郭丹,劉丹,張廣煒(內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院,內(nèi)蒙古包頭014010)

動脈粥樣硬化(AS)是心腦血管疾病中常見基礎(chǔ)疾病，在發(fā)達中國家AS性心腦血管疾病已經(jīng)成為致死致殘的主要疾病，同時在發(fā)展中國家也處于上升趨勢[1]。AS的主要病理變化有脂質(zhì)沉積于動脈內(nèi)膜、粥樣斑塊形成引起管腔狹窄，管壁變硬，從而使相應(yīng)組織出現(xiàn)缺血性改變。目前已知的AS發(fā)病機制有損傷-應(yīng)答反應(yīng)學(xué)說、脂質(zhì)滲入學(xué)說、動脈平滑肌增殖或突變學(xué)說、慢性炎癥學(xué)說等[2]。而損傷-應(yīng)答學(xué)說是AS形成的第一步，同時也是心腦血管事件的早期征兆，主要是由于反復(fù)的機械性或毒性作用使動脈內(nèi)膜損傷，最終導(dǎo)致低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)通過破損內(nèi)皮細胞進入到內(nèi)皮下間隙，同時單核細胞進入內(nèi)膜形成巨噬細胞。其外部的清道夫受體與氧化的低密度脂蛋白膽固醇(ox-LDL)結(jié)合并被攝取，形成泡沫細胞。來自動脈中膜的平滑肌細胞遷入內(nèi)膜吞噬脂質(zhì)形成肌源性泡沫細胞,進而形成纖維帽。而ox-LDL使上述形成的泡沫細胞壞死崩解形成粥樣壞死物即粥樣斑塊。AS形成的危險因素分為可變因素和不可變因素，可變因素有糖尿病、高血壓、脂質(zhì)代謝紊亂、不良生活習(xí)慣(吸煙、缺乏鍛煉等)，不可變因素主要有年齡、性別、種族等，而可變因素的形成是由于基因的改變而導(dǎo)致基因表達產(chǎn)物發(fā)生變化所形成的，并且基因組DNA甲基化的改變是當前基因組學(xué)研究的熱點。本文就DNA甲基化與AS關(guān)系的研究進展進行如下綜述。

1 DNA及其甲基化

DNA是生命遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)，為基因的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄提供了模板。它的基本組成單位是脫氧核糖核酸，而脫氧核糖核酸是由磷酸、脫氧核糖、堿基(嘌呤和嘧啶)組成，相鄰兩個脫氧核糖核酸之間通過縮合作用形成了含有3′，5′-磷酸二酯鍵的脫氧核苷酸鏈，即DNA的一級結(jié)構(gòu)；而每兩條脫氧核苷酸鏈通過堿基之間的氫鍵互補配對形成了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)，即DNA的二級結(jié)構(gòu)；DNA的二級結(jié)構(gòu)經(jīng)過多次的折疊盤繞形成DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)，即DNA的高級結(jié)構(gòu)。DNA經(jīng)過轉(zhuǎn)錄和翻譯形成蛋白質(zhì)，在此過程中，對DNA堿基或組蛋白進行化學(xué)修飾將會影響基因的表達，進而產(chǎn)生不同的生物學(xué)效應(yīng)。其中研究最多的是DNA的甲基化修飾。

DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的化學(xué)修飾途徑之一，它涉及基因的表達、mRNA的拼接和基因組的穩(wěn)定性，并且受環(huán)境因素、年齡、性別及基因變異的影響，形成過程是由S-腺苷甲硫氨酸提供甲基，經(jīng)過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)的催化形成5-甲基胞嘧啶，此過程主要發(fā)生于基因的胞嘧啶-鳥嘌呤(CpG)雙核苷酸序列[3]，并且可以通過DNA的復(fù)制而遺傳。在人類和嚙齒類動物中位于基因啟動子區(qū)中的CpG具有高度保守性，且多數(shù)呈現(xiàn)非甲基化狀態(tài)[4]。而啟動子區(qū)DNA的甲基化是抑制基因表達最常見的表觀遺傳現(xiàn)象之一，啟動子區(qū)序列發(fā)生甲基化改變后，甲基基團本身以及甲基化DNA募集的結(jié)合蛋白造成空間位阻，會抑制其與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，最終影響基因表達,而基因-環(huán)境相互作用在AS的形成過程中起著重要作用[5]。因此，熟知DNA甲基化的作用對于了解疾病的過程及治療至關(guān)重要。

