李長(zhǎng)新 周 滔,Δ ?？旅?陳 誩 危北海 王佳 孟思宏 李沁娜 鄭嬌 申青艷 陳瑞琳

1.北京中醫(yī)醫(yī)院順義醫(yī)院病理科 (北京 順義， 131000) 2. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院消化中心 3.北京中醫(yī)藥大學(xué) 北京中醫(yī)臨床醫(yī)學(xué)院

非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是目前世界范圍內(nèi)最普遍的慢性肝臟疾病。目前沒(méi)有滿意的治療藥物。調(diào)肝理脾方是有效治療非酒精性脂肪肝的經(jīng)驗(yàn)方，由柴胡、白術(shù)、茯苓、澤瀉等組成，具有疏肝理氣、補(bǔ)氣健脾、調(diào)肝散瘀、清熱利濕之功效。我們的前期研究[1,2]表明調(diào)肝理脾法(MRLS)對(duì)NAFLO具有很好的臨床療效，但其潛在的作用機(jī)制尚不清楚。

自噬(autophagy)是廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的一種溶酶體依賴性降解途徑，是細(xì)胞進(jìn)行自我保護(hù)的一種重要機(jī)制，在維持細(xì)胞存活、更新、物質(zhì)再利用和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定過(guò)程中起著重要作用，是肝細(xì)胞內(nèi)脂肪降解的一種方式[3]。本研究應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)非酒精性脂肪肝大鼠肝臟組織中自噬相關(guān)蛋白Beclin1的表達(dá)情況，初步探討調(diào)肝理脾法治療實(shí)驗(yàn)性大鼠非酒精性脂肪肝可能的作用靶點(diǎn)及可能的作用機(jī)制，為臨床更確切、更廣泛使用調(diào)肝理脾法提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD雄性大鼠(SPF級(jí))30只，體重140～160g，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：No.11400500012883。

1.2 模型制備及分組 采用單純高脂飲食誘導(dǎo)建立NAFLD模型[4]：以普通飼料+2%膽固醇+10%豬油組成高脂飼料(高脂飼料由北京萬(wàn)德銳志生物技術(shù)有限公司加工配制)飼養(yǎng)12周。30只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、調(diào)肝理脾組各10只。模型組、調(diào)肝理脾組大鼠皆給予高脂飲食共12周。調(diào)肝理脾組大鼠造模同時(shí)給予調(diào)肝理脾方2ml/100g/d灌胃(相當(dāng)于成人劑量的5倍，根據(jù)我們前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，得出的此劑量療效最好)，對(duì)照組大鼠給予正常飲食(普通飼料)及等量生理鹽水灌胃，模型組大鼠僅等量生理鹽水灌胃。第12周末處死動(dòng)物,采集大鼠血液及肝臟標(biāo)本。

1.3 藥物與主要試劑 調(diào)肝理脾方制備：由柴胡、澤瀉各10g，白術(shù)、茯苓各15g等組成，制備成流浸膏，濃度為含生藥3g/mL。4℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?。兔抗大?人Beclin1多克隆抗體(Abcam公司)，PV8000染色試劑盒(內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑、超氧酶標(biāo)山羊抗鼠/兔IgG聚合物、DAB濃縮液、DAB稀釋液)(北京中杉金橋)。

1.4 主要儀器 組織脫水機(jī)(日本櫻花)；組織包埋機(jī)(日本櫻花)；組織切片機(jī)(日本櫻花)；顯微鏡(OLYMPUS BX41)。

1.5 觀察項(xiàng)目

1.5.1 ①觀察大鼠肝組織大體、HE染色病理學(xué)變化及肝脂肪變性程度、炎癥活動(dòng)度。在大鼠肝臟的同一部位取1塊約1cm×1cm×1cm大小肝組織，放入10%福爾馬林液固定，經(jīng)石蠟包埋后進(jìn)行切片，采用常規(guī)HE染色后，高倍顯微鏡下觀察脂肪變性及炎癥程度并留取圖片。

肝細(xì)胞脂肪變性程度判斷標(biāo)準(zhǔn)[5]：以肝小葉內(nèi)未見脂滴肝細(xì)胞為陰性，脂滴肝細(xì)胞占肝細(xì)胞總數(shù)小于1/3為+，1/3～2/3為++，大于2/3為+++，幾乎均呈脂滴肝細(xì)胞為++++。

