秦彩云，李青梅，王聰慧，陳士剛，才巨峰，高芳，侯淑榮，陶晶,*

0 引言

青海云杉(Picea crassifolia Kom.) 為云杉屬常綠 喬木，喜寒冷潮濕環(huán)境。耐寒、耐旱、耐瘠薄，適應(yīng)性強，在水肥條件較好地段生長較迅速[1]。分布于甘肅、寧夏、青海東部和內(nèi)蒙古中部。青海云杉樹體呈傘狀，緊湊優(yōu)美，在保持水土、調(diào)節(jié)氣候、涵養(yǎng)水源和維持生態(tài)平衡方面具有重要生態(tài)、經(jīng)濟和社會價值，是良好的園林綠化、通道綠化、荒山造林樹種[2]。

體細胞胚胎發(fā)生是指雙倍體或單倍體的體細胞（非合子細胞）在特定條件下，未經(jīng)性細胞融合而通過與合子胚胎發(fā)生類似的途徑發(fā)育出新個體的形態(tài)發(fā)育過程[3]。具有遺傳穩(wěn)定、繁殖快、數(shù)量多、結(jié)構(gòu)完整等優(yōu)點，并且具有以低成本繁育出大量高品質(zhì)苗木的潛能。體細胞胚發(fā)生技術(shù)已成為針葉樹種無性繁殖技術(shù)的一個新進展，它可以從未成熟胚、成熟胚、子葉中獲得胚性愈傷組織，進而分化發(fā)育成大量無性繁殖體，類似于種子胚發(fā)育成植株的過程。

利用體胚發(fā)生技術(shù)可縮短青海云杉育種周期，為其遺傳改良和林木良種化提供無性繁育手段，實現(xiàn)快速無性繁殖和定向遺傳改良，對該樹種優(yōu)良種質(zhì)資源保存利用[4-5]，促進林木良種化進程具有重要意義[6-12]。本研究以青海云杉未成熟胚為外植體，進行體胚發(fā)生的相關(guān)研究，探究繼代周期、植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)以及不同種源對胚性愈傷組織保持增殖的影響，探究體細胞胚的發(fā)育與成熟過程中的影響因素。研究結(jié)果為青海云杉體胚發(fā)生奠定基礎(chǔ)，為云杉屬樹種體胚發(fā)生提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗準備

1.1.1 試驗材料

青海云杉球果2013年9月下旬至2015年采于青海門源縣（1#種源）、吉林磐石縣（2#種源）、長春凈月（3#種源）、甘肅榆中縣（4#種源）。球果采回后，用75%的酒精擦拭表面，晾干表面酒精后裝入塑料袋中，放入4℃冰箱冷藏，試驗時取出。

1.1.2 基本培養(yǎng)基的配制方法

試驗過程中所用培養(yǎng)基均在高溫高壓滅菌前將pH調(diào)節(jié)至5.8（滅菌溫度為121℃、時間為20 min），L-谷氨酰胺和ABA為培養(yǎng)基滅菌后冷卻至約50℃，用0.22微摩爾孔隙的濾器過濾滅菌加入。接種后培養(yǎng)物均放于培養(yǎng)室中24 ± 1℃培養(yǎng)。

1.2 外植體的滅菌方法與試材準備

選擇4個種源的青海云杉成熟胚作為誘導(dǎo)體細胞胚性組織的外植體材料。青海云杉球果剝?nèi)シN鱗之后，將種子于超凈工作臺中用75%的酒精處理0.5～1 min，無菌水沖洗3～5次；用質(zhì)量濃度為10%的次氯酸鈣溶液處理15～20 min，無菌水沖洗3～5次；剝?nèi)シN皮，并將合子胚從胚乳中剝出接種于培養(yǎng)皿中，每皿10個外植體。

愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為：改良1/2LV[13]+ BA 2.25 mg/L + 2,4-D 6.6 mg/L + 水解酪蛋白400 mg/L+ L-谷氨酰胺400 mg/L + 蔗糖10 g/L + Phytagel凝膠3.5 g/L，每個培養(yǎng)皿內(nèi)10個合子胚，每處理10皿，接種后用封口膜密封，24±1℃條件下暗培養(yǎng)。60 d后得到胚性愈傷組織作為后續(xù)試驗的試材。

