龔俊華，游 逾，龔建平

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院肝膽外科 400010)

1 細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)概述

隨著對EVs生物學(xué)特性的深入理解，描述EVs的術(shù)語已經(jīng)發(fā)生了很大變化，過去?；Q使用的“微泡”、“外泌體”和“微?！钡刃g(shù)語已被重新定義[1]。現(xiàn)在認(rèn)為外泌體、微泡和微粒都是屬于EVs的亞群，它們共同組成了EVs群體[1]。外泌體是起源于多泡體、直徑為50～150 nm的勻質(zhì)小囊泡[2]；微泡則是由細(xì)胞膜直接產(chǎn)生，直徑為100～1 000 nm[3]；凋亡小體形態(tài)類似細(xì)胞碎片，直徑為500～2 000 nm[3]。在這些亞群的相互鑒別方面，一些蛋白質(zhì)，如脂筏結(jié)構(gòu)蛋白1、熱休克蛋白70或主要組織相容性復(fù)合物(major histocompatibility complex，MHC)Ⅰ類和Ⅱ類蛋白質(zhì)等，曾被視為區(qū)分不同EVs亞群的標(biāo)記物，然而新近研究表明這些標(biāo)記物并不具有特異性[4]。隨著組織化學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，特定的分子模式未來將有助于對不同類型囊泡的認(rèn)識和鑒別，但由于提取技術(shù)、鑒定方法及命名學(xué)的混亂等原因，現(xiàn)在區(qū)分這些亞群仍然很困難。因此，在本文中使用統(tǒng)一的術(shù)語“EVs”來特指微泡和外泌體[1]。

EVs由囊內(nèi)容物(蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸)和其外圍包裹的磷脂雙分子層組成[1]。在肝臟中，肝細(xì)胞分泌的EVs可通過細(xì)胞外液而進(jìn)入血液循環(huán)。EVs攜帶的內(nèi)容物信息代表了分泌之初其親代細(xì)胞的細(xì)胞狀態(tài)，且這些內(nèi)容物會(huì)隨著親代細(xì)胞分泌EVs時(shí)的狀態(tài)和所處環(huán)境的改變而發(fā)生動(dòng)態(tài)的變化[5]。雖然EVs最初被認(rèn)為不具備生物學(xué)研究價(jià)值而并未引起重視，但近年研究表明,EVs是細(xì)胞間信息傳遞的重要紐帶，肝臟和其他組織分泌的EVs為臨床診斷各種肝臟疾病提供了重要的生物標(biāo)志物，并可能成為肝臟疾病潛在的治療靶點(diǎn)。

2 肝源EVs及其作用靶點(diǎn)

