美合日古麗·薩塔爾 張盼盼 斯依提·阿木提買買提祖農(nóng)·買蘇爾 姚巧玲 蔣 萍 阿地力江·伊明**

1. 新疆醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院人體解剖學教研室（烏魯木齊 830011）；2. 新疆醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院病理生理學教研室；3. 新疆醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生理學教研室

膽固醇向孕烯醇酮轉化是類固醇激素生物合成的必經(jīng)途徑，該反應發(fā)生在線粒體內膜上，但其反應底物膽固醇卻位于線粒體外膜的細胞質中[1]，類固醇激素合成急性調節(jié)蛋白（steroidogenic acute regulatory protein , StAR protein）在此過程中起著重要調節(jié)作用。長期慢性濕寒刺激是眾多疾病的發(fā)病誘因，異常黏液質證候與陽痿病證模型大鼠性腺軸相關激素發(fā)生紊亂[2]，本文探討異常黏液質型證候與陽痿病證模型大鼠睪丸間質細胞StAR的表達。

材料和方法

一、實驗動物

取正常SD雄性大鼠40只，雌性20只（用于交配實驗），體質量為（200±20）g，均由新疆醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

二、主要儀器與試劑

人工氣候箱（上海博迅實業(yè)有限公司，型號：BIC-400）；凝膠成像系統(tǒng)（美國Proteinsimple，型號：FluorChem E）；阿撲嗎啡（美國Sigma公司）；伊木薩克片（新疆和田維吾爾藥業(yè)有限責任公司，批號：20130501）；睪酮放免試劑盒（北京北方生物技術研究所有限公司）；兔抗鼠StAR抗體（Santa Cruz公司）；羊抗兔二抗試劑盒（北京中杉金橋生物有限公司）；化學發(fā)光試劑盒（日本nacalai 公司）。

三、實驗方法

（一）動物模型的建立和分組

將40只雄性大鼠經(jīng)適應性飼養(yǎng)1周后，通過性行為學與阿撲嗎啡（apomorphin，APO）實驗，證實其具有正常性功能后納入實驗，隨機取8只雄性SD大鼠為正常組，余32只復制異常黏液質證候模型，造模20周后通過APO勃起實驗和性行為學實驗篩選出陽痿病證模型后，隨機分為病證模型組、病證用藥組，未成陽痿者隨機分為證候模型組及證候用藥組，兩用藥組采用伊木薩克片干預2周。

（二）取材

用藥2周后，1%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，腹主動脈采血，分離血清；取一側睪丸，常規(guī)光、電鏡標本固定。另一側睪丸凍存?zhèn)溆谩?/p>

（三）放免法檢測血清中睪酮含量

用放免法檢測血清T含量，具體操作過程按試劑盒說明書在新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院核醫(yī)學放免實驗室進行。

（四）形態(tài)學標本制作

將甲醛固定的睪丸組織進行常規(guī)脫水、石蠟包埋，切片厚4μm，常規(guī)蘇木素-伊紅（hematoxylin and eosin,H-E）染色，中性樹膠封片后，光鏡下觀察。將戊二醛和鋨酸雙固定的睪丸組織丙酮梯度脫水，Epon環(huán)氧樹脂包埋切片，鉛鈾染色（由新疆醫(yī)科大學電鏡室制作），JEOLJEM1230透視電鏡下觀察。

（五）免疫組織化學顯色與評分

睪丸標本經(jīng)4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋，切片厚4μm。采用過氧化酶標記的鏈霉卵白素（S-P）免疫組織化學（immunohistochemistry，IHC）DAB顯色，蘇木精復染，常規(guī)脫水、透明、封固。PBS代替一抗作為陰性對照。光鏡下評分方法：光鏡下每張睪丸切片選取10個不重復視野（×200）觀察陽性范圍（0～100）和著色密度（0：無著色；1：弱著色；2：中度著色；3：強著色），最終結果=（陽性范圍×著色密度）/觀察視野；分值范圍：0～300。