1.3 胚性愈傷組織增殖

將青海云杉胚性愈傷組織分割成重量約為0.5 g的組織團，選取誘導(dǎo)試驗中誘導(dǎo)率較高的基本培養(yǎng)基和激素組合，研究激素組合對青海云杉增殖的影響?；緱l件如下；以改良1/2 LV為基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)基內(nèi)均附加水解酪蛋白800 mg/L+ L-谷氨酰胺400 mg/L + 蔗糖10 g/L + Phytagel凝膠3.5 g/L。每間隔2周轉(zhuǎn)接一次，培養(yǎng)條件均為24±1℃暗培養(yǎng)。

1.3.1 植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)組合對胚性愈傷組織保持與增殖的影響

為探究青海云杉愈傷組織增殖的適宜條件，探究生長調(diào)節(jié)物質(zhì)濃度對愈傷組織增值率的影響。分別以愈傷組織誘導(dǎo)的最佳激素濃度組合的3/4、1/2、1/4、1/8、1/10作為增殖激素濃度組合，即2,4-D濃度分別為4.95、3.3、1.65、0.82、0.66，BA濃度分別為1.69、1.13、0.56、0.28、0.23。接種后進行培養(yǎng)（培養(yǎng)基內(nèi)其他條件與1.3一致），每皿中接種4團，每個處理4個重復(fù)。15 d后稱取每皿中胚性愈傷組織的質(zhì)量，計算出增殖率（倍）。

1.3.2 胚性愈傷組織繼代周期的確定

挑選長勢較好的青海云杉胚性愈傷組織為材料（該部分以1＃為試驗材料），稱取0.05 g組織，接種于1.3.1部分篩選出的最佳培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，每皿四塊組織，重復(fù)10次。每隔1 d稱取胚性愈傷組織重量，觀察組織長勢，算出增殖倍數(shù)并繪制增殖曲線圖，確定最佳繼代周期。

1.3.3 不同無性系之間胚性愈傷組織保持與增殖的特點

挑選長勢較好的胚性愈傷組織（分別為1#、2#、3#、4#4個無性系），稱取0.2 g胚性愈傷組織接種于1.3.1篩選出的最佳培養(yǎng)基上，每皿4團胚性組織，10個重復(fù)。15 d后統(tǒng)計愈傷組織的增殖量情況及生長狀況。

1.4 體細胞胚成熟

成熟培養(yǎng)開始前，每個無性系的胚性組織在增殖培養(yǎng)基上進行2個周期的次生培養(yǎng)（每個周期為14 d）。在第三個次生培養(yǎng)時，使用無激素的增殖培養(yǎng)基預(yù)處理7 d，此時的胚性組織即可用于成熟培養(yǎng)。

體胚成熟培養(yǎng)基為改良1/2 LV培養(yǎng)基 + 水解酪蛋白800 mg/L + L-谷氨酰胺400 mg/L + 蔗糖30 g/L + 30 g/L +Phytagel凝膠 5.5 g/L。同時在培養(yǎng)基內(nèi)添加ABA（濃度分別為10、20、30、40、50 mg/L）。溫度24±1℃條件下暗培養(yǎng)。每個處理25盤，3次重復(fù)。2～3個月后統(tǒng)計正常體細胞胚的獲得率。并在顯微鏡下統(tǒng)計形成子葉的正常胚的數(shù)量。

