劉肇修,管程齊,陸翠華,肖明兵,倪潤洲,卞兆連

(1 南通大學(xué)附屬醫(yī)院 ，江蘇南通 226001；2南通大學(xué)附屬南通市第三人民醫(yī)院)

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是一種免疫介導(dǎo)的非特異性炎癥，累及黏膜及黏膜下層，以膿血便及腹痛為特征，有終身復(fù)發(fā)傾向，患者生活質(zhì)量降低。結(jié)直腸癌(CRC)是消化系統(tǒng)常見腫瘤之一，我國CRC發(fā)病率近年呈升高趨勢。腸炎相關(guān)性結(jié)腸癌是UC的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，占UC死亡原因的15%[1]。起病早，病程長，病變范圍廣泛的結(jié)腸型UC患者罹患腸炎相關(guān)性結(jié)腸癌風(fēng)險(xiǎn)顯著增高[1]。與散發(fā)型CRC不同，UC患者炎-癌轉(zhuǎn)變的發(fā)病機(jī)制尚不明確。目前認(rèn)為，慢性炎癥和氧化應(yīng)激活化信號(hào)網(wǎng)絡(luò)通路，誘導(dǎo)遺傳表觀基因修飾，可能促進(jìn)腸炎相關(guān)性腸癌的發(fā)生發(fā)展[2]。富亮氨酸α2糖蛋白-1(LRG-1)于1977年首次從人血清中分離出來，是一種含有312個(gè)氨基酸殘基的50 kD糖蛋白，其中66個(gè)為亮氨酸[3]。LRG-1主要在肝臟細(xì)胞和中性粒細(xì)胞中表達(dá)，參與機(jī)體的免疫反應(yīng)，細(xì)胞增殖與凋亡，細(xì)胞遷移及血管新生[4]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)LRG-1與慢性炎癥性及自身免疫性疾病密切相關(guān)[3，5]。血清LRG-1可作為評估UC疾病活動(dòng)、內(nèi)鏡下黏膜愈合的可靠指標(biāo)[3，6]。同時(shí)，LRG-1與惡性腫瘤相關(guān)[4，7]。在結(jié)腸癌中，LRG-1可通過促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化及血管新生促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展[4]。2017年1月～2018年3月，我們觀察了LRG-1在UC、CRC及腸炎相關(guān)性腸癌組織中的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑:6～8周齡C57BL/6J雄性小鼠40只，購自上海史萊克動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于南通大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。DAB顯色試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)；兔單克隆LRG-1抗體(Abcam)，抗兔/鼠-辣根過氧化物酶結(jié)合的二抗(上海長島生物技術(shù)有限公司)，DSS(MP Biologicals),AOM(Sigma公司)，PrimeScript RT Master Mix試劑盒、TRIzol-reagent及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara BIO.INC)，PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。收集2012年1月～2017年12月南通大學(xué)附屬醫(yī)院就診患者腸黏膜組織標(biāo)本，其中正常組織(取自健康人)20例份，男14例、女6例，年齡(48.7±5.8)歲。UC組織30例份，患者男19例、女11例，年齡(46.7±10.3)歲。UC診斷標(biāo)準(zhǔn)參照UC國內(nèi)共識(shí)意見[8]，患者均為初發(fā)型，未經(jīng)治療，處于疾病活動(dòng)期，其中輕度16例，中度11例，重度2例。按病變累及部位，E1型18例，E2型11例，E3型1例。CRC組織30例份，患者男20例、女10例，年齡(50.5±8.2)歲。CRC的臨床病理分期遵照國際抗癌聯(lián)盟腫瘤TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，其中Ⅰ期3例份，Ⅱ期9例份，Ⅲ期16例份，Ⅳ期2例份。組織分化程度為高分化腺癌6例份，中分化腺癌19例份，低分化腺癌5例份。30 例患者均為初診，未經(jīng)任何手術(shù)，放化療治療。三組患者性別、年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

