面積造成的團聚，顯示了較好的穩(wěn)定性(圖2)。

圖1 功能化Gd2O3納米粒子的電子透射電鏡照片(a)和高分辨電子透射電鏡照片(b)

圖2 室溫下不同時間內(nèi)的Gd2O3納米粒子的水合離子半徑檢測圖3 功能化Gd2O3納米粒子水溶液的1/T1對Gd濃度的依賴關(guān)系

2.2 功能化Gd2O3納米粒子的弛豫率分析

如圖3所示，功能化Gd2O3納米粒子的弛豫率分析顯示制備的功能化Gd2O3納米粒子的水懸浮液的馳豫速率1/T1對Gd濃度的依賴關(guān)系。擬合直線為y=0.2301+78.203 7 CGd濃度，故功能化Gd2O3納米粒子的縱向馳豫率r1為8.203 7 mM-1．S-1。

2.3 功能化Gd2O3納米粒子的體外T1加權(quán)MRI成像

不同濃度的功能化Gd2O3納米粒子的體外T1加權(quán)MRI成像如圖4所示，其中水作為對照劑，對應的Gd2O3納米粒子溶液的信號強度與其濃度表現(xiàn)出明顯的依靠關(guān)系，隨著濃度逐漸增大，對比的MRI成像亮度增加，信號逐漸提高。

圖4 功能化Gd2O3納米粒子的體外T1加權(quán)MRI成像圖

3 討 論

鐵基造影劑一般是常用于T2的造影劑(陰性 MRI 造影劑)，以縮短橫向馳豫時間為主，降低磁共振信號強度，圖像呈暗色，在造影增強過程中，易與出血點、鈣化點、金屬沉積部位等低信號混淆，導致臨床診斷困難。另外超順磁性造影劑對磁場高度敏感，會干擾鄰近正常組織的磁場，導致影像模糊或病變周圍背景的破壞(磁敏感偽影或模糊效應)，也會給臨床診斷帶來困難[7-8]。所以T2造影劑在臨床中應用較少，其應用前景和潛力遠不如T1造影劑應用廣泛。相對于鐵基造影劑，Gd3+基絡(luò)合物造影劑作為T1造影劑(陽性 MRI 造影劑)，可顯著提高磁共振的信號強度，圖像呈白或亮色，是MRI T1造影劑的最佳選擇[9]。自Schering AG 公司最先研發(fā)的Gd-DTPA(Magnevist?)成為第一個進入臨床應用的造影劑以來[10]，有大量的釓造影劑被先后研發(fā)出來，并進入臨床應用階段，Gd-DTPA-BMA(Omniscan?)[11]，釓弗塞胺Gd-DTPA-BMEA(OptiMARK?)[12]，釓鋇葡胺Gd-BOPTA(MultiHance?)[13]和釓塞酸二鈉Gd-EOB-DTPA(Primovist?)[14]，釓特二葡甲胺Gd-DOTA(Dotarems?)[15]及其衍生物等等。盡管Gd3+基絡(luò)合物造影劑目前已經(jīng)廣泛地用于臨床使用，但其增強信號強度弱，成像時間長，使用劑量大，靈敏度低等缺陷仍然限制了其在臨床中的進一步應用。

眾所周知，水分子沒有未成對電子，電子自旋磁矩為零，不具有磁性，為反磁性物質(zhì)。在沒有Gd2O3納米粒子存在的時候，水分子的縱向馳豫時間很長。然而，當有Gd2O3納米粒子存在的水溶液中，水分子的縱向馳豫時間會明顯縮短，而且隨著釓離子濃度的增加，水分子的縱向馳豫時間會呈現(xiàn)等比減趨勢，因此縱向馳豫時間T1的倒數(shù)1/T1與釓離子的濃度會呈線性正相關(guān)遞進。本實驗結(jié)果可以看出，與理論結(jié)果相符，Gd2O3納米粒子的1/T1與Gd濃度呈線性關(guān)系并且擬合程度較好，縱向馳豫率r1為8.203 7 mM-1S-1。相比于臨床常用的Gd-DTPA(r1為4.8 mM-1S-1)，Gd2O3納米粒子顯示了較高的縱向馳豫率，因此具有更好的MRI成像能力。

如圖4結(jié)果所示，水的信號強度很低，對應的MRI 成像呈暗色，這與水分子的反磁性性質(zhì)相對應。而作為造影劑，功能化Gd2O3納米粒子溶液的 MRI 圖像明亮，對應的信號強度與其濃度表現(xiàn)出明顯的依靠關(guān)系，隨著濃度逐漸增大，對比的MRI成像亮度增加，信號逐漸提高。這說明制備的功能化Gd2O3納米粒子作為T1加權(quán)造影劑可以明顯縮短縱向馳豫時間T1，并隨著功能化Gd2O3納米粒子濃度的增加縮短顯著，T1加權(quán)MRI成像的信號強度隨著縱向馳豫時間的縮短呈現(xiàn)增強趨勢。

本文通過溶劑法一步制備了超小的功能化Gd2O3納米粒子，研究表明，功能化Gd2O3納米粒子具有杰出的分散性，穩(wěn)定性和縱向馳豫率，并且在體外的MRI成像證明了其可以作為一種出色的MRI增強造影劑用于未來的MRI成像研究。

(此文圖1-4見附頁1)

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