DNA甲基化是由從頭甲基化和維持甲基化兩部分組成，這兩個過程都需要特定的DNMTs催化。DNMTs是一種主要在大腦中存在的酶，并且在基因表觀遺傳學(xué)上起著重要的調(diào)節(jié)作用[6]。目前為止，在哺乳動物中有6種不同的DNMTs,分別為DNMT1、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B、DNMT3C和DNMT3L。DNMT1對DNA甲基化有重要作用[7]，同時具有修復(fù)DNA甲基化的能力。DNMT2實際上是在天門冬氨酸轉(zhuǎn)運RNA的反密碼子環(huán)胞嘧啶38位中加入甲基，它的實質(zhì)并不是基因組DNA的甲基轉(zhuǎn)移酶[8]。DNMT3a和DNMT3b通常出現(xiàn)在富含CpG島的未甲基化DNA鏈中[9]，主要的功能是對未行甲基化的DNA鏈進行甲基化修飾。DNMT3C可以保護男性生殖細胞不受逆轉(zhuǎn)錄活動的影響[10]，它是新發(fā)現(xiàn)的一種甲基轉(zhuǎn)移酶。DNMT3L沒有任何催化作用，但可以誘導(dǎo)DNMT3a和DNMT3b的活性，從而間接地促成DNA甲基化的改變。

國內(nèi)外大量研究已經(jīng)確定，許多機制可通過影響DNA甲基化引起AS發(fā)生發(fā)展，這些機制主要包括促進肌動蛋白、內(nèi)皮功能障礙，平滑肌細胞或單核巨噬細胞的增殖和遷移，細胞外基質(zhì)的生成等[11]。然而，考慮到AS的動態(tài)性質(zhì)和組織非均勻性，確定DNA甲基化在AS發(fā)病機制中的確切作用仍具有挑戰(zhàn)性。

2 AS相關(guān)基因的甲基化

2.1 同型半胱氨酸(Hcy) Hcy是最早發(fā)現(xiàn)的致AS因子，是甲硫氨酸循環(huán)的中間產(chǎn)物，并且是AS形成的獨立危險因素。Hcy水平升高引起AS主要有以下原因：內(nèi)皮細胞受損和功能障礙使得自由基氧化形成活性氧、脂代謝紊亂、血栓形成,激活單核細胞，使血管平滑肌細胞增殖。目前有研究表明，高同型半胱氨酸血癥可引起DNA甲基化修飾而促進AS形成[12]。

2.2 雌激素受體基因(ERa) 正常生理條件下，雌激素通過與循環(huán)系統(tǒng)中的ERa相結(jié)合起到保護循環(huán)系統(tǒng)的作用，雌激素與ER結(jié)合可以促進一氧化氮產(chǎn)生。在AS的形成過程中，ERa啟動子CpG島的異常高甲基化改變,將使ERa表達受到抑制,導(dǎo)致平滑肌細胞中ERa數(shù)目大量減少,最終減弱雌激素對心血管的保護作用。患有AS的絕經(jīng)前女性ER的表達是顯著降低的。提示由于基因甲基化狀態(tài)的改變所導(dǎo)致的ER基因沉默可能抵消了雌激素的保護作用。