2.1源于肝臟的EVs 肝細(xì)胞既可以分泌EVs，同時(shí)也是其自身分泌的或者其他器官產(chǎn)生的EVs的作用靶點(diǎn)[6]。在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，肝臟中的大多數(shù)細(xì)胞，包括肝細(xì)胞、膽管細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSCs)、內(nèi)皮細(xì)胞(sinusoidal endothelial cells，SECs)、庫普弗細(xì)胞及其他免疫細(xì)胞群如巨噬細(xì)胞等，都可以分泌EVs[1]。各種肝細(xì)胞(包括小鼠和人類原代肝細(xì)胞及肝癌細(xì)胞系)都能分泌外泌體和微泡。在不同的肝臟疾病中，這些囊泡的數(shù)量和內(nèi)容物均可不同，且都能對細(xì)胞間的信息傳遞進(jìn)行調(diào)控[7]。蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明，大鼠肝細(xì)胞源EVs中大約251種蛋白產(chǎn)自原代的肝細(xì)胞[8]。在對包括EVs中所描述的四旋蛋白及其他類型的細(xì)胞表面標(biāo)記(包括CD63、CD81和CD82)及脫唾液酸糖蛋白受體1跨細(xì)胞膜蛋白進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，由肝細(xì)胞分泌的EVs可引起上述蛋白中肝細(xì)胞特異性受體水平增多。肝細(xì)胞源EVs攜帶的內(nèi)容物涉及多種功能的蛋白質(zhì)，如細(xì)胞色素蛋白、凝血相關(guān)蛋白和載脂蛋白類，此外肝細(xì)胞分泌的EVs還參與了肝臟解毒過程[1]。在肝硬化中，有研究發(fā)現(xiàn)，肝硬化患者與健康個(gè)體相比血漿中肝細(xì)胞衍生的EVs含有較高的細(xì)胞角蛋白18，而且相關(guān)白細(xì)胞內(nèi)皮衍生物和肝細(xì)胞性EVs的數(shù)量與肝硬化程度密切相關(guān)[1]。除了肝細(xì)胞，SECs也可分泌功能性EVs,被內(nèi)吞攝取后的SECs源性EVs可觸發(fā)依賴1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate,S1P)的HSCs遷移，表明EVs在SECs和HSCs之間起著調(diào)節(jié)溝通作用[9]。肝臟中豐富的免疫細(xì)胞群為EVs提供了另一個(gè)重要的來源：體外研究表明，免疫細(xì)胞來源的EVs可以介導(dǎo)肝臟中不同類型的免疫細(xì)胞和實(shí)質(zhì)細(xì)胞之間進(jìn)行信息傳遞[10]。

雖然有關(guān)外泌體介導(dǎo)肝臟細(xì)胞間信息傳遞已有大量報(bào)道，但其所涉及的肝臟生物學(xué)進(jìn)程及其具體機(jī)制還未闡明，有待進(jìn)一步探索。比如在缺血再灌注損傷或部分肝切除小鼠模型中，肝細(xì)胞來源的EVs可調(diào)節(jié)肝臟修復(fù)，并通過轉(zhuǎn)移神經(jīng)鞘氨醇酶和鞘氨基醇激酶2促進(jìn)肝臟再生，同時(shí)增加靶細(xì)胞中S1P的產(chǎn)生[11]。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞在乙醇暴露后通過外泌體轉(zhuǎn)移miRNA-27a可造成M2表型巨噬細(xì)胞活化，實(shí)現(xiàn)巨噬細(xì)胞與巨噬細(xì)胞間的信息傳遞[5]。以上研究表明，EVs可由肝臟中一種細(xì)胞釋放而由另一種細(xì)胞攝取，由此完成生物信息分子(如miRNAs)介導(dǎo)的細(xì)胞間信息傳遞，最終引起受體細(xì)胞的功能變化[1]。此外由于EVs的內(nèi)容物會(huì)隨著肝臟細(xì)胞所處環(huán)境和狀態(tài)的變化而改變，所以EVs可作為一種生物標(biāo)記物用于肝臟疾病的檢測[1,8]。

