桂士良 崔大偉 王偉群 王茉琳 遲寶進(jìn)魏 博 崔騰騰 羅振國(guó) 郭玉剛 曹會(huì)峰

1. 佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿科（佳木斯 154002）；2. 金華市中心醫(yī)院婦科；3. 佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，飲食結(jié)構(gòu)的調(diào)整，糖尿病的發(fā)病率在逐年升高，有資料顯示2014年糖尿病在18歲以上人群的發(fā)病率為9%，近年來糖尿病出現(xiàn)年輕化趨勢(shì)，糖尿病引起的生殖功能損傷也逐漸引起重視。麒麟丸是我國(guó)眾多改善生殖功能中藥的一種，因其臨床顯著效果及能改善男女雙方生殖功能而被臨床廣泛應(yīng)用，現(xiàn)初步探索麒麟丸在糖尿病大鼠中應(yīng)用效果及可能機(jī)制。

材料與方法

一、主要試劑和儀器

麒麟丸（國(guó)藥準(zhǔn)字Z10930034，90g/瓶，廣東太安堂藥業(yè)股份有限公司）；鏈脲佐菌素（美國(guó)sigma）；DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物公司）；檸檬酸，檸檬酸鈉（天津市北辰方正試劑廠）；兔抗鼠AGEs抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；兔抗鼠RAGEs抗體（英國(guó)abcam）；鼠抗兔二抗（北京中杉金橋生物公司）；血糖儀及血糖試紙（羅氏）；蛋白電泳及電轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（北京六一）。

二、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與糖尿病模型制備

6周齡清潔級(jí)雄性wistar大鼠，體質(zhì)量180～220g，共60只（購(gòu)于佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），飼養(yǎng)在佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心獨(dú)立籠盒系統(tǒng)中，溫度18～24℃，濕度40%～80%，照明時(shí)間晝/夜12/12h。隨機(jī)分成A組（正常組）、B組（正常+麒麟丸）每組10只，模型組40只。A組、B組均自由飲水，自由飲食；模型組高脂高糖飲食（在標(biāo)準(zhǔn)飼料基礎(chǔ)上添加蔗糖、煉豬油、蛋黃，熱能21.6kJ/kg），自由飲水1個(gè)月。模型組大鼠禁食不禁水12h后按45mg/kg的STZ（STZ溶解于pH4.2～4.5檸檬酸緩沖溶液配制成1% STZ溶液）腹腔注射，注射結(jié)束后大鼠放回原籠盒系統(tǒng)正常進(jìn)食，進(jìn)水12h，再次禁食不禁水12h，同樣方法按30mg/kg腹腔注射STZ溶液，72h后測(cè)血糖一次，低于10mmol/L大鼠再次按30mg/kg腹腔注射STZ溶液，一周后禁食不禁水12h再次測(cè)血糖一次，血糖≥16.7mmol/L為造模成功，共25只，隨機(jī)分成C組（糖尿病組）12只和D組（糖尿病+麒麟丸）13只，均繼續(xù)高脂高糖飲食，B組和D組大鼠每天按0.36g/kg麒麟丸灌胃，動(dòng)物中心飼養(yǎng)6周后測(cè)量大鼠體質(zhì)量和血糖。

三、動(dòng)物取材

10%水合氯醛腹腔注射（60～80mg/kg）麻醉大鼠，經(jīng)腹腔切口取出雙側(cè)睪丸及附睪并稱量，左側(cè)睪丸生理鹽水清洗后立即凍存?zhèn)溆?，右?cè)睪丸生理鹽水沖洗后放入甲醛固定；取左側(cè)附睪按下述方法計(jì)數(shù)精子。

四、睪丸組織免疫組化和免疫印記

標(biāo)本10%甲醛固定后常規(guī)脫水浸蠟后石蠟包埋，4μm切片，SP法制作免疫組化載玻片，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精脫色后返藍(lán)，再脫水后中性樹膠封片。

