馬聰,孫艷美,張萍萍,張攀,苗繪,李亞麗

(河北省人民醫(yī)院，石家莊050071)

聽力損失是常見的感覺神經(jīng)性障礙。全球約有3.6億人患中至重度耳聾，1 000名新生兒中，有1.33名耳聾患者[1]，至少50%患者的病因與遺傳因素相關(guān)。遺傳性耳聾根據(jù)是否有除聽力損失以外的癥狀分為綜合征型耳聾(SHI)和非綜合征型耳聾(NSHI)。NSHI約占70%。SHI常伴頭部畸形、皮膚異常、視網(wǎng)膜色素變性等癥狀。迄今為止，耳聾大約與90余個(gè)基因的1 000多個(gè)突變位點(diǎn)有關(guān)。近年隨著產(chǎn)前基因診斷技術(shù)的快速發(fā)展，對(duì)耳聾基因的研究取得了巨大成就，本文就近年最新研究進(jìn)展進(jìn)行如下綜述。

1 SHI相關(guān)基因

SHI表型和遺傳學(xué)背景復(fù)雜多樣。世界上已報(bào)道的耳聾相關(guān)綜合征有400余個(gè)，較常見的有Pendred綜合征、Waardenburg綜合征、Treacher-Collins綜合征、Usher綜合征、Alport綜合征及線粒體基因突變綜合征。

1.1 Pendred綜合征相關(guān)基因 Pendred綜合征是常染色體隱性遺傳病,十萬人中發(fā)病7.5～10人，占先天性耳聾患者的10%[2],由SLC26A4基因突變產(chǎn)生，編碼pendrin蛋白，除在甲狀腺、內(nèi)耳表達(dá)外，腎臟、前列腺、子宮內(nèi)膜、乳腺也有表達(dá)。表型包括伴前庭導(dǎo)水管擴(kuò)張(EVA)的神經(jīng)性耳聾、甲狀腺腫大、碘有機(jī)化功能障礙。Goncalves等[3]對(duì)葡萄牙Pendred綜合征女性患者的篩查中發(fā)現(xiàn)，SLC26A4基因的新突變位點(diǎn)為c.918+2T>C及c.821C>G。Mironovich等[4]首次在Pendred綜合征患者和非綜合征型EVA伴或不伴Mondini發(fā)育不良患者中發(fā)現(xiàn)突變c.222G>T，孤立的Mondini發(fā)育不良患者未檢測(cè)到該突變。不同原因致聾者人工耳蝸植入后效果不同，Pendred綜合征患兒術(shù)后效果好于不明原因耳聾患者，成人表現(xiàn)則相似；Pendred綜合征與EVA患者的術(shù)后效果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Hosoya等[5]將Pendred綜合征患者與健康人群血液中的誘導(dǎo)性多功能干細(xì)胞培育成內(nèi)耳細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Pendred綜合征患者內(nèi)耳細(xì)胞中Pendred蛋白呈現(xiàn)異常凝集現(xiàn)象且細(xì)胞易死亡。通過細(xì)胞水平的藥物試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)二甲雙胍和免疫抑制劑雷帕霉素能有效降低聚集現(xiàn)象和控制細(xì)胞死亡。TP53 p.R175H為甲狀腺腫瘤中惟一檢測(cè)到的突變，突變限于腫瘤結(jié)節(jié)內(nèi)，表明該突變?cè)诘投葠盒约谞钕贋V泡狀腫瘤中起腫瘤誘發(fā)作用。

1.2 Perrault綜合征相關(guān)基因 Perrault綜合征是罕見的多系統(tǒng)疾病，表現(xiàn)為耳聾、女性原發(fā)性卵巢功能不全和神經(jīng)功能缺陷。相關(guān)的5種基因：羥基類固醇(17β)脫氫酶4(HSD17B4)、HARS2、LARS2、絲氨酸蛋白酶(CLPP)及Twinkle解旋酶(TWNK)。

TWNK基因編碼Twinkle，由連接區(qū)相連的引物酶和解旋酶結(jié)構(gòu)域組成，維持蛋白質(zhì)寡聚物的穩(wěn)定。Twinkle對(duì)線粒體DNA的復(fù)制和完整的維護(hù)尤為重要。c.1802G>A(p.Arg601Gln)為TWNK新突變位點(diǎn)[6]。Arg601能夠與ATP的N7原子形成氫鍵，谷氨酰胺不能與ATP的N7原子形成氫鍵，影響ATP的結(jié)合和水解。