2.2肝臟是EVs的作用靶點(diǎn) 目前主流觀點(diǎn)認(rèn)為，肝臟是機(jī)體EVs分布和作用的主要靶點(diǎn)之一，而這與肝臟攝取了大量非肝臟源EVs有一定關(guān)系[12]。雖然有研究表明，特定的EVs配體，如跨膜四蛋白或MCHⅠ和MCHⅡ，可以通過不同的信號通路與靶細(xì)胞直接進(jìn)行信息交流而不需要攝取EVs，但大多數(shù)EVs功能的發(fā)揮還是通過EVs攝取后的信息釋放[13]。細(xì)胞攝取EVs的方式主要是通過內(nèi)吞途徑，包括網(wǎng)格蛋白依賴和非網(wǎng)格蛋白依賴的內(nèi)吞[14]。而肝臟正是EVs細(xì)胞內(nèi)吞的高活性區(qū)域：IMAI等[15]報(bào)道源自小鼠黑色素瘤細(xì)胞系B16BL6并標(biāo)記了PKH26的外泌體能被肝臟和脾臟中的巨噬細(xì)胞吞噬攝取，但卻不能被肺的巨噬細(xì)胞攝取。此外，BALA等[16]對miRNA-155基因敲除的小鼠靜脈注射含miRNA-155外泌體豐富的血漿并進(jìn)行相關(guān)檢測后發(fā)現(xiàn)：肝臟中miRNA-155的表達(dá)明顯增加，而腎臟卻增加不明顯，提示肝臟細(xì)胞中確實(shí)發(fā)生了外源性外泌體內(nèi)信息分子的攝??；在肝臟中miRNA-155表達(dá)變化最明顯的是肝細(xì)胞和肝臟單核細(xì)胞，表明機(jī)體外泌體的快速攝取和清除主要是由肝臟完成的；在該實(shí)驗(yàn)中，血清外泌體濃度峰值在注射5 min后，而30 min后循環(huán)中已幾乎測不到外泌體，表明了外泌體在體內(nèi)的快速生物學(xué)分布和代謝過程。此外還有研究表明，EVs攜帶的miRNA-146a和miRNA-155可調(diào)節(jié)小鼠對內(nèi)毒素引發(fā)的炎癥反應(yīng)[17]。總之，這些研究表明以肝臟細(xì)胞為靶點(diǎn)的外泌體廣泛參與了肝臟多項(xiàng)生物學(xué)進(jìn)程。

3 EVs在各種肝臟疾病中的作用

關(guān)于EVs在各種肝臟疾病如病毒性肝炎、酒精肝、脂肪肝、藥物性肝損傷(DILI)、肝纖維化及肝癌等中的作用已有多篇報(bào)道，本文不再贅述。

4 EVs可作為肝臟疾病診斷的生物標(biāo)志物

4.1以EVs作為生物標(biāo)志物的優(yōu)勢 尋找生物標(biāo)記物是肝臟疾病的一種早期診斷方法，可用于監(jiān)測和評價(jià)各種肝臟疾病的診療情況。雖然肝臟活檢仍然是診斷肝臟疾病的金標(biāo)準(zhǔn)，但生物標(biāo)記物在肝臟疾病的無創(chuàng)檢測和判斷分期方面仍有很廣泛的應(yīng)用，如利用“體液活檢”尋找生物標(biāo)記物，可以減少或者避免對肝臟的有創(chuàng)檢查。目前，肝損傷程度評估多基于血液肝臟酶譜檢查，如丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)和γ-谷氨酰氨基轉(zhuǎn)移酶(GGT)。然而，這些傳統(tǒng)酶類標(biāo)記物對肝臟疾病診斷特異性欠佳，也不能反應(yīng)肝病的進(jìn)展階段或肝細(xì)胞損傷程度。因此，尋找新的診斷肝臟疾病的生物標(biāo)志物很有必要。

EVs在肝臟疾病中作為生物標(biāo)志物有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)由于外層有膜覆蓋，EVs可保護(hù)其內(nèi)的蛋白質(zhì)和核酸不被降解。(2)EVs富含特異性選擇標(biāo)記物，這些標(biāo)記物在體液的總蛋白組中只占了很少的一部分(<0.01%)[18]。這種診斷分子富集的優(yōu)勢使EVs有能力檢測到現(xiàn)有檢測手段難以檢測到的低豐度核酸或蛋白質(zhì)生物標(biāo)記。(3)EVs作為生物標(biāo)志物，與總血漿或血清相比，將降低化驗(yàn)分析的復(fù)雜性。(4)EVs的數(shù)量反映了組織中細(xì)胞新陳代謝的快慢，對其攜帶物進(jìn)行分析可以為疾病進(jìn)展、恢復(fù)和藥物反應(yīng)提供直接的信息。因此，探索新的EVs中核酸和蛋白生物標(biāo)記物可為評估疾病進(jìn)展、預(yù)后和治療反應(yīng)開辟新的途徑。EVs中特定蛋白質(zhì)或核酸水平也可作為生物標(biāo)志物用于檢測不同的肝臟疾病，然而在現(xiàn)有的獨(dú)立研究中還無一種生物標(biāo)志物在臨床上得到驗(yàn)證，亦少見關(guān)于這些生物標(biāo)志物在肝病中敏感性和特異性的研究報(bào)道，相關(guān)應(yīng)用仍有待進(jìn)一步研究。

