武艷，周寧，郭紀(jì)偉，楊麗娟，代娟娟，陳微微

(濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東濱州256600)

泛素結(jié)合酶E2C(UBE2C)又稱為UbcH10或dJ447F3.2，屬于E2家族成員，其基因位于染色體20q12.13，在人類中UBE2C有6種同源異構(gòu)體，最常見的同源異構(gòu)體含197個氨基酸，相對分子質(zhì)量為19 652 Da，在不同種屬之間高度同源[1]。細(xì)胞周期后期促進復(fù)合物(APC/C)是目前惟一被發(fā)現(xiàn)可以介導(dǎo)UBE2C向靶蛋白傳遞泛素分子的E3酶，通過泛素化促進細(xì)胞周期蛋白A、細(xì)胞周期蛋白B、p21等細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的降解，從而促進細(xì)胞周期M期的進程。UBE2C通過中和USP44的去泛素化作用，并促進APC/C上紡錘體檢查點組分的解離，參與細(xì)胞周期紡錘體裝配檢查點的調(diào)控，因此，UBE2C在細(xì)胞整倍體的維持中起重要作用。UBE2C在正常組織中表達較低，在肺癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌等多種腫瘤中表達水平較高。已有研究表明，UBE2C的過表達能夠促進細(xì)胞增殖，增強腫瘤細(xì)胞的遷移及侵襲能力。本課題組在2017年1～6月通過構(gòu)建UBE2C的真核表達載體，并驗證其對人肺癌細(xì)胞系(PC9)增殖、遷移能力的影響，為進一步研究UBE2C在肺癌中的作用機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 PC9細(xì)胞系購于美國ATCC細(xì)胞庫；pcDNA3.1載體購于Gromega公司；胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基、胰酶購自美國Gibco公司；Lipofectamine 2000購于Invitrogen公司；限制性內(nèi)切酶Kpn I、Xba I和T4 DNA連接酶購自NEB公司；TRIzol試劑，PCR所需引物購于上海生物工程有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑購于Thermo公司；PCR Mix，T-載體試劑盒購于Transgen公司；質(zhì)粒提取試劑盒購于Axygen公司；Flag單克隆抗體購自Santa Cruz公司，Tubulin抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體購于Proteintech公司；CCK-8試劑購于碧云天公司。

1.2 真核表達載體pcDNA3.1-Flag-UBE2C的構(gòu)建 根據(jù)Genbank提供的UBE2C基因信息，設(shè)計合成上下游引物，并在上游引物中引入Flag標(biāo)簽的堿基序列和Kpn I 酶切位點，下游引物中引入Xba I酶切位點，上下游引物序列分別為： P1：5-′GGGTACCCCATGGATTACAAGGATGACGACGATAAGGCTTC-CCAAAACCGCGACCCAG-3′；P2：5-′GCTCTAGAGC-TTAATATCTAGGGCTCCTGGCTGGTGAC-3′。以PC9細(xì)胞的cDNA為模板，配制反應(yīng)體系，通過PCR反應(yīng)獲得UBE2C的全長DNA序列，反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min、95 ℃ 10 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s，30個循環(huán)，72 ℃ 10 min，置于4 ℃?zhèn)溆?。將PCR產(chǎn)物回收后，先與T-載體、反應(yīng)緩沖液混合，25 ℃反應(yīng)10 min，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α中，涂到含有氨芐青霉素的LB平板中，培養(yǎng)過夜，挑取菌落，振蕩培養(yǎng)，提取T-UBE2C質(zhì)粒，并通過Kpn I和Xba I進行酶切鑒定，并將鑒定為陽性的質(zhì)粒送至上海生物工程有限公司進行序列測定，通過DNAMAN軟件對測序結(jié)果與UBE2C的CDS序列進行比對。將序列比對完全一致的T-Flag-UBE2C質(zhì)粒、pcDNA3.1載體酶切后分別進行切膠回收，通過T4 DNA連接酶進行連接，轉(zhuǎn)化入DH5α中，涂到含有氨芐青霉素的LB平板中，37 ℃培養(yǎng)過夜，次日挑取菌落，振蕩培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒，并進行酶切鑒定。結(jié)果成功擴增出UBE2C基因片段，產(chǎn)物大小為591 bp，將其成功連入T載體中，經(jīng)酶切鑒定，并且重組T-載體中序列完全正確的UBE2C基因片段成功連入線性化的pcDNA3.1中，提示UBE2C的真核過表達載體已構(gòu)建成功。將鑒定正確的重組質(zhì)粒pcDNA3.1-Flag-UBE2C，通過Nanodrop測定濃度，置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 分組及處理 將PC9細(xì)胞系分為重組質(zhì)粒組(pcDNA3.1-Flag-UBE2C)和空質(zhì)粒組(pcDNA3.1)，將1.5 μg質(zhì)粒與Lipofectamine 2000 4 μL混合后，加入培養(yǎng)基100 μL，室溫孵育25 min，加入到細(xì)胞生長密度為60%～80%的培養(yǎng)板中，繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h，以便進行后續(xù)實驗。

1.4 細(xì)胞UBE2C mRNA的檢測 采用RT-PCR法。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞，TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，應(yīng)用Transgen公司的2×EasyTaq PCR SuperMix進行PCR驗證，并進行3次重復(fù)實驗，通過Image J軟件分析灰度值，并以GAPDH作為內(nèi)參，計算目的基因的表達量。PCR鑒定引物：UBE2C：上游引物： 5′-GGATTTCTGCCTTCCCTGAA-3′，下游引物：5′-GATAGCAGGGCGTGAGGAAC-3′, GAPDH 上游引物：5′-CTCCTCCTGTTCGACAGTCAGC-3′,下游引物：5′-CCCAATACGACCAAATCCGTT-3′。