1.2 動(dòng)物分組及模型建立 將40只SPF級(jí)C57BL/6J雄性小鼠隨機(jī)分為對照組、急性、慢性UC組及UC癌變組，每組各10只。對照組小鼠予以無菌飲用水喂養(yǎng)。急性UC組中，給予小鼠3%DSS(m/V)的飲用水喂養(yǎng)7 d，第7天處死[9]。慢性UC組中，給予小鼠3%DSS (m/V)的飲用水喂7 d，無菌飲用水喂養(yǎng)14 d，共4個(gè)循環(huán)后處死[10]。UC癌變組中，予AOM 10 mg /kg 單次腹腔注射，7 d后給予2.5%DSS (m/V)的飲用水喂養(yǎng)7 d，無菌飲用水喂養(yǎng)14 d，3個(gè)循環(huán)后處死[11]。急性、慢性UC組及UC癌變組小鼠取回盲部至直腸全部腸段，沿縱軸切開，放大鏡下觀察腸黏膜，取病變明顯處組織(糜爛、潰瘍、肉眼腫塊)，將病變組織經(jīng)10%甲醛固定24 h 后取出，予以石蠟包埋、切片，常規(guī)HE 染色，光鏡下觀察病理情況，其余組織凍存于-80 ℃冰箱以提取RNA。UC病理診斷包括:炎細(xì)胞浸潤、腺體缺失、隱窩膿腫、黏膜潰瘍及纖維化。UC相關(guān)性癌變包括重度不典型增生、原位癌及進(jìn)展期腸癌。

1.3 LRG-1蛋白表達(dá)檢測 采用免疫組化法。將組織標(biāo)本以10%中性甲醛固定、包埋，切片后進(jìn)行脫蠟，PBS 洗滌。予以檸檬酸鹽(pH 6.0)微波熱修復(fù)10 min，冷卻至室溫，PBS洗滌后，加入LRG-1抗體(1∶50)，孵育過夜后滴加二抗，隨后予DAB顯色2 min，自來水沖洗10 min，蘇木精復(fù)染，封片。根據(jù)染色陽性細(xì)胞百分比和陽性細(xì)胞著色強(qiáng)度兩項(xiàng)結(jié)果綜合判斷，LRG-1得分為0表示不表達(dá)；得分為1表示少量表達(dá)；得分為2表示中等強(qiáng)度陽性表達(dá)；得分為3表示強(qiáng)陽性表達(dá)。

1.4 LRG-1 mRNA表達(dá)檢測 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)法。通過TRIzol法提取人結(jié)腸活檢標(biāo)本及小鼠腸道標(biāo)本的總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑說明書合成cDNA，以cDNA為模板，利用PCR試劑盒檢測各標(biāo)本的LRG-1表達(dá)，以β-actin作為內(nèi)參。人LRG-1引物序列：正向引物:5′-CCUCUAAGCUCCAAGAAUUTT-3′,反向引物5′-AAUUCUUGGAGCUUAGAGGTT-3′;人β-actin引物序列：正向引物:5′-GTGCTATGTTGCTCTAGACTTCG-3′，反向引物:5′-ATGCCACAGGATTCCATAC-3′；小鼠LRG-1引物序列：正向引物:5′-CGTTCCTGCGCGTCCTGTTC-3′,反向引物:5′-GTCGAAGCCGTCCTGCATGTC-3′；小鼠β-actin引物序列:正向引物:5′-GTGCTATGTTGCTCTAGACTTCG-3′,反向引物:5′-ATGCCACAGGATTCCATACC-3′。通過計(jì)算2-△△CT定量分析LRG-1 mRNA相對表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 對照組，急性、慢性UC組及UC癌變組病理改變 HE染色觀察結(jié)果顯示，對照組無明顯變化。急性、慢性UC組中，固有層和黏膜層內(nèi)可見彌漫性炎細(xì)胞浸潤，急性UC組以中性粒細(xì)胞為主，慢性UC組以淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞為主。結(jié)腸黏膜上皮壞死，黏膜潰瘍，腺體排列紊亂，隱窩變形、融合、消失，杯狀細(xì)胞減少，黏膜下層嚴(yán)重水腫。UC癌變組中，結(jié)腸黏膜細(xì)胞極性消失，細(xì)胞核增大，染色加深，核漿比例倒置，腺管排列紊亂，部分核明顯拉長。