4.2外泌體中蛋白質(zhì)作為肝臟疾病生物標(biāo)志物的潛在應(yīng)用 有關(guān)將EVs中蛋白質(zhì)信息應(yīng)用于肝臟疾病生物標(biāo)志方面，已有數(shù)種蛋白獲得了認(rèn)可，包括全長可溶性受體型酪氨酸蛋白磷酸酶γ(sPTGRG)、結(jié)締組織生長因子(GTGF)和S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)等。在人和大鼠的血漿中，與EVs有關(guān)的sPTGRG亞型已經(jīng)被認(rèn)定為肝臟損傷的生物標(biāo)記物[19]。分別對低ALT水平(ALT<40 U/mL)或高ALT水平(ALT>450 U/mL)人血漿樣品觀察后發(fā)現(xiàn)，血漿中sPTGRG水平與肝臟的損傷程度呈正相關(guān)[19]。EVs還被證明是CFGT的傳送器：其可在HSCs間傳遞CTGF并放大纖維增生信號。有研究發(fā)現(xiàn)，含有CTGF的EVs可作為一種非侵入性的蛋白質(zhì)生物標(biāo)記物來評估肝纖維化的嚴(yán)重程度[20]。在一項(xiàng)蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，從人工培養(yǎng)的肝細(xì)胞中分泌以及肝損傷的小鼠血清中提取的EVs，一些肝臟特異性蛋白的水平有所增加，如氨甲酰磷酸合成酶1(CPS1)、SMAS和兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)；通過對部分肝切除的小鼠進(jìn)行觀察后發(fā)現(xiàn)，SAMS的上調(diào)是肝臟組織再生的必要條件[21]。利用親和力分離的方法，可以從肝細(xì)胞癌患者血液循環(huán)的EVs中分離出特異性單克隆抗體。這些肝臟特異性循環(huán)EVs的水平在患者體內(nèi)有所增加，并與肝癌的大小密切相關(guān)。在另一項(xiàng)對急性肝損傷動(dòng)物模型尿液樣本的研究中，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)蛋白質(zhì)CD26、CD81、SLC3A1和CD10，可作為肝病的生物標(biāo)志物。在對D-氨基半乳糖急性肝損傷患者進(jìn)行治療時(shí)，通過對小鼠尿液中EVs檢測發(fā)現(xiàn)，一些通?？稍谀蛑忻鞔_地檢測到的蛋白質(zhì)數(shù)量明顯減少，表明尿中EVs的蛋白質(zhì)攜帶物可以反映肝臟的損傷程度[22]。

4.3外泌體中核酸作為肝臟疾病生物標(biāo)志物的潛在應(yīng)用 與EVs相關(guān)的核酸，特別是miRNAs作為多種肝臟疾病的生物標(biāo)志物，已引起了廣泛關(guān)注。研究表明miRNAs可以為肝癌的潛在生物標(biāo)志物，與肝癌經(jīng)肝切除術(shù)后未復(fù)發(fā)的患者相比，肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)的患者血漿中外泌體內(nèi)miRNA-718表達(dá)明顯減少。對一個(gè)獨(dú)立患者隊(duì)列進(jìn)行的研究表明，miRNA-718水平的下降與肝細(xì)胞肝癌(HCC)腫瘤的高侵襲性相關(guān)[23]。肝癌患者含有miRNA-21的血清EVs水平與EVs耗竭血清相比有所增加，和健康人及慢性乙型肝炎患者相比，HCC患者血清外泌體中的miRNA-21的水平較高。雖然血清miRNA-21表達(dá)水平在肝硬化后肝癌中的診斷價(jià)值早已獲得認(rèn)可，但EVs中miRNA-21相較而言具有更高的診斷敏感性[24]。