CLPP酶能夠?qū)⑤^大蛋白質(zhì)裂解為較小的肽。Dursun等[7]發(fā)現(xiàn),新錯(cuò)義突變c.624C>G位于染色體19p13.3的CLPP的5號(hào)外顯子，該突變使亮氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榧琢虬彼?，?dǎo)致不孕、耳聾和生長遲緩。Chen等[8]對(duì)患Perrault綜合征姐妹進(jìn)行測(cè)序,姐妹均攜帶HSD17B4新突變位點(diǎn)c.298G>T，均為純合子，但父母為雜合子。Demain等[9]發(fā)現(xiàn),HSD17B4基因新突變位點(diǎn)c.244G>T，導(dǎo)致纈氨酸取代苯丙氨酸殘基，可能干擾煙酰胺腺嘌呤二核苷酸結(jié)合。HSD17B4突變相關(guān)的病例均出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，包括小腦功能障礙、眼部異常和智力障礙，其中小腦表現(xiàn)最明顯。HSD17B4突變疾病與D-雙功能蛋白缺乏癥相似。D-雙功能蛋白缺乏癥是常染色體隱性疾病，特征為嚴(yán)重神經(jīng)癥狀和血漿中極長鏈脂肪酸積累，Perrault綜合征患者多出現(xiàn)耳聾和性腺發(fā)育不全，而血漿中極長鏈脂肪酸正常。

1.3 Waardenburg綜合征(WS)相關(guān)基因 WS大多為常染色體顯性遺傳，主要表現(xiàn)為神經(jīng)性耳聾和色素減退。6種基因與之相關(guān):PAX3、MITF、SNAI2、SOX10、EDN3和EDNRB。

PAX3突變導(dǎo)致的先天感覺神經(jīng)性耳聾與內(nèi)耳紋狀血管缺乏黑色素細(xì)胞有關(guān)。Chen等[10]對(duì)廣東患病家庭的研究中首次發(fā)現(xiàn)，PAX3新突變c.592delG與GJB2突變c.109G> A共同導(dǎo)致WS，c.592delG導(dǎo)致PAX3蛋白截?cái)嗷驘o義密碼子介導(dǎo)的mRNA降解機(jī)制，影響神經(jīng)嵴細(xì)胞正常發(fā)育。Niu等[11]對(duì)I型WS家系進(jìn)行突變篩查發(fā)現(xiàn)，PAX3基因的新致病突變c.808C>G，其導(dǎo)致PAX3轉(zhuǎn)錄功能障礙，核分布和正常的DNA結(jié)合活性被保留，但未能激活小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)錄激活域的缺失導(dǎo)致了功能缺失。該研究同時(shí)表明單倍劑量不足是該家族輕度Ⅰ型WS表型的潛在機(jī)制。

Cesca等[12]對(duì)先證者及其家屬進(jìn)行遺傳學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)先證者與其父親攜帶EYA4新的可能致病性突變c.1154C>T，導(dǎo)致學(xué)語后NSHI。祖父和叔父攜帶EYA4突變和PAX3新致病性剪接位點(diǎn)突變c.321+1G>A，兩個(gè)受試者表現(xiàn)Ⅰ型WS的臨床特征，新的PAX3基因突變c.321+1G>A與EYA4突變共分離。Xiao等[13]發(fā)現(xiàn)，PAX3基因新復(fù)合雜合突變c.169-170insC和c.172-174delAAG，與中國家庭的Ⅰ型WS共分離。SOX10基因新的無義突變c.163A>T使終止密碼子取代第55位賴氨酸密碼子，導(dǎo)致蛋白質(zhì)翻譯終止[14]。近年有研究對(duì)Ⅳ型WS家族研究發(fā)現(xiàn)與慢性便秘相關(guān)的SOX10雜合突變c.422T>C[15]。

1.4 Usher綜合征相關(guān)基因 Usher綜合征以耳聾和色素性視網(wǎng)膜炎為特征表現(xiàn)。先前認(rèn)為發(fā)病率約為4.4/100 000，但最近證據(jù)表明實(shí)際發(fā)病率約為1/6 000[16]。

