潘勇，黎紅華,2

(1南方醫(yī)科大學(xué)附屬武漢臨床學(xué)院，武漢 430070；2中國人民解放軍武漢總醫(yī)院)

顱內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化是缺血性卒中的主要原因，有數(shù)據(jù)顯示，近50%的缺血性卒中由顱內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化狹窄引起，且顱內(nèi)動(dòng)脈狹窄越嚴(yán)重、病變范圍越廣泛，卒中的復(fù)發(fā)率越高，預(yù)后越差[1]。因此，研究顱內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)因素及其預(yù)測指標(biāo)對缺血性卒中的防治有重要意義。血管內(nèi)皮功能損傷與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展密不可分。內(nèi)皮微粒(EMP)是內(nèi)皮細(xì)胞激活或凋亡時(shí)釋放的微粒，其水平與血管內(nèi)皮功能損傷密切相關(guān)，目前已受到越來越多學(xué)者的關(guān)注。近年來動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，內(nèi)皮微粒還可通過增加黏附分子(ICAM、VCAM)分泌、減少NO分泌等多種途徑，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的形成與發(fā)展[2]。既往有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮微粒與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化嚴(yán)重程度有關(guān)[3]，但內(nèi)皮微粒與顱內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化關(guān)系的研究尚少。因此，本研究旨在探討EMP和顱內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化狹窄間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年6月～2017年2月于中國人民解放軍武漢總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院并接受頭顱CTA檢查的受試者172例。按是否存在顱內(nèi)動(dòng)脈狹窄分為顱內(nèi)動(dòng)脈狹窄組121例(顱內(nèi)動(dòng)脈病變支數(shù)≥1)和無顱內(nèi)動(dòng)脈狹窄組(對照組)51例。患者均符合以下標(biāo)準(zhǔn)。入選標(biāo)準(zhǔn)：①年齡40～85歲；②至少有1個(gè)以上的下列動(dòng)脈粥樣硬化危險(xiǎn)因素：高血壓、糖尿病、高脂血癥、吸煙；③有完善的腦血管影像學(xué)檢查和頸部超聲檢查。排除標(biāo)準(zhǔn)：①為排除急性腦梗死、腦出血等急性事件對EMP水平的影響，排除急性腦卒中患者；②為排除混雜因素的影響，排除合并存在明顯的顱外動(dòng)脈狹窄者(頸部血管狹窄大于50%)；③有癥狀的外周動(dòng)脈疾?。虎苎仔约膊?、動(dòng)脈瘤、心房纖顫、肝臟或腎臟疾病、心血管介入手術(shù)史、腦部手術(shù)史等。顱內(nèi)動(dòng)脈狹窄組男82例、女39例，年齡(62.8±10.1)歲。高血壓93例，糖尿病50例，高脂血癥43例，吸煙史60例，既往卒中史22例，冠心病14例，收縮壓(158.2±20.5)mmHg，舒張壓(92.9±14.0)mmHg，HbA1c為6.4%±1.5%，F(xiàn)PG(6.6±2.6)mmol/L，TC(4.8±1.4)mmol/L，TG(1.8±1.3)mmol/L，HDL-C(1.1±0.3)mmol/L，LDL-C(2.4±0.9)mmol/L，Hcy(16.5±11.2)μmol/L，纖維蛋白原(3.6±0.7)g/L，頸動(dòng)脈中膜厚度(1.1±0.2)mm。對照組男31例、女20例，年齡(60.3±9.1)歲。高血壓34例，糖尿病13例，高脂血癥17例，吸煙史22例，既往卒中史4例，冠心病5例，收縮壓(152.5±21.3)mmHg，舒張壓(91.8±14.2)mmHg，HbA1c為6.3%±1.2%，F(xiàn)PG(5.7±1.6)mmol/L，TC(4.6±0.9)mmol/L，TG(1.7±1.0)mmol/L，HDL-C(1.2±0.3)mmol/L，LDL-C(2.3±0.6)mmol/L，Hcy(14.3±7.8)μmol/L，纖維蛋白原(3.3±0.6)g/L，頸動(dòng)脈中膜厚度(1.0±0.2)mm。顱內(nèi)動(dòng)脈狹窄組的糖尿病患病率、FPG、纖維蛋白原、頸動(dòng)脈中膜厚度高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。兩組間年齡、性別、高血壓、高血脂、吸煙史、冠心病史、既往卒中史及其他生化指標(biāo)未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05)。