不同程度的乙醇性肝損害，或者對乙酰氨基酚或Toll樣受體(TLR)9配體[胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸(CpG)和脂多糖(LPS)]肝損害模型中，血清和血漿中miRNA-122的水平隨著血清ALT水平的升高而增加?；加信c炎癥相關(guān)的肝病(如乙醇性肝損害或CpG和LPS處理后的肝損害)的小鼠體內(nèi)，miRNA-155和miRNA-146a等炎癥相關(guān)miRNAs在血清和血漿中均有升高[25]。在模擬乙醇介導(dǎo)的肝損害如乙醇性肝損害或CpG和LPS處理后的肝損害模型中，血清及血漿miRNA-122和miRNA-155則主要與小鼠體內(nèi)的EVs豐度有關(guān)；與健康的個(gè)體相比，急性酒精性肝炎患者循環(huán)EVs的數(shù)量也有所增加。通過與健康個(gè)體對比并針對每個(gè)人分別建立的基礎(chǔ)基線水平后發(fā)現(xiàn)，酒精性肝炎患者或酗酒后，EVs的數(shù)量和囊泡中miRNA-122的水平均大幅提高。miRNA-192和miRNA-30a在長期飼飲乙醇的小鼠或慢性酒精性肝炎患者的血清中提取的EVs中表達(dá)均升高。在這些miRNAs中，miRNA-192對酒精性肝炎的診斷準(zhǔn)確性最高[26]。綜上所述，EVs中核酸水平可以作為各種肝臟疾病診斷及判斷其嚴(yán)重?fù)p害程度的生物學(xué)標(biāo)志物。

5 EVs作為肝臟疾病的治療方法

使用EVs特別是外泌體，可作為藥物干擾RNA(RNAi)的潛在有效載體。生物相容性和對核糖核酸酶、朊酶類的抗性及轉(zhuǎn)移的穩(wěn)定性使EVs成為藥品的理想載體，否則蛋白質(zhì)、miRNA、沉默RNA(siRNA)等其他分子會(huì)迅速降解。EVs為組織針對性的siRNA和miRNAs調(diào)控基因在靶細(xì)胞中表達(dá)提供了一條新途徑。研究證實(shí)肝臟是靜脈注射后EVs主要的攝取部位[16]，表明EVs在信息傳遞中的潛在用途及以RNA為基礎(chǔ)的靶向RNA干預(yù)療法在肝臟疾病中的應(yīng)用潛力。有研究發(fā)現(xiàn)，EVs在體內(nèi)外均可有效地向巨噬細(xì)胞和肝細(xì)胞提供miRNA-155過表達(dá)或抑制信號[16]。miRNA-155早已被證明是一種調(diào)解人酒精性肝病和肝臟炎癥的重要物質(zhì)，但如何靶向運(yùn)送miRNA-155仍是相關(guān)應(yīng)用的主要障礙。一項(xiàng)新近研究選取來自B細(xì)胞源的EVs(其miRNA-155的天然水平很低，被視為外源miRNA-155合成模擬信號并抑制RAW巨噬細(xì)胞的理想載體)并傳遞miRNA-155至靶細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)對miRNA-155的干預(yù)誘導(dǎo)了RAW巨噬細(xì)胞的抑制，并使腫瘤壞死因子(TNF)蛋白活性產(chǎn)物下降超過大于50%[27]。提取miRNA-155敲除小鼠體內(nèi)的肝細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，EVs能成功地向肝臟傳遞一個(gè)外源性的miRNA-155模擬信號[16,27]。