2.3 單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白(MCTs) 近年研究表明，MCTs的主要功能是協(xié)助乳酸轉(zhuǎn)運出細胞。Zhu等[13]研究表明，AS病變的嚴重程度與MCT3第二外顯子區(qū)CpG島甲基化改變有關(guān)。收縮型平滑肌細胞中MCT3的表達水平高于合成型平滑肌細胞，進而使得乳酸的轉(zhuǎn)運受到影響，給予甲基化抑制劑后受損的乳酸轉(zhuǎn)運可以被逆轉(zhuǎn)，從而說明MCT3經(jīng)過甲基化修飾之后，可以影響其表達和平滑肌細胞的功能，從而影響AS的發(fā)生發(fā)展。

2.4 組織因子途徑抑制物2(TFPI-2)甲基化 TFPI-2是基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)活性的內(nèi)源性抑制物，主要分布于內(nèi)皮細胞和成纖維細胞的細胞外基質(zhì)中，有抑制凝血、纖維溶解，調(diào)控平滑肌細胞和單核/巨噬細胞增殖的功能。Zawadzki等[14]通過大量研究表明，隨著AS進展，可能伴隨有TFPI-2基因的甲基化修飾，進而影響其表達，最終使得斑塊迅猛發(fā)展，顯著降低了斑塊的穩(wěn)定性。

2.5 細胞外超氧化物歧化酶(EC-SOD)基因甲基化 超氧化物歧化酶(SOD)是一種來源于生命體的活性物質(zhì)，可以抑制超氧化物及其反應(yīng)產(chǎn)物的活性，同時也能夠清除生物體在新陳代謝中所形成的有害物質(zhì)。近年研究表明，EC-SOD甲基化程度升高，將導(dǎo)致EC-SOD表達降低，使得機體抗氧化反應(yīng)減弱，最終形成AS。Laukkanen等[15]通過一系列研究表明，5′端CpG甲基化狀態(tài)改變與EC-SOD表達改變沒有直接的因果關(guān)系，但認為該基因的低甲基化可影響平滑肌細胞的增殖，在AS發(fā)生過程中有一定的作用，但具體作用機制需進一步研究。

2.6 p53基因甲基化 p53是人類的抑癌基因之一，是細胞增殖和凋亡的重要分子。Guevara等[16]發(fā)現(xiàn)，在APOE-/-小鼠中，p53基因表達被抑制(p53-/-)的小鼠發(fā)生AS的程度更大。但是迄今為止，p53基因啟動子區(qū)甲基化引起AS的機制并不十分清楚。

2.7 TET2甲基化 TET2是TET家族(包括TET1、TET2、TET3)中的一員[17]，是與造血系統(tǒng)密切相關(guān)的腫瘤抑制基因。近年根據(jù)Calkin等[18]的實驗發(fā)現(xiàn)，TET2甲基化也是AS的危險因素之一。

3 AS危險因素與DNA甲基化

3.1 脂代謝紊亂 脂代謝紊亂是AS的危險因素之一，有效地干預(yù)脂代謝紊亂對心腦血管疾病有益[19]，且貫穿于疾病的始終。已有研究表明，脂代謝紊亂不僅可使脂質(zhì)在局部組織中沉積，也會使巨噬細胞聚集導(dǎo)致泡沫細胞形成；同時也可使局部組織發(fā)生炎癥反應(yīng)，引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，使血管內(nèi)皮細胞的功能受到影響，血管通透性增加，從而參與AS的發(fā)生與發(fā)展。脂代謝紊亂主要指血漿中的TC和(或)TG、LDL-C、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)中的一項或多項異常。大量資料表明，LDL-C升高與AS嚴重程度呈正相關(guān)[20]，而HDL-C有抗AS的作用。

目前，已知三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體G1(ABCG1)、N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶(GALNT2)、β-羥甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGCR)與脂質(zhì)代謝有緊密聯(lián)系，并且這些基因啟動子區(qū)的甲基化將對AS的形成起至關(guān)重要作用。ABCG1是ABCG家族的一種跨膜半轉(zhuǎn)運體，在肺、胸腺、腎上腺、腦、脾和巨噬細胞高表達,可參與巨噬細胞膽固醇逆轉(zhuǎn)運的中間過程，防止過量的脂質(zhì)積累，從而防止AS[21]。Pfeiffer等[22]研究表明，ABCG1基因啟動子區(qū)甲基化的改變與HDL-C呈相反關(guān)系。因此可以通過改變甲基化的狀態(tài)調(diào)節(jié)脂代謝紊亂，從而減緩AS形成。