炎癥活動(dòng)計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)[6]：匯管區(qū)炎癥(P)、小葉內(nèi)炎癥(L)、碎屑?jí)乃?PN)及橋接壞死(BN，包括多小葉壞死)4項(xiàng)指標(biāo)，每項(xiàng)依據(jù)病變程度分別計(jì)為1、2、3、4分，因BN、PN的嚴(yán)重程度與病變活動(dòng)度和預(yù)后直接相關(guān)，故在加分時(shí)加倍，計(jì)分公式為：P+L+2(BN+PN)。

1.5.2 觀察大鼠血清肝功能及血脂變化。SD大鼠經(jīng)腹腔麻醉后，立即開腹經(jīng)心臟采血，4000r/min離心5min，交由北京中醫(yī)醫(yī)院順義醫(yī)院檢驗(yàn)科，經(jīng)全自動(dòng)生物化學(xué)分析儀測(cè)定血清大鼠肝功能(ALT、AST)及甘油三酯(TG)、膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)的水平。

1.5.3 免疫組化法檢測(cè)大鼠Beclin1蛋白的表達(dá)及判讀標(biāo)準(zhǔn) 肝組織切片，72℃烤片，常規(guī)脫蠟至水，EDTA8.0高壓熱修復(fù)2.5分鐘，PBS清洗，3%H2O2阻斷15分鐘，PBS清洗，加適量稀釋的一抗(Beclin1 1:100)37℃孵育1h，加二抗37℃ 孵育20min，DAB顯色約2.5min，蘇木素復(fù)染，脫水透明，中性樹膠封片。以PBS代替一抗設(shè)立陰性對(duì)照，以人Beclin1陽(yáng)性胃癌組織為陽(yáng)性對(duì)照。Beclin1表達(dá)于胞漿。

由科內(nèi)兩位病理醫(yī)生采用盲法獨(dú)立閱片。10×20倍鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野，計(jì)算每個(gè)視野的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，按以下標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分：0分，沒(méi)有或者僅有弱的染色；1分，平均陽(yáng)性數(shù)占總計(jì)數(shù)細(xì)胞的30%以下；2分，平均陽(yáng)性數(shù)占總計(jì)數(shù)細(xì)胞的30%以上。染色的強(qiáng)度按以下標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分：陰性，0分；淡黃色，1分；黃色，2分；棕黃色，3分。應(yīng)用陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)評(píng)分與染色強(qiáng)度評(píng)分的乘積對(duì)Beclin1的表達(dá)進(jìn)行分級(jí)，低表達(dá)：0-4分，高表達(dá)：5-6分[7]。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況 對(duì)照組大鼠精神充沛，靈活好動(dòng)，飲食正常，皮毛整潔；其余各組大鼠均較對(duì)照組體重增長(zhǎng)迅速，具有不同程度的精神萎縮，活動(dòng)減少。各組均無(wú)動(dòng)物死亡。

2.2 各組大鼠肝臟的大體形態(tài)學(xué)情況 對(duì)照組大鼠肝臟顏色鮮紅，質(zhì)地柔軟，富有彈性；模型組大鼠肝臟體積明顯增大，呈黃褐色，觸之有油膩感，邊緣飽滿，質(zhì)地稍韌；調(diào)肝理脾法組大鼠肝臟體積較正常對(duì)照組略大，顏色呈較淺的黃褐色，質(zhì)地、彈性和柔韌性較對(duì)照組略差。

2.3 各組大鼠肝臟病理情況 見插頁(yè)圖1。對(duì)照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)良好，肝索排列整齊，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞質(zhì)豐富，均質(zhì)紅染，細(xì)胞核圓形，肝細(xì)胞內(nèi)未見脂肪變。

模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝索排列紊亂，有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞腫脹，部分肝細(xì)胞呈氣球樣變，多數(shù)肝細(xì)胞內(nèi)可見大小不一，數(shù)量不一的脂肪空泡，一些肝細(xì)胞核則被脂滴擠得明顯偏位，脂肪變范圍占全部肝臟的50%～100%。