有研究表明，EVs參與了修復(fù)組織和器官損傷，這也可以解釋其在干細(xì)胞治療中的旁分泌效應(yīng)[28]。EVs的內(nèi)容物可以引起細(xì)胞的聚集、分化和增殖，在動(dòng)物模型中，間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)衍生的EVs可在DILI誘導(dǎo)白細(xì)胞介素6(IL-6)-轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)通路及細(xì)胞周期進(jìn)程中促進(jìn)肝細(xì)胞再生[28]。在四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型中，源于人臍帶MSC的EVs可減輕肝纖維化，其機(jī)制可能與減少表面纖維形成，減少Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的產(chǎn)生，降低血清轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)與血清AST的水平有關(guān)[29]。利用干細(xì)胞衍生的EVs替代干細(xì)胞植入物可能為肝臟再生療法提供了一種新手段，其優(yōu)點(diǎn)包括：(1)使用來自于肝細(xì)胞的EVs，而不是細(xì)胞本身，避免了對異常干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化，避免高免疫反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。(2)與免疫抑制相關(guān)的某些類型的EVs可以促進(jìn)肝組織再生。(3)EVs和外泌體可從血液中分離出來并儲(chǔ)存，保持其長久以來的生物學(xué)特性，促進(jìn)其在后期肝再生中發(fā)揮作用。盡管EVs為避免在再生醫(yī)學(xué)中使用活細(xì)胞而引發(fā)的并發(fā)癥提供了希望，但是MSC衍生的EVs在已知的前致癌物及其抗癌特性等方面還有待進(jìn)一步研究。

6 問題與展望

EVs是一種新近發(fā)現(xiàn)的潛在生物標(biāo)記物，但在肝臟疾病診斷、預(yù)后判斷和預(yù)測價(jià)值中的作用尚缺乏足夠的證據(jù)。有必要進(jìn)行獨(dú)立的綜合研究及具有良好特征患者群體的整體評價(jià)，這樣才能充分證明EVs生物標(biāo)志物在臨床應(yīng)用中的敏感性和特異性。有關(guān)肝臟疾病中EVs生物標(biāo)志物的相關(guān)研究不應(yīng)該僅局限于miRNAs，還應(yīng)涉及包括長鏈非編碼RNA在內(nèi)的其他核酸及蛋白質(zhì)和脂質(zhì)標(biāo)記物。關(guān)于EVs生物標(biāo)記物的提取、鑒定和處理分析方面的挑戰(zhàn)仍然存在，充分利用現(xiàn)有的不同提取技術(shù)并對這些技術(shù)的優(yōu)化是下一步研究的重要方向。

以EVs為媒介進(jìn)行信息傳遞并干預(yù)肝臟疾病進(jìn)程還存在許多問題：(1)在EVs用于人體治療之前，EVs的標(biāo)準(zhǔn)化和質(zhì)量控制將必須考慮到工業(yè)生產(chǎn)及監(jiān)管的標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)還要兼顧大規(guī)模生產(chǎn)的制造成本；(2)因?yàn)镋Vs的內(nèi)容物不同于親代細(xì)胞的類型和狀態(tài)，對所提供外泌體類型的選擇將至關(guān)重要，應(yīng)根據(jù)受體細(xì)胞的類型和目標(biāo)分子進(jìn)行篩選；(3)雖然臨床試驗(yàn)已經(jīng)證明自體EVs在重復(fù)使用后仍有很好的耐受性，但EVs在肝臟疾病臨床治療的效果依然缺乏隨機(jī)對照試驗(yàn)的評價(jià)，此外EVs介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在肝臟疾病發(fā)生和發(fā)展中的相關(guān)性研究也須證明其有獨(dú)特的治療靶點(diǎn)。

綜上所述，EVs含有多種功能性生物大分子，包括蛋白質(zhì)、核酸和脂類等，在肝臟不同細(xì)胞間的傳遞信息過程中具有舉足輕重的作用。EVs可以通過激活受體細(xì)胞中不同的信號通路來改變其功能，從而對各種肝臟疾病的發(fā)生和進(jìn)展機(jī)制產(chǎn)生影響。體液中的EVs正在發(fā)展為一種潛在的肝病生物學(xué)標(biāo)志物與治療監(jiān)測的新手段。此外，在不久的將來，EVs也許會(huì)成為一種治療各種肝臟疾病的新方法。

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