已知涉及Usher綜合征的有十多個(gè)基因，但20%～30%患者的遺傳基礎(chǔ)仍未知[17]。應(yīng)用全外顯子組測(cè)序和全基因組測(cè)序鑒定新的致病基因CEP78[18]，該研究證明光感受器細(xì)胞和內(nèi)耳毛細(xì)胞中纖毛類疾病與Usher蛋白網(wǎng)絡(luò)之間存在聯(lián)系。目前越來越多的基因位點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)。Yan等[19]通過動(dòng)物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Usher綜合征的視網(wǎng)膜變性由磷酸二酯酶β亞基基因突變引起，而聽力損失由Adgrv1基因突變引起。Ramzan等[20]發(fā)現(xiàn)，包括MYO7A新突變位點(diǎn)c.198-199insA及c.1219-1226del的復(fù)合雜合突變導(dǎo)致的Usher綜合征，由此擴(kuò)展了MYO7A的突變譜。Bousfiha等[21]首次在摩洛哥耳聾患者中發(fā)現(xiàn)GPR98基因突變、新復(fù)合雜合子突變(c.1054C>A，c.16544delT)導(dǎo)致Usher綜合征。

目前無有效的生物療法治療聽力損失，基因治療是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。使用合成的腺相關(guān)病毒載體Anc80L65將野生型USH1C遞送到USH1C c.216G>A小鼠的內(nèi)耳中，顯示轉(zhuǎn)導(dǎo)80%～90%的感覺毛細(xì)胞，最終導(dǎo)致基因和蛋白質(zhì)表達(dá)，聽覺功能以及平衡行為恢復(fù)至正常水平[22]。

2 NSHI相關(guān)基因

NSHI中常染色體隱性遺傳性耳聾占75%～80%，常染色體顯性遺傳占20%～25%，線粒體遺傳或X連鎖方式不足1%。有大約100種不同NSHI基因被報(bào)道，最近Guan等[23]在中國耳聾患者突變篩查中首次鑒定出致病基因PDZD7。

2.1 GJB2基因 GJB2基因位于13q12，編碼間隙連接蛋白-26(Cx26)，構(gòu)成細(xì)胞間信號(hào)分子傳輸通道和維持耳蝸內(nèi)淋巴電位。GJB2基因突變導(dǎo)致約50%遺傳神經(jīng)性耳聾，多與常染色體隱性遺傳有關(guān)。Chen等[24]敲減出生當(dāng)天(P0)和生后第8天(P8)小鼠的耳蝸Cx26，18 d后觀察發(fā)現(xiàn)，P8組小鼠螺旋器無超微結(jié)構(gòu)變化且聽力正常，而P0組小鼠的Deiter細(xì)胞的指突未發(fā)展成指狀結(jié)構(gòu)，柱細(xì)胞中微管及乙?；?微管蛋白量減少，聽力嚴(yán)重受損，表明GJB2參與出生后螺旋器成熟過程中柱細(xì)胞骨架的發(fā)育。由此提出GJB2新的致病機(jī)制：柱細(xì)胞中微管的減少可能導(dǎo)致螺旋器隧道開放失敗，且畸形的指突可能對(duì)螺旋器的支持框架產(chǎn)生負(fù)面影響。

Koohiyan等[25]對(duì)伊朗NSHI人群篩查中發(fā)現(xiàn)，GJB2新突變位點(diǎn) c.130T>G和c.178T>G對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象產(chǎn)生影響。縫隙連接在耳蝸形成兩個(gè)獨(dú)立的網(wǎng)絡(luò):螺旋器上皮細(xì)胞和耳蝸側(cè)壁結(jié)締組織縫隙連接網(wǎng)絡(luò)。上皮細(xì)胞Cx26和Cx30雙雜合子缺失并未降低內(nèi)耳蝸電位和正常的聽力，提示該雙雜合子缺失主要影響耳蝸側(cè)壁的間隙連接功能。Cx26和Cx30雙基因突變可能減弱Cx26和Cx30在耳蝸側(cè)壁的雜合耦合，降低內(nèi)耳蝸電位從而導(dǎo)致耳聾。該研究還證實(shí)，鉀離子再循環(huán)假設(shè)不是Cx26和Cx30突變所致耳聾的機(jī)制。