調(diào)肝理脾法組大鼠肝組織病理改變有明顯改善，肝小葉結(jié)構(gòu)基本良好，肝索大多排列整齊，無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，其脂肪滴與模型組相比明顯減少。

2.4 各組大鼠肝臟脂肪變性程度及炎癥活動(dòng)度變化 見表1。

2.5 各組大鼠肝功能ALT、AST測(cè)定結(jié)果 見表2。

2.6 各組大鼠血脂測(cè)定結(jié)果 見表3。

2.7 各組大鼠Beclin1蛋白表達(dá)情況 見表4及插頁(yè)圖2。Beclin1在各組大鼠中均有不同程度表達(dá)，主要在肝細(xì)胞漿呈彌漫陽(yáng)性表達(dá)，且多集中在肝組織腺泡3區(qū)，與肝細(xì)胞脂肪變性的區(qū)域相對(duì)應(yīng)。

表1 各組大鼠肝臟脂肪變性程度及炎癥活動(dòng)度比較

①脂肪變程度：與對(duì)照組比較，*P<0.001(Ζ=4.102)；與模型組比較，△P<0.01(Ζ=2.935)；②炎癥活動(dòng)計(jì)分；與正常對(duì)照組比較，*P<0.001；與模型組比較，△P< 0.001。

表2 各組大鼠肝功能ALT、AST結(jié)果比較

與正常對(duì)照組比較，*P值均<0.001；與模型組比較，△P值均<0.05。

表3 各組大鼠血脂指標(biāo)測(cè)定結(jié)果比較

與對(duì)照組比較，*P值均<0.001；與模型組比較，△P值均 <0.001

表4 各組大鼠肝臟Beclin1表達(dá)的比較 [n(%)]

與對(duì)照組比較，*P>0.05；與調(diào)肝理脾法組比較，*P<0.05。

3 討論

細(xì)胞自噬( autophagy) 是真核細(xì)胞中一種普遍存在的生理過(guò)程，也是一個(gè)高度進(jìn)化保存細(xì)胞內(nèi)大分子的過(guò)程和細(xì)胞器退化的過(guò)程，其通過(guò)形成自噬小體，進(jìn)而降解細(xì)胞內(nèi)多余或損壞的諸如糖原、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，以此來(lái)達(dá)到調(diào)控細(xì)胞穩(wěn)態(tài)水平的目的；細(xì)胞自噬主要過(guò)程包括自噬體的誘導(dǎo)、形成、轉(zhuǎn)運(yùn)、融合、降解與物質(zhì)循環(huán)等環(huán)節(jié)[8～10]。自噬是細(xì)胞對(duì)代謝應(yīng)激和環(huán)境變化的一種適應(yīng)性反應(yīng)。

自噬調(diào)控機(jī)制非常復(fù)雜，其發(fā)生受到多種自噬相關(guān)基因的調(diào)控。Beclin1是哺乳動(dòng)物中首個(gè)被發(fā)現(xiàn)的具有調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)吞噬作用的抑癌基因，是酵母自噬相關(guān)基因Atg6 的同系物，定位于人染色體17q21, 大約有150 kb[11]。Beclin1是自噬起始的重要調(diào)節(jié)因子，在誘導(dǎo)諸多自噬因子定位于前自噬小體、促進(jìn)自噬起始囊泡的形成中具有關(guān)鍵作用[12]，其表達(dá)強(qiáng)度與自噬活性密切相關(guān)。