1.5 細(xì)胞UBE2C蛋白的檢測 采用Western blotting法。轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞沉淀，NP-40裂解液裂解細(xì)胞，BCA法測定蛋白濃度。取蛋白上樣30 μg，進行SDS-PAGE電泳；轉(zhuǎn)膜，封閉后分別孵育抗-UBE2C(1∶1 000)、抗-Tubulin(1∶1 000)抗體過夜，次日孵育HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(1∶1 000)，加入ECL顯色底物，應(yīng)用成像系統(tǒng)進行成像拍照，實驗重復(fù)3次，以目的蛋白灰度值比內(nèi)參蛋白灰度值作為目的蛋白相對表達量。

1.6 細(xì)胞增殖能力的檢測 采用CCK-8法。將細(xì)胞以5×103/孔接種于96孔板，培養(yǎng)過夜后進行轉(zhuǎn)染，每組設(shè)置3個平行孔，每過12 h加入CCK-8繼續(xù)培養(yǎng)3 h，采用酶標(biāo)儀測定各孔在450 nm波長處的吸光度值，共測定至60 h，繪制不同組隨時間變化的增殖曲線。

1.7 細(xì)胞遷移能力的檢測 采用細(xì)胞劃痕試驗。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，用200 μL槍頭進行劃痕，PBS洗滌后，加入新鮮無血清培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)，分別在0、24、48 h進行拍照。分別進行3次重復(fù)試驗，應(yīng)用Image J軟件對劃痕距離進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 UBE2C在PC9細(xì)胞中的表達 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，空質(zhì)粒組、重組質(zhì)粒組UBE2C的mRNA相對表達量分別為0.679±0.024、2.349±0.154，二者比較，P<0.01；UBE2C蛋白相對表達量分別為0.581±0.018、2.284±0.017，二者比較，P<0.01。

2.2 過表達UBE2C對PC9細(xì)胞增殖、遷移能力的影響 細(xì)胞轉(zhuǎn)染60 h后，空質(zhì)粒組、重組質(zhì)粒組的OD450值分別為1.201±0.123、1.627±0.01，重組質(zhì)粒組的增殖能力高于空質(zhì)粒組(P<0.05)；重組質(zhì)粒組和空質(zhì)粒組在劃痕后培養(yǎng)24 h時的傷口愈合率分別為46.322%±3.388%、29.576%±3.229%，48 h的愈合率分別為76.995%±3.338%、38.362%±3.358%，重組質(zhì)粒組遷移能力高于空質(zhì)粒組(P<0.01)。

3 討論

肺癌是世界范圍內(nèi)最普遍的惡性腫瘤。據(jù)統(tǒng)計，在2012年新增病例180萬，死亡病例160萬[2，3]。在中國，肺癌是最常見癌癥，被確診時患者多處于肺癌晚期，已經(jīng)失去了手術(shù)治療機會。近年來，由于診斷方法、外科技術(shù)的提高，很大程度上延長了患者的壽命，但是由于缺少有效的靶向治療，五年內(nèi)多數(shù)患者均會出現(xiàn)復(fù)發(fā)的現(xiàn)象，因此尋求有效、特異性治療非小細(xì)胞肺癌的靶點至關(guān)重要。

UBE2C已被證明是腫瘤發(fā)展中的重要功能性基因之一。其表達水平與腫瘤的惡性程度及病理分級密切相關(guān)。有研究表明，降低UBE2C的表達水平后，腫瘤細(xì)胞的增殖和克隆形成能力明顯被抑制，腫瘤細(xì)胞的衰老加速[4，5]。在乳腺癌細(xì)胞中，降低UBE2C表達能明顯增強表柔比星耐藥細(xì)胞對表柔比星的敏感性[6]。有研究者檢測了結(jié)直腸癌患者中UBE2C的表達，結(jié)果顯示，腫瘤組織中UBE2C的mRNA及蛋白表達均明顯高于正常組織，并且其表達水平與患者對化療或靶向藥物的臨床反應(yīng)密切相關(guān)，是潛在的生物標(biāo)志物[7]。有文獻報道，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中，下調(diào)UBE2C的表達能夠通過抑制PI3K-Akt-mTOR信號通路，促進細(xì)胞自噬，進而降低細(xì)胞的生存能力[8]；但是UBE2C在肺癌發(fā)生發(fā)展中的功能知之甚少，其作用機制還需進一步深入探討。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，UBE2C在肺癌組織中過表達；RNA干擾實驗顯示，下調(diào)UBE2C的表達可以抑制肺癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。鑒于前期的研究成果，尚需通過過表達UBE2C進一步鑒定其在肺癌細(xì)胞中的功能及作用。因此，本研究通過PCR方法擴增獲得帶有Flag標(biāo)簽的UBE2C基因全序列，限制性內(nèi)切酶作用后將其克隆到真核細(xì)胞表達載體上，獲得能夠在真核細(xì)胞中表達的重組載體，為研究UBE2C的作用機制奠定基礎(chǔ)；并且通過該重組載體上調(diào)UBE2C的表達后，能顯著增加肺癌PC9細(xì)胞的增殖及遷移能力。本研究為進一步探討UBE2C基因在肺癌發(fā)生發(fā)展及遷移浸潤中的作用機制奠定了基礎(chǔ)。