有研究提出，兒童先天性耳聾與心臟參數(shù)延長相關(guān)。對(duì)GJB2突變和無GJB2突變患者的心電圖參數(shù)研究，發(fā)現(xiàn)GJB2突變的耳聾患者與其心電圖參數(shù)之間無關(guān)聯(lián)。研究Cx26與產(chǎn)前缺氧之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)慢性產(chǎn)前缺氧大鼠耳蝸Corti器官毛細(xì)胞數(shù)量少，Cx26蛋白和mRNA水平降低，缺氧增加了Cx26基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化狀態(tài)。啟動(dòng)子區(qū)超甲基化和Cx26的表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致耳聾。

2.2 GJB3基因 GJB3基因編碼含270個(gè)氨基酸的連接蛋白Cx31，該蛋白位于相鄰兩個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞膜內(nèi)，使相鄰細(xì)胞間可以直接交換小分子物質(zhì)及離子，傳遞化學(xué)物質(zhì)和電信號(hào)。GJB3基因突變導(dǎo)致鉀離子循環(huán)障礙，最終導(dǎo)致耳聾。

Cx31在跨膜區(qū)和胞外環(huán)的保守度遠(yuǎn)高于胞質(zhì)區(qū)。GJB3致病性錯(cuò)義突變很少，僅發(fā)現(xiàn)9種錯(cuò)義突變導(dǎo)致NSHI，包括c.94G>A、c.250G>A、c.421A>G、c.497A>G、c.529T>G、c.538C>T、c.547G>A、c.580G>A、c.667C>A。Cx31保守度分析顯示，Cx31保守性低于Cx26，突變對(duì)Cx31的影響小于Cx26，這可能是GJB2突變致聾的人群多于GJB3突變致聾人群的原因之一[26]。GJB3突變可導(dǎo)致常染色體顯性或者隱性遺傳性耳聾和皮膚疾病。近年有研究發(fā)現(xiàn)，c.134G>A可導(dǎo)致紅斑角皮病。

Cx26和Cx31的雙基因雜合突變可導(dǎo)致耳聾。Naseri等[27]對(duì)NSHI患者進(jìn)行GJB2及GJB3基因分析，發(fā)現(xiàn)GJB3突變c.284C>T在與GJB2突變共同存在時(shí)致病，這還需要大規(guī)模家族和功能研究來驗(yàn)證。對(duì)中國5 700例耳聾患者及4 600例正常人的研究表明，GJB3 c.538C>T變異在耳聾和正常個(gè)體中發(fā)病率較低，盡管耳聾的發(fā)病率高于正常組,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明c.538C>T變異對(duì)耳聾的影響較小[28]。

2.3 OTOF基因 OTOF基因主要負(fù)責(zé)編碼Otoferlin，在前庭神經(jīng)細(xì)胞和內(nèi)耳毛細(xì)胞(IHCs)中高度表達(dá)。聽覺依賴于IHCs帶狀突觸上快速、精確且持續(xù)地釋放神經(jīng)遞質(zhì)。該過程需要Otoferlin作為鈣離子傳感器，調(diào)節(jié)內(nèi)耳毛細(xì)胞活性區(qū)域中引發(fā)與突觸前膜囊泡融合和突觸囊泡池補(bǔ)充的速率。OTOF基因突變致病頻率具有種群性。沙特阿拉伯耳聾患者致病基因主要是OTOF，約占33%，近親婚姻偏多導(dǎo)致純合致病突變的高比率。Tang等[29]對(duì)廣西一家系研究發(fā)現(xiàn)，OTOF的復(fù)合雜合突變，包括無義突變c.1273C>T和錯(cuò)義突變c.4994T>C。前者導(dǎo)致密碼子過早終止，致使異常或非功能蛋白出現(xiàn)。c.4994T> C位于C2E和C2F結(jié)構(gòu)域之間，導(dǎo)致脯氨酸取代亮氨酸。