1.2 血漿EMP檢測 172例觀察對象于入院第2天清晨空腹抽取肘靜脈血3 mL于枸櫞酸鈉抗凝的試管中，1 200 r/min離心10 min，抽取上清液，15 000 r/min離心30 min，經(jīng)2次離心后的上清液即為血小板貧瘠的血漿。應(yīng)用美國BD 公司提供的CD31、CD42兩種熒光素標(biāo)記的特異性抗體標(biāo)記樣本，100 μL血漿樣品加入CD31、CD42b抗體各5 μL后，于室溫下孵育20 min，加入3.8 μm標(biāo)準(zhǔn)計(jì)數(shù)微球、0.8 μm校準(zhǔn)微球后，添加PBS緩沖液至500 μL。以美國BD公司FACSCalibur 型流式細(xì)胞儀檢測血漿EMP水平，上樣量為106events。EMP定義為大小在0.8 μm及以下的CD31+/CD42b-微粒。

1.3 動(dòng)脈狹窄的診斷及顱內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化狹窄的負(fù)荷評估 以頭頸部CTA為檢測手段，按WASID標(biāo)準(zhǔn)和NASCET標(biāo)準(zhǔn)，將血管管腔直徑減少>50%或閉塞定義為顱內(nèi)或顱外動(dòng)脈粥樣硬化性狹窄。顱內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化狹窄的負(fù)荷評估包括顱內(nèi)動(dòng)脈狹窄病變的數(shù)量及狹窄程度。顱內(nèi)動(dòng)脈狹窄數(shù)量為狹窄率≥50%的動(dòng)脈段數(shù)量。狹窄程度評分參照Samuels標(biāo)準(zhǔn)[4]，狹窄程度在50%～69%計(jì)1分，70%～99%計(jì)2分，閉塞計(jì)3分。若一個(gè)動(dòng)脈段有多處狹窄，按狹窄最重處計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 兩組血漿EMP水平比較 顱內(nèi)動(dòng)脈狹窄組、對照組EMP水平分別為(224.0±61.5)、(112.3±40.5)個(gè)/μL，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。在校正混雜因素如年齡、性別、高血壓、糖尿病、高血脂、吸煙、收縮壓、FPG、纖維蛋白原、頸動(dòng)脈中膜厚度后，二元Logistic回歸分析顯示，EMP水平是顱內(nèi)動(dòng)脈狹窄的獨(dú)立預(yù)測因子(OR=1.047，P<0.01)。

2.2 EMP水平與顱內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化負(fù)荷間的相關(guān)性 按顱內(nèi)動(dòng)脈段病變支數(shù)分為無明顯狹窄組(血管病變支數(shù)小于1支)51例，局限狹窄組(血管病變支數(shù)1～2支)61例，廣泛狹窄組(血管病變支數(shù)大于2支)60例。等級Logistic回歸分析顯示，在控制可能的混雜因素(年齡、性別、高血壓、糖尿病、高血脂、吸煙、收縮壓、FPG、纖維蛋白原、頸動(dòng)脈中膜厚度)后，EMP(OR=1.037，95%可信區(qū)間1.099～3.414)和纖維蛋白原(OR=1.937，95%可信區(qū)間1.028～1.046)與顱內(nèi)動(dòng)脈狹窄病變范圍呈獨(dú)立正相關(guān)。按顱內(nèi)動(dòng)脈狹窄嚴(yán)重程度評分，分為低分組(1分以下)51例、中分組(1～3分)67例、高分組(3分以上)54例。等級Logistic回歸顯示，在控制上述混雜因素以后，EMP(OR=1.030，95%可信區(qū)間1.023～1.038)和年齡(OR=1.046，95%可信區(qū)間1.006～1.087)與顱內(nèi)動(dòng)脈狹窄嚴(yán)重程度呈獨(dú)立正相關(guān)。Spearman相關(guān)分析顯示，EMP與顱內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化負(fù)荷呈正相關(guān)(血管段數(shù)量：r=0.776,P<0.01；動(dòng)脈狹窄度評分：r=0.766,P<0.01)。校正可能的混雜因素后，偏相關(guān)分析顯示二者之間仍存在相關(guān)性(病變血管段數(shù)量：r=0.635,P<0.01；動(dòng)脈狹窄度評分：r=0.663,P<0.01)。