解凍標(biāo)本，切成每塊0.1g，放入PV管中加入RIPA 500μL；冰上電動(dòng)勻漿器研磨至混懸液；低溫離心機(jī)4℃，6000×g，離心60min，取部分上清液按BCA蛋白定量試劑盒操作說明行蛋白定量；同時(shí)分裝PV管中剩余上清蛋白樣本，分裝后按1:5加入loading buffer（5×），沸水煮蛋白15min，上樣電泳分離蛋白并電轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，依次脫脂奶粉封閉，孵育一抗，二抗，ECL化學(xué)發(fā)光，全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光采象，結(jié)果按RAGEs /β-action表示。

五、附睪精子計(jì)數(shù)

取左側(cè)附睪置于6mL M-199精子孵育液中，眼科剪剪成微小碎塊，放置37℃水浴鍋孵育15min應(yīng)用紅細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)精子數(shù)量。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多樣本數(shù)據(jù)間比較采用方差分析，使用SPASS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，設(shè)定P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、糖尿病大鼠體質(zhì)量、血糖及睪丸質(zhì)量

在糖尿病大鼠成模后出現(xiàn)多飲、多食、多尿、消瘦和毛發(fā)欠光澤，在飼養(yǎng)過程中C組大鼠死亡1只，6周后各組大鼠體質(zhì)量和血糖值見表1，從表中看出糖尿病組大鼠較正常組大鼠體質(zhì)量減輕，血糖升高；比較糖尿病大鼠和正常大鼠睪丸質(zhì)量，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），糖尿病組大鼠睪丸質(zhì)量較正常大鼠睪丸質(zhì)量減輕；比較正常組大鼠和正常組加麒麟丸干預(yù)的大鼠睪丸質(zhì)量，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），比較麒麟丸干預(yù)的糖尿病大鼠和糖尿病組大鼠睪丸質(zhì)量，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明麒麟丸能改善糖尿病大鼠睪丸質(zhì)量，對(duì)正常大鼠無影響。

表1 各組大鼠血糖、體質(zhì)量及睪丸質(zhì)量

二、附睪精子計(jì)數(shù)

附睪精子計(jì)數(shù)見表1，比較正常組大鼠與糖尿病組大鼠精子數(shù)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明糖尿病大鼠精子數(shù)量下降；比較糖尿病組大鼠和麒麟丸干預(yù)的糖尿病組大鼠精子數(shù)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），比較正常大鼠和麒麟丸干預(yù)的正常組大鼠精子數(shù)量，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明麒麟丸能改善糖尿病大鼠精子數(shù)量，對(duì)正常大鼠精子數(shù)量改善不明顯。

三、睪丸組織免疫組化和免疫印記

各組大鼠睪丸組織中終末糖基化產(chǎn)物（AGEs）結(jié)果如圖1所示，深色顆粒為陽性表達(dá)，通過計(jì)算吸光度值比較發(fā)現(xiàn)，正常組與糖尿病組大鼠睪丸組織陽性表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明糖尿病組大鼠較正常大鼠睪丸組織中出現(xiàn)AGEs累積；糖尿病組和麒麟丸干預(yù)的糖尿病組大鼠睪丸組織陽性表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；正常組和麒麟丸干預(yù)的正常組大鼠睪丸組織中陽性表達(dá)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明麒麟丸能改善糖尿病大鼠睪丸組織中AGEs的累積，對(duì)正常大鼠睪丸組織中AGEs累積影響不明顯。

圖1 各組大鼠睪丸組織AGEs免疫組化結(jié)果

各組大鼠睪丸組織中終末糖基化受體（RAGEs）表達(dá)情況（免疫組化見圖2，免疫印記見圖3），比較發(fā)現(xiàn)RAGs表達(dá)情況與AGEs累積成正相關(guān)，表明在糖尿病睪丸組織中AGEs累積能上調(diào)RAGEs表達(dá)，可能在糖尿病中AGEs通過其受體RAGEs作用影響糖尿病大鼠睪丸功能。