2.2 各組小鼠結(jié)腸黏膜及癌組織中LRG-1 mRNA表達(dá)比較 對照組、急性、慢性UC組及UC癌變組LRG-1 mRNA相對表達(dá)量分別為0.99±0.14、2.65±0.51、4.22±0.78、6.71±1.33，隨著病程慢性化及癌變，LRG-1表達(dá)量逐漸增高，四組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

2.3 人正常結(jié)腸黏膜組織、UC、CRC組織中LRG-1 mRNA及蛋白表達(dá)比較 人正常結(jié)腸黏膜組織、UC及CRC組織中LRG-1 mRNA相對表達(dá)量分別為0.04±0.04、0.13±0.05、0.25±0.07。人正常結(jié)腸黏膜組織中LRG-1 mRNA相對表達(dá)量低于UC及CRC組織中(P均<0.001)，UC組織中LRG-1 mRNA相對表達(dá)量低于CRC組織中(P<0.001)。

免疫組化結(jié)果顯示，LRG-1蛋白在人正常結(jié)腸黏膜組織中不表達(dá)及少量表達(dá)者分別為12例(60%)、8例(40%)；UC組織中不表達(dá)、少量表達(dá)、中等強(qiáng)度陽性表達(dá)及強(qiáng)陽性表達(dá)者分別為3例(10%)、12例(40%)、14例(46.7%)及1例(3.3%)；CRC組織中中等強(qiáng)度陽性表達(dá)及強(qiáng)陽性表達(dá)者分別為13例(43.3%)及17例(56.7%)。人正常結(jié)腸黏膜組織中LRG-1蛋白陽性表達(dá)率低于UC及CRC組織(P均<0.001)，UC組織中的陽性表達(dá)率低于CRC組織(P<0.001)。

3 討論

流行病學(xué)研究表明，炎癥與機(jī)體免疫反應(yīng)相互作用，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。UC是一種結(jié)直腸慢性炎性病變，疾病復(fù)發(fā)與緩解交替，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。UC是CRC的癌前疾病之一，病程愈長，炎癥損傷愈嚴(yán)重，并發(fā)結(jié)腸癌的風(fēng)險(xiǎn)愈高。Choi等[12]發(fā)現(xiàn)UC患者10、20、30、40、50年結(jié)直腸癌的發(fā)生率分別為0.7%、2.9%、6.7%、10%、13.6%。目前關(guān)于腸炎相關(guān)性腸癌的發(fā)病機(jī)制知之甚少。研究提示，CRC中常見的微衛(wèi)星不穩(wěn)定，染色體不穩(wěn)定，DNA過甲基化等現(xiàn)象亦發(fā)生于腸炎相關(guān)性腸癌中，但發(fā)生的時(shí)間點(diǎn)及順序與CRC不同[2]。與散發(fā)型CRC“突變積累-腺瘤-癌變”經(jīng)典模式不同，腸炎相關(guān)性腸癌可能遵循“炎癥-不典型增生(低度、中度)-癌變”的發(fā)病模式[2]。腸道慢性炎癥誘導(dǎo)細(xì)胞因子分泌，氧化應(yīng)激損傷，腸道菌群改變，最終上皮細(xì)胞增殖、生存和遷移，導(dǎo)致腸癌的發(fā)生發(fā)展[2]。

研究發(fā)現(xiàn)，LRG-1與炎癥及自身免疫性疾病有關(guān)。Serada等[13]提出，血清LRG-1水平可有效監(jiān)測自身免疫相關(guān)性疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及克羅恩病患者在接受腫瘤壞死因子α(TNF-α)拮抗劑治療過程中疾病的復(fù)發(fā)與緩