近年來(lái)對(duì)肝細(xì)胞的研究[3，13,14]發(fā)現(xiàn)，自噬能夠影響肝細(xì)胞內(nèi)脂滴的分解代謝，并具有維持細(xì)胞內(nèi)能量平衡的作用。保持肝細(xì)胞中適當(dāng)?shù)淖允伤?，?duì)于降低肝細(xì)胞中脂滴的堆積，避免脂肪肝的形成有重要意義。正常情況下，肝細(xì)胞存在低水平自噬現(xiàn)象。脂質(zhì)自噬的效率會(huì)隨營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的不同而變化。Papá ková Z等[15]動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高脂飼料喂養(yǎng)小鼠16周，自噬水平在2周時(shí)開始升高，到10周時(shí)開始下降，電子顯微鏡下脂滴不能進(jìn)入自噬囊泡中，表明高脂誘導(dǎo)下自噬的功能受到損傷。在輕度脂肪肝動(dòng)物模型[3]中發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)的短期增加會(huì)使自噬水平上升，通過(guò)降解增多的脂滴來(lái)減少甘油三酯，進(jìn)而阻止脂肪肝的進(jìn)展。而在基因性(ob/ob小鼠)和飲食性(高脂飲食)慢性肥胖小鼠模型中，脂質(zhì)利用效率持續(xù)增加導(dǎo)致肝細(xì)胞自噬標(biāo)志物顯著下降[3，16]。利用高脂飲食誘導(dǎo)大鼠16周后，發(fā)現(xiàn)肝臟的自噬功能受損，主要表現(xiàn)在降低脂質(zhì)動(dòng)員進(jìn)人自噬室，肝臟自噬總量會(huì)被抑制[17]。自噬的上調(diào)有利于促進(jìn)肝臟脂肪的清除，而下調(diào)則促進(jìn)脂質(zhì)的聚積[18]。

研究結(jié)果證明了調(diào)肝理脾法對(duì)大鼠非酒精性脂肪肝病的肝功能、血脂等指標(biāo)有很好的改善作用，能有效減輕肝臟脂肪變性，與我們前期的研究結(jié)果[3,4]相符。

本研究結(jié)果還提示：長(zhǎng)時(shí)間高脂飲食的刺激使肝細(xì)胞內(nèi)的自噬能力受到損傷，自噬水平受到抑制，使自噬蛋白的表達(dá)變化不明顯，與前人[3,15，16]的研究結(jié)果基本一致。模型組及調(diào)肝理脾法組大鼠自噬水平的變化說(shuō)明自噬參與了非酒精性脂肪肝病的發(fā)生和發(fā)展，同時(shí)表明調(diào)肝理脾法可通過(guò)上調(diào)肝細(xì)胞內(nèi)自噬水平而達(dá)到降脂及改善肝功能的目的。

肥胖情況下肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)聚集反過(guò)來(lái)會(huì)負(fù)性調(diào)節(jié)自噬活性即下調(diào)自噬，自噬的下調(diào)或減弱又進(jìn)一步加重了肝細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)聚集，形成惡性循環(huán)[19]。脂質(zhì)的長(zhǎng)期積累改變了細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，進(jìn)而降低了自噬體和溶酶體融合的效率，這解釋了高脂飼料誘導(dǎo)的脂質(zhì)積累對(duì)自噬的抑制作用，使單純的脂肪變性發(fā)展為NAFLD及其并發(fā)癥。增加自噬會(huì)減少肝臟脂質(zhì)積累，并能阻止肝損傷的發(fā)生及NASH及并發(fā)癥的出現(xiàn)，這也是本實(shí)驗(yàn)所證實(shí)及意義所在。

自噬在NAFLD中是一把“雙刃劍”，輕度的自噬可以保護(hù)肝組織，有利于細(xì)胞存活，但重度的自噬可以使脂質(zhì)堆積，促進(jìn)脂肪肝的發(fā)生，所以，調(diào)肝理脾法對(duì)NAFLD大鼠肝細(xì)胞自噬作用調(diào)節(jié)的時(shí)間窗問(wèn)題需要仔細(xì)探討。

中醫(yī)藥對(duì)組織細(xì)胞自噬的研究尚處于起始階段，有學(xué)者提出細(xì)胞自噬與中醫(yī)學(xué)的陰陽(yáng)失衡、氣機(jī)失調(diào)的關(guān)系密切[20～22]，如何在中醫(yī)理論的指導(dǎo)下，運(yùn)用現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)技術(shù)，挖掘更多具有自噬調(diào)節(jié)功能的中藥活性成分、單味中藥、乃至中藥復(fù)方將具有重大意義。本次實(shí)驗(yàn)未研究大鼠模型各個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)自噬在肝細(xì)胞內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化，是本次實(shí)驗(yàn)的缺憾之處，我們會(huì)在今后的研究中繼續(xù)完善，使結(jié)果更加的精確，更符合變化的規(guī)律。