1.5 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計

青海云杉體細胞胚胎發(fā)生及植株再生試驗中的胚性愈傷誘導(dǎo)率、胚性愈傷增殖率、胚性愈傷分化率、體細胞胚萌發(fā)率均按下公式計算得出：

胚性組織誘導(dǎo)率(%)=產(chǎn)生胚性組織的外植體數(shù)/接種未感染外植體數(shù)×100。

胚性組織增殖率(倍)=胚性組織增殖量/胚性組織初始接種量。

單位重量正常成熟胚數(shù)量(個/g)=獲得正常成熟胚數(shù)量/所需胚性愈傷組織重量。

正常體細胞胚的獲得率(%)=單位重量正常成熟胚數(shù)量/單位重量正常胚和畸形胚總數(shù)×100。

體細胞胚萌發(fā)率(%)=每個處理中萌發(fā)的植株總數(shù)/每個處理中未污染的成熟體細胞胚總數(shù)×100。

2 結(jié)果與分析

2.2 青海云杉胚性愈傷組織增殖

2.2.1 植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)組合對胚性愈傷組織保持與增殖的影響

不同植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)濃度組合對青海云杉增殖的影響結(jié)果見表1，隨著2,4-D和BA 濃度的降低，愈傷組織誘導(dǎo)率呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，當激素濃度為愈傷組織誘導(dǎo)濃度的1/2時(即2,4-D 3.3 mg/L + BA 1.1 mg/L組合時)，青海云杉增殖率最高，同時長勢也最好，如圖1（b）所示。因此將1/2愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基激素濃度作為愈傷組織增殖的培養(yǎng)基，既能保證愈傷組織的較大增殖率，又能保持胚性愈傷組織的胚性和新鮮活力。

表1 不同植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)濃度組合對青海云杉增殖的影響Tab.1 Effects of different combinations of hormones on embryonic callus maintenance and proliferation of P. crassifolia

圖1 不同植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)濃度組合下青海云杉胚性愈傷組織的生長狀態(tài)Fig.1 The growth status of the tissue of spruce embryogenesis in P. crassifolia under the combination of plant growth and regulation

2.2.2 胚性愈傷組織繼代周期的確定

胚性愈傷組織增殖曲線如圖2所示，胚性愈傷組織在增殖過程中增值率整體呈先升高后緩慢降低趨勢，胚性愈傷組織在10～14 d有一個迅速增殖小高峰；12 d時增殖速度最快，16 d時增殖速度開始緩慢減小，此時胚性愈傷組織長勢較好；在試驗過程中觀察到 30 d時，胚性愈傷組織褐化較嚴重，胚性逐漸消失。因此胚性愈傷組織繼代培養(yǎng)周期以14～16 d左右為宜，此時既能保持胚性愈傷的胚性，又能獲得較大的增殖量。

圖2 胚性愈傷組織的增殖曲線Fig.2 Growth curves of embryogenic callus

2.2.3 不同無性系之間胚性愈傷組織保持與增殖的特點

不同種源對胚性愈傷組織保持與增殖階段的影響結(jié)果見表2，不同種源在相同的培養(yǎng)條件下增殖能力不同，其中1#、4#種源增殖能力較強，1#種源增殖能力最強，2#、3#種源增殖能力較弱；3#種源增殖能力最弱，四個種源的增殖能力整體呈現(xiàn)1#＞4#＞2#＞3#。

2.3 體細胞胚的發(fā)育與成熟

選取長勢較好的胚性愈傷組織接種于體胚成熟培養(yǎng)基中。按照ABA含量和種源的不同分為10個處理。每種處理接種一定重量的胚性愈傷組織（表3）。10 d后，部分組織褐化，表面凸起，逐步發(fā)育成原胚，如圖3（a）所示；20 d后，球形胚頂端伸長，漸漸向柱狀轉(zhuǎn)變；30 d后，柱狀兩邊繼續(xù)伸長，發(fā)育成子葉胚；40 d后，部分子葉化發(fā)育成熟，如圖3（b）所示。

表2 不同種源對胚性愈傷組織保持與增殖的影響Tab.2 The characteristics of embryogenic callus maintenance and proliferation of P. crassifolia from different provenance

表3 不同ABA含量對青海云杉體胚成熟的影響Tab.3 Effects of maltose and ABA concentration on induction rate of cotyledonous embryo of P. crassifolia