圖2 各組大鼠睪丸組織RAGEs免疫組化結(jié)果

圖3 各組大鼠免疫印記結(jié)果

討 論

糖尿病引起的男性生殖功能損傷作為糖尿病并發(fā)癥之一嚴(yán)重影響男性生殖功能[1]，近年來隨著飲食結(jié)構(gòu)調(diào)整，糖尿病發(fā)病率不斷升高并出現(xiàn)年輕化趨勢(shì)，有資料顯示糖尿病人群發(fā)生生殖功能損傷是正常人群的5～10倍[2]，同時(shí)因?yàn)樘悄虿∫鸬哪行陨彻δ軗p傷病因復(fù)雜治療困難，積極尋找致病機(jī)制成為研究熱點(diǎn)。

糖尿病是以血糖增高為主的一組代謝性疾病，包括糖脂代謝紊亂，內(nèi)分泌失調(diào)，神經(jīng)血管病變等[3]，因此糖尿病并發(fā)癥涉及多個(gè)系統(tǒng)，多種病因，研究發(fā)現(xiàn)高糖環(huán)境加快糖基化過程，引起多器官終末糖基化產(chǎn)物的累積，終末糖基化產(chǎn)物的累積被證實(shí)與糖尿病的多種并發(fā)癥相關(guān)[4-7]。在糖尿病大鼠睪丸組織中終末糖基化產(chǎn)物的累積同時(shí)上調(diào)終末糖基化產(chǎn)物受體表達(dá)對(duì)生殖功能損傷已經(jīng)被證實(shí)[8,9]，因此，探索在糖尿病大鼠中降低終末糖基化產(chǎn)物對(duì)于其生殖功能的保護(hù)意義重大。

在大量臨床實(shí)踐和臨床研究中已經(jīng)證實(shí)麒麟丸對(duì)男性少精和弱精療效顯著，并在臨床中廣泛應(yīng)用[10,11]，作為我國(guó)傳統(tǒng)中藥之一為男性生殖作出極大貢獻(xiàn)。麒麟丸對(duì)糖尿病生殖損傷的研究罕見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)即初步探索麒麟丸對(duì)糖尿病大鼠的生殖損傷保護(hù)作用及可能機(jī)制。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠睪丸組織中終末糖基化產(chǎn)物累積明顯，終末糖基化產(chǎn)物受體表達(dá)明顯升高，與既往研究相符[8]，同時(shí)麒麟丸對(duì)糖尿病大鼠睪丸保護(hù)作用明顯，麒麟丸干預(yù)的糖尿病大鼠睪丸組織中終末糖基化產(chǎn)物的累積明顯減少，同時(shí)下調(diào)終末糖基化產(chǎn)物受體的表達(dá)，因此麒麟丸對(duì)糖尿病大鼠睪丸保護(hù)作用可能是通過干預(yù)糖尿病大鼠睪丸組織中終末糖基化產(chǎn)物的生成同時(shí)下調(diào)其受體的表達(dá)對(duì)其起保護(hù)作用。有研究發(fā)現(xiàn)終末糖基化產(chǎn)物通過受體介導(dǎo)引起睪丸組織氧化應(yīng)激對(duì)睪丸生殖功能產(chǎn)生損傷[2]；既往許多研究均證實(shí)終末糖基化產(chǎn)物與睪丸生殖功能損傷存在相關(guān)性，本課題組前期研究亦發(fā)現(xiàn)終末糖基化產(chǎn)物能通過其受體降低硫化氫的產(chǎn)生，因此終末糖基化產(chǎn)物累積及受體表達(dá)上調(diào)是糖尿病生殖損傷的原因之一，麒麟丸能顯著改善糖尿病大鼠睪丸組織中終末糖基化產(chǎn)物的累積，下調(diào)其受體的表達(dá)，保護(hù)糖尿病大鼠睪丸的生殖功能，但對(duì)下游通路的干預(yù)尚不明確有待進(jìn)一步探究。

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