伊朗首次對(duì)OTOF基因進(jìn)行胚胎植入前遺傳學(xué)診斷(PGD)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)新的致病性變異c.1392+1G>A[30]，影響剪接位點(diǎn)并導(dǎo)致內(nèi)含子被保留。有研究發(fā)現(xiàn)，OTOF基因突變導(dǎo)致的耳聾與溫度有關(guān)。在體溫升高時(shí)聽力喪失，溫度下降則恢復(fù)。Otoferlin的純合或復(fù)合雜合突變c.2975-2978delAG/c.4819C>T、c.4819C>T/c.4819C>T或c.2382-2383delC/c.1621G>A可能是溫度敏感性聽神經(jīng)病的原因，另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，OTOF純合突變p.Ile515Thr也導(dǎo)致溫度敏感性耳聾[31，32]。OTOF突變致聾的患者在人工耳蝸植入后表現(xiàn)出良好的電生理反應(yīng)和聽覺及言語能力，不經(jīng)歷年齡相關(guān)聽覺的自發(fā)恢復(fù)過程。

2.4 SLC26A4基因 SLC26A4基因編碼含780個(gè)氨基酸殘基的Pendrin蛋白。SLC26A4基因突變影響Pendrin的合成和功能，導(dǎo)致陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)障礙;引起前庭水管擴(kuò)大，導(dǎo)致耳蝸前庭內(nèi)環(huán)境受顱內(nèi)壓增高的影響增大；造成內(nèi)耳毛細(xì)胞受損。Pendrin對(duì)遠(yuǎn)端腎單位的NaCl重吸收起關(guān)鍵作用，研究表明pendrin基因可能是治療高血壓的新靶點(diǎn)。

目前發(fā)現(xiàn)的SLC26A4基因突變類型有500余個(gè)，且具有種族性和區(qū)域性。Cengiz等[33]對(duì)土耳其、伊朗和墨西哥耳聾患者進(jìn)行全外顯子組或Sanger測(cè)序，發(fā)現(xiàn)4個(gè)新突變位點(diǎn)：c.1673A>G、c.1708-1G>A、c.1952C>T、c.2090-1G>A，在兩個(gè)不相關(guān)家庭中同時(shí)檢測(cè)出突變c.1673A>G。中國研究者發(fā)現(xiàn)，新復(fù)合雜合突變c.589G>A和c.1742G>T，后者為新突變位點(diǎn)，在中國人群中尤其罕見。該突變導(dǎo)致抗sigma拮抗劑結(jié)構(gòu)域中581號(hào)氨基酸位點(diǎn)上的p.R581M轉(zhuǎn)變，影響SLC26蛋白穩(wěn)定性及功能。SLC26A4基因新突變位點(diǎn)c.2110G>C導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)域中氨基酸p.Glu704Gln轉(zhuǎn)變，改變了pendrin蛋白的結(jié)構(gòu)，其構(gòu)象的隨機(jī)性增加，減弱了pendrin陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體的活性[34]。對(duì)攜帶GJB2 35delG突變的NSHI患者的研究發(fā)現(xiàn)，SLC26A4新剪接供體突變c.164+1delG，與致病性突變c.1061T>C共同致聾[35]。

3 小結(jié)與展望

對(duì)耳聾基因的不斷深入研究及二代測(cè)序技術(shù)的大規(guī)模使用，更多的基因突變致聾者能得到準(zhǔn)確的基因診斷。針對(duì)耳聾家庭，遺傳診斷咨詢、生育指導(dǎo)及產(chǎn)前診斷是預(yù)防生育聾兒的主要方法。耳聾并非致死性疾病，因此產(chǎn)前診斷可能導(dǎo)致的引產(chǎn)始終存在倫理爭議。PGD的出現(xiàn)尤為重要，該技術(shù)真正意義上實(shí)現(xiàn)了耳聾的一級(jí)預(yù)防。應(yīng)用二代測(cè)序技術(shù)，單基因遺傳病及染色體篩查同時(shí)進(jìn)行是當(dāng)前PGD領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。基于多重?zé)晒馓结樇夹g(shù)的突變基因檢測(cè)系統(tǒng)具有高度靈敏性，能夠在每個(gè)反應(yīng)中檢測(cè)低至10個(gè)DNA拷貝樣本，且與Sanger測(cè)序具有完全一致性。最重要的是，血液和唾液可以直接用于檢測(cè)，無需DNA提取過程，簡化了操作過程，有望成為臨床實(shí)際應(yīng)用中的首選工具。耳聾基因檢測(cè)率的提高有助于整體提升我國耳聾預(yù)防的水平，優(yōu)化出生人口素質(zhì)。