ABA含量為30 mg/L時，兩個種源每克胚性組織獲得的正常胚數(shù)量最多，分別達到250.22個（1#種源）、213.88（4#種源），正常胚的獲得率達到78.77%（1#種源）、84.12%（4#種源）。1#種源中正常胚獲得率最高的ABA含量并不是正常胚獲得數(shù)量最多的，在實際成熟過程中，還是應(yīng)以每克組織獲得正常胚數(shù)量這一標準為主要依據(jù)。兩個種源在相同條件下胚成熟的程度也不盡相同，據(jù)實際生產(chǎn)需要獲得高效成熟的胚性無性系是提高體細胞胚培養(yǎng)效率的關(guān)鍵因素。

圖3 青海云杉體細胞胚的發(fā)育與成熟Fig.3 the development and maturation of P. crassifolia somatic embryogenesis

3 討論與結(jié)論

組織培養(yǎng)技術(shù)是優(yōu)良種質(zhì)資源快速擴繁的一種重要手段，其中植物體細胞胚胎發(fā)生（簡稱體胚發(fā)生）具有遺傳性穩(wěn)定、繁殖速度快、成活率高等優(yōu)點，是利用植物細胞工程手段實現(xiàn)植株再生的重要途徑之一；特別是對于繁殖周期較長且扦插繁殖成活率較低的針葉樹種來說，具有巨大的應(yīng)用價值［6,14］。已有報道表明，針葉樹種體胚發(fā)生均為間接發(fā)生，即都需經(jīng)歷愈傷組織誘導(dǎo)階段［6-7］。同時，愈傷組織也是優(yōu)良種質(zhì)資源的重要保存形式［7-8,15-16］。因此，愈傷組織的誘導(dǎo)是針葉樹體胚發(fā)生的重要步驟。在本研究中胚性愈傷組織在添加不同植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)濃度組合培養(yǎng)基上，胚性保持與增殖能力存在一定差異。在本研究的各處理中愈傷組織均具有一定的增殖能力。在植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)濃度為1/2的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上組合的培養(yǎng)基中可長期保持胚性并增殖。

本研究也證明增殖培養(yǎng)周期過長或過短均不利于胚性愈傷組織的增殖。培養(yǎng)周期過短，會嚴重影響胚性愈傷組織的增殖率，提高成本，加大工作量；培養(yǎng)周期過長則會引起培養(yǎng)基養(yǎng)分不足、污染率增加等問題，導(dǎo)致胚性愈傷組織長勢差，最終失去胚性。綜合考慮胚性愈傷組織的增長率與生長狀態(tài)，以14～16 d左右作為增殖繼代周期，既能保持胚性愈傷組織的良好的生長狀態(tài)，又能保證較大的增殖率，多次繼代，胚性消失現(xiàn)象不明顯。

在針葉樹種中ABA和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)被廣泛的應(yīng)用體胚成熟培養(yǎng)基中來促進體胚成熟［17-19］。在許多松屬樹種中，在體胚發(fā)育與成熟階段，通過撤除生長素和細胞分裂素，外源添加ABA來實現(xiàn)體細胞胚胎的發(fā)生。ABA的作用主要是促進體胚成熟、防止畸形胚產(chǎn)生、抑制體胚的過早萌發(fā)、防止針葉樹的裂生多胚現(xiàn)象［19］。ABA在提高針葉樹體細胞胚胎發(fā)生的頻率和質(zhì)量中有重要作用。青海云杉的體胚成熟試驗同時加入了不同濃度的ABA，當ABA含量為30 mg/L時，兩個種源每克胚性組織獲得的正常胚數(shù)量最多。

青海云杉未成熟胚可以誘導(dǎo)獲得體細胞胚，胚性愈傷組織保持與增殖階段的適宜培養(yǎng)基為改良1/2 LV + 2,4-D 3.3 mg/L + BA 1.1 mg/L + 水解酪蛋白400 mg/ L + L-谷氨酰胺400 mg/L + 10g/L蔗糖 + Phytagel凝膠3.5 g/L；胚性愈傷組織繼代周期以14-16 d為宜，既能保持愈傷組織胚性，又能獲得較大的增殖量；體胚發(fā)育與成熟過程中，當ABA含量為5.28 mg/L時，兩個種源每克胚性組織獲得的正常胚數(shù)量最多。

［1］趙守平. 青海云杉的特征特性及育苗技術(shù)［J］. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2012(6):215-216.