3 討論

EMP是激活或凋亡的內(nèi)皮細(xì)胞釋放出來的微小囊泡，攜帶有母體細(xì)胞的mRNA、miRNA、受體、特殊蛋白等物質(zhì)。在內(nèi)皮功能受損時(shí)，EMP釋放明顯增加，目前，EMP作為反映內(nèi)皮損傷的指標(biāo)已被國內(nèi)外學(xué)者認(rèn)可[5]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，EMP具有促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的作用。Jansen等將高糖環(huán)境下培養(yǎng)出的EMP，注射至ApoE-/-小鼠血管內(nèi)。結(jié)果與空白對照組小鼠相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化更明顯，表現(xiàn)為斑塊增大，內(nèi)皮舒張功能下降。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，EMP可通過以下途徑促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的形成與發(fā)展：①高糖環(huán)境下誘導(dǎo)的EMP可促進(jìn)P38MAPK-ICAM/VCAM信號通路的表達(dá)，促進(jìn)內(nèi)皮炎癥、損害內(nèi)皮功能，從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。②EMP通過PI3K/AKT-eNOS-NO通路損害血管內(nèi)皮舒張功能。③EMP通過miR126-SPRED1-MAPK途徑，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖減少，黏附因子和趨化因子增多，從而加快動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展[6～8]。EMP不僅是顱內(nèi)動(dòng)脈狹窄的預(yù)測指標(biāo)，其同時(shí)亦可能成為動(dòng)脈粥樣硬化的一個(gè)治療靶點(diǎn)。Diamant等[9]研究表明，他汀類藥物、ACEI類藥物可減少血漿EMP的釋放，但目前關(guān)于此類藥物的研究還不夠深入。EMP能否成為動(dòng)脈粥樣硬化一個(gè)新的治療靶點(diǎn)，尚有待進(jìn)一步研究。

研究中我們發(fā)現(xiàn)，顱內(nèi)動(dòng)脈狹窄組的糖尿病患病率、FPG、頸動(dòng)脈中膜厚度、纖維蛋白原水平均高于對照組。糖尿病是動(dòng)脈粥樣硬化傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)糖尿病病程、FPG與大血管病變關(guān)系更為密切，而HbA1c與小血管病變關(guān)系更密切[10，11]。這或許可以解釋本研究中顱內(nèi)動(dòng)脈狹窄組FPG較對照組升高，而HbA1c無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。頸動(dòng)脈中膜厚度作為反映全身動(dòng)脈粥樣硬化情況的窗口，已成為心腦血管狹窄的預(yù)測指標(biāo)。本研究中纖維蛋白原不僅與顱內(nèi)動(dòng)脈狹窄相關(guān)，在控制混雜因素后，還與顱內(nèi)動(dòng)脈狹窄范圍獨(dú)立正相關(guān)。既往有少許研究顯示纖維蛋白原與冠狀動(dòng)脈狹窄嚴(yán)重程度獨(dú)立相關(guān)[12]。但纖維蛋白原作為一種急性時(shí)相蛋白受諸多因素的影響，因此，二者的關(guān)系尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。本研究結(jié)果顯示，在校正了年齡、性別、高血壓、糖尿病、高血脂、吸煙、收縮壓、FPG、纖維蛋白原、頸動(dòng)脈中膜厚度后，血漿EMP水平和顱內(nèi)動(dòng)脈狹窄相關(guān)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在控制混雜因素后，EMP水平與顱內(nèi)動(dòng)脈病變的廣泛程度和狹窄嚴(yán)重程度呈獨(dú)立正相關(guān)。表明EMP是獨(dú)立的預(yù)測顱內(nèi)動(dòng)脈狹窄及其嚴(yán)重程度的指標(biāo)之一。目前國內(nèi)外研究顯示，EMP與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)疾病有關(guān)。既往學(xué)者報(bào)道，EMP與冠狀動(dòng)脈狹窄、冠心病、外周血管疾病的發(fā)生有關(guān)[3，13，14]。但目前EMP與顱內(nèi)動(dòng)脈狹窄的關(guān)系尚未見研究。本研究中，EMP水平和顱內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化負(fù)荷間呈正相關(guān)的可能原因：糖尿病、高血壓、高血脂等心腦血管病危險(xiǎn)因素會(huì)引起EMP的升高[10]，因此，EMP水平與顱內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化的相關(guān)性可能只是各種傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素的綜合體現(xiàn)。但這種相關(guān)性在應(yīng)用Logistic回歸控制了混雜因素后仍然存在。因此，EMP本身對動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的作用不容忽視。

綜上所述，CD31+/CD42b-內(nèi)皮微粒可作為顱內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化性狹窄嚴(yán)重程度的預(yù)測指標(biāo)，臨床通過檢測CD31+/CD42b-內(nèi)皮微粒，可篩選顱內(nèi)動(dòng)脈狹窄高?；颊撸瑢θ毖宰渲械姆乐斡兄匾饬x。