目前多個全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)證實，GALNT2與HDL-C及TC存在密切相關(guān)性，可能是由于GALNT2修飾載脂蛋白及載脂蛋白受體，進而引起脂質(zhì)水平改變。由于DNA甲基化通常與基因沉默有關(guān)，GALNT2甲基化能夠增加TG含量、降低HDL-C,進而促進AS形成。HMGCR是膽固醇合成的限速酶，它不僅可以改變代謝途徑的總速度，還可以決定代謝的方向，是膽固醇反饋抑制中重要的調(diào)控位點[23]。HMGCR基因啟動子區(qū)甲基化會使HMGCR表達沉默從而減少膽固醇合成，在一定程度上降低血脂，減緩AS進程。

3.2 原發(fā)性高血壓 原發(fā)性高血壓是由遺傳與環(huán)境因素共同作用引起以血壓升高為主要臨床表現(xiàn)的一種疾病。近年研究表明，代謝酶基因如11β-類固醇脫氫酶-2、內(nèi)皮素轉(zhuǎn)換酶1，受體基因如血管緊張素Ⅱ受體1型b亞型等基因發(fā)生甲基化和去甲基化能夠影響代謝酶和受體的表達，進而通過腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)激活以及腎性水鈉潴留等引起高血壓的發(fā)生發(fā)展。

3.3 糖尿病 2型糖尿病(T2DM)是多種環(huán)境因素和遺傳因素共同作用而引起的外周血血糖升高的一種內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病。Michael等[24]對人類胰島細胞進行了DNA甲基化檢測，發(fā)現(xiàn)254個基因中有276個CpG位點的甲基化改變與T2DM有關(guān)。

3.4 年齡 隨著年齡的不斷增長，DNMTs也會發(fā)生變化，但這種變化是復(fù)雜的且不穩(wěn)定,將對DNA甲基化產(chǎn)生影響。大量研究表明，胚胎生長促進因子、周期依賴性激酶阻滯因子[25]、ER基因、E鈣粘連蛋白、N33基因隨著年齡的增長而發(fā)生高甲基化改變。隨著DNA甲基化和年齡相關(guān)性研究的不斷深入,可以明確兩者的關(guān)系,減緩AS的形成。

此外,還有研究表明不良的飲食及生活習(xí)慣，如吸煙、運動量減少、高脂飲食等都可以引起DNA甲基化的改變，這些均可以影響AS的發(fā)生發(fā)展。DNA甲基化改變是一種可遺傳的化學(xué)性共價修飾，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。DNA去甲基化存在主動去甲基化與被動去甲基化兩種途徑，目前對于DNA去甲基化主要集中于腫瘤細胞的研究，尚缺乏充足的研究表明DNA去甲基化與AS之間的相關(guān)性，DNA去甲基化是否可以逆轉(zhuǎn)AS的發(fā)生發(fā)展，需要未來基因組學(xué)方面的相關(guān)研究。

綜上所述,Hcy、ER、MCTs、TFPI-2、TET2、ABCG1、GALNT2啟動子區(qū)DNA甲基化會加劇AS，而HMGCR的甲基化則會減少膽固醇的形成，降低血脂水平，從而在一定程度上緩解AS的形成，但是EC-SOD和p53基因甲基化與AS之間的相關(guān)性研究還不明確。隨著科學(xué)技術(shù)的進步，對AS的研究已經(jīng)取得了重大突破，而對于基因組DNA甲基化與AS相關(guān)性的研究才剛起步，隨著對DNA甲基化認識的逐步完善，以及對AS相關(guān)危險因素的研究使得對AS的形成機制越來越清晰，為預(yù)防和緩解AS提供更多新的作用靶點，將有利于AS疾病的預(yù)防與治療。