（六）免疫印跡檢測StAR蛋白的表達

睪丸組織裂解、定量檢測蛋白濃度，20μg 蛋白樣品上樣于10% 聚丙烯酰胺（SDS-PAGE） 凝膠進行電泳，將蛋白轉印至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，PVDF膜用兔源性多克隆抗體StAR（1:500）和β-Tublin（1:1 000）4℃冰箱孵育過夜，TBST洗滌后，滴加二抗室溫孵育2 h，洗膜，然后在目的條帶上滴加化學發(fā)光（enhanced chemiluminescent, ECL）劑，在化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)發(fā)光檢測蛋白表達。將獲得的圖像在ImageJ分析軟件進行灰度分析，分別測量StAR蛋白條帶灰度值和β-Tublin蛋白條帶灰度值，兩值相除得出StAR蛋白相對表達量。

四、統(tǒng)計學處理

結 果

一、血清睪酮含量結果

3只大鼠造模過程中死亡。放免法血清睪酮含量檢測結果顯示，與正常組相比，兩模型組外周血睪酮水平明顯降低（P＜0.05）。伊木薩克片干預2周后，證候用藥組較證候模型組T水平明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），病證用藥組較病證模型組T水平亦有所上升，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表1）。

表1 各組大鼠血清睪酮含量變化（±s）

表1 各組大鼠血清睪酮含量變化（±s）

注：與正常組比較，*為P ＜0.05 ；與證候模型組比較，#為P ＜0.05

正常組(n=8) 模型組 用藥組證候(n=8) 病證(n=8) 證候(n=5) 病證(n=8)外周血睪(ng/mL) 1.53±0.79 0.37±0.22* 0.32±0.17* 0.77±0.13# 0.43±0.21*

二、 睪丸光鏡形態(tài)學觀察結果

1. 正常組：形態(tài)結構未見異常（見圖1A1、圖1A2）。

圖1 各組大鼠睪丸H-E及IHC染色結果

2. 證候模型組：生精細胞數(shù)量明顯減少，部分生精細胞壞死脫落（見圖1B1、圖1B2）。

3. 病證模型組：生精細胞數(shù)量及間質細胞數(shù)量減少，并伴生精管腔內精子數(shù)量減少或無精子（見圖1C1、圖1C2）。

4. 證候用藥組：生精小管形態(tài)、生精細胞數(shù)量同正常組（見圖1D1、圖1D2）。

5. 病證用藥組：生精小管形態(tài)、生精細胞數(shù)量較病證模型組改變不明顯（見圖1E1、圖1E2）。

三、 睪丸電鏡觀察

1. 正常組：精原細胞、支持細胞緊靠基膜且排列致密，各類生精細胞層數(shù)較多，精母細胞核圓，線粒體豐富，生精小管管腔內可見較多精子（見圖2A）。

2. 證候模型組：生精細胞層數(shù)減少，部分壞死，少見精子細胞，管腔內可見精子，胞質電子密度變深，粗面內質網(wǎng)擴張（見圖2B）。

3. 病證模型組：各級生精細胞數(shù)量明顯減少，可見精原細胞、精母細胞核固縮，精子細胞界限不清；支持細胞粗面內質網(wǎng)部分擴張（見圖2C）。

4. 證候用藥組：生精細胞數(shù)量增多，胞質電子密度恢復正常（見圖2D）。

5. 病證用藥組：生精細胞數(shù)量有所增加，管腔內可見少量精子（見圖2E）。

圖2 各組大鼠睪丸電鏡結果（×2500）

四、睪丸StAR蛋白免疫組化結果

證候模型組（143.5±22.9）和病證模型組（133.2±64.9）StAR表達水平顯著低于正常組（232.6±58.6），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；證候用藥組（216.0±47.7）大鼠睪丸間質中StAR表達水平高于證候模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；病證用藥組（159.2±38.3）表達水平與病證模型組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（見圖1A3至圖1E3）。

五、 睪丸StAR蛋白免疫印跡結果

各組印跡結果見圖3。經(jīng)統(tǒng)計學處理,與正常組（0.71±0.19）相比，證候模型組（0.34±0.05）、病證模型組（0.27±0.08）StAR蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）；證候用藥組StAR蛋白表達水平（0.53±0.05）較證候模型組顯著升高（P＜0.05），病證用藥組表達水平（0.36±0.09）與病證模型組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（見圖3）。