［2］渠春喜, 崔貴文, 馮建華. 華隆林區(qū)青海云杉育苗技術(shù)措施研究［J］. 甘肅科技, 2012, 28(11):130-131.

［3］沈海龍. 植物組織培養(yǎng)［M］. 北京: 中國林業(yè)出版社, 2005.

［4］N?rgaard J V, Duran V, ?ystein Johnsen, et al. Variations in cryotolerance of embryogenic Picea abies cell lines and the association to genetic, morphological, and physiological factors［J］.Canadian Journal of Forest Research, 1993, 23(12): 2560-2567.

［5］梁艷, 沈海龍, 高美玲, 等. 紅松種子發(fā)育過程中內(nèi)源激素含量的動態(tài)變化［J］. 林業(yè)科學(xué), 2016: 52(3), 105-111.

［6］Timmis R. Bioprocessing for tree production in the forest industry:conifer somatic embryogenesis［J］. Biotechnology Progress,1998, 14(1): 156-166.

［7］Stasolla C, Yeung E C. Ascorbic acid metabolism during white spruce somatic embryo maturation and germination［J］.Physiologia Plantarum, 2001, 111(2): 196-205.

［8］Stasolla C, Kong L, Yeung E C, et al. Maturation of somatic embryos in conifers: morphogenesis, physiology, biochemistry,and molecular biology［J］. In Vitro Cellular & Developmental Biology Plant, 2002, 38(2): 93-105.

［9］Elhiti M, Stasolla C. The use of zygotic embryos as explants for in vitro propagation: an overview［J］ Methods in Molecular Biology,2011, 710(5): 229-255.

［10］Lelu-Walter M A, Thompson D, Harvengt L, et al. Somatic embryogenesis in forestry with a focus on Europe: state-of-theart, benefits, challenges and future direction［J］. Tree Genetics& Genomes, 2013, 9(4): 883-899.

［11］季孔庶, 王潘潘, 王金鈴, 等. 松科樹種的離體培養(yǎng)研究進展［J］. 南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2015, 39(1): 142-148.

［12］Salaj T, Matusova R, Salaj J. Conifer somatic embryogenesis an efficient plant regeneration system for theoretical studies and mass propagation［J］. Dendrobiology, 2015, 74: 69-76.

［13］Percy R E, Klimaszewska K, Cyr D R. Evaluation of somatic embryogenesis for clonal propagation of western white pine［J］.Canadian Journal of Forest Research, 2000, 30(30): 1867-1876.

［14］Stasolla C, Loukanina N, Ashihara H, et al. Pyrimidine nucleotide and nucleic acid synthesis in embryos and megagametophytes of white spruce (Picea glauca) during germination［J］. Physiologia Plantarum, 2002, 115(1): 155-165.

［15］翟曉巧, 程斐, 朱延林. 二喬刺槐愈傷組織超低溫保存及適宜降溫方法［J］. 林業(yè)科學(xué), 2009, 45(10): 49-54.

［16］Pullman G S, Bucalo K. Pine somatic embryogenesis using zygotic embryos as explants［J］. Methods in Molecular Biology, 2011,710(710): 267-291.

［17］Stasolla C, Yeung E C. Recent advances in conifer somatic embryogenesis: improving somatic embryo quality［J］. Plant Cell Tissue and Organ Culture, 2003, 74(1): 15 - 35.

［18］Attree S M, Fowke L C. Embryogeny of gymnosperms: advances in synthetic seed technology of conifers［J］. Plant Cell Tissue and Organ Culture, 1993, 35(1): 1-35.

［19］Zhang C, Li Q, Kong L. Induction, development and maturation of somatic embryos in Bunge's pine (Pinus bungeana Zucc. ex Endl.)［J］. Plant Cell Tissue and Organ Culture, 2007, 91(3): 273-280.