圖3 睪丸StAR蛋白免疫印跡結果

討 論

膽固醇由位于睪丸間質細胞線粒體外膜上的StAR轉運至線粒體內膜[3,4]，在細胞色素 P450膽固醇側鏈裂解酶（P450scc）的催化下，膽固醇被轉化為孕烯醇酮，后者被轉運至滑面內質網(wǎng)，一方面在β羥類固醇脫氫酶（3β-HSD）作用下被轉化為孕酮 ，另一方面被細胞色素 P450 17α羥化酶（P450c17）催化為17-羥孕酮和雄烯二酮；雄烯二酮在17β羥類固醇脫氫酶（17β-HSD）作用下生成睪酮[5]。目前認為StAR在膽固醇轉運中起限速作用，StAR蛋白表達水平與孕烯醇酮的合成水平呈正相關[6,7]。

已知異常黏液質型證候與陽痿病證模型大鼠精子活率與活力顯著性下降，同時外周血清睪酮水平顯著降低，本研究結果顯示，光、電鏡下證候模型組及病證模型組睪丸生精小管生精細胞數(shù)量明顯少于正常組，生精上皮部分壞死，管腔內精子數(shù)量明顯減少或無精子，支持細胞內質網(wǎng)擴張；兩用藥組上述形態(tài)結構改變部分得到恢復；免疫組織化學及免疫印跡結果顯示兩模型組大鼠睪丸間質細胞中StAR蛋白較正常組顯著降低，兩用藥組StAR蛋白水平較模型組上調。

綜上表明，異常黏液質證候及陽痿病證模型大鼠睪丸形態(tài)結構可發(fā)生病理改變，其機制可能與睪酮水平下降、睪丸間質細胞StAR水平下降有關，而對證維藥伊木薩克片可在一定程度上改善此病理變化。本研究團隊在以往工作中，依據(jù)維吾爾醫(yī)學 “體液論”，建立了維醫(yī)證候和病證概念模型，而該模型亦可出現(xiàn)精子數(shù)量減少，活力降低，這不僅體現(xiàn)了維醫(yī)異常黏液質型陽痿與少弱精子癥的同證異病的科學內涵，同時也提示濕寒性環(huán)境結合特定的飼料可致使生殖功能受損，這與在寒冷飼養(yǎng)環(huán)境下牛的腎上腺功能低下，雌三醇與睪酮水平減低，影響受孕的文獻報道[8,9]有一定的類似性。因此，是否睪酮水平的降低是異常黏液質證候及陽痿病證的發(fā)病基礎，是否睪丸間質細胞StAR水平下降是該模型睪酮水平變化的物質基礎，是否能在上述理論基礎上建立異常黏液質型少弱精子癥模型大鼠，仍有待進一步研究。

1 Stocco D M.StAR protein and the regulation of steroid hormone biosynthesis. Ann Rev Physiol 2001; 63(1): 193-213

2 劉鳳霞, 臘博雅, 劉琪, 等. RhoA/Rho激酶在異常黏液質證候及陽痿病證大鼠陰莖中的表達及伊木薩克片干預的研究. 中國男科學雜志 2016; 30(9): 5-9

3 Chang C, Chen YT, YEH SD, et a1. Infertility with defective spermatogenesis and hypotestosteronemia in male mice lacking the androgen receptor in Sertoli cells. Proc Natl Acad Sci USA 2004; 101(18): 6876-6881

4 Miller WL. StAR Search-What we know about how the steroidogenic acute regulatory protein mediates mitochondrial cholesterol import. Mol Endocrino1 2007;21(3): 589-601

5 Payne AH, Youngblood GL. Regulation of expression of steroidogenic enzymes in Leydig cells. Biol Reprod 1995; 52(2): 217-225

6 Stocco DM, Chen W. Presence of identica1 mitochondrial proteins in unstimulated constitutive steroid-producing R2C rat Leydig tumor and stimulated nonconstitutive steroidproducing MA-10 mouse Leydig tumor cells. Endocrinology 1991; 128(4): 1918-1926

7 Luo L, Chen H, Stocco DM, et al. Leydig cell protein synthesis and steroidogensis in response to acute stimulation by luteinizing hormone in rats. Biol Reprod 1998; 59(2):263-270

8 Lammoglia MA, Bellows RA, Grings EE, et al. Effects of feeding beef females supplemental fat during gestation on cold tolerance in newborn calves. J Anim Sci 1999; 77(4):824

9 Gwazdauskas FC. Effects of climate on reproduction in cattle. J Dairy Sci 1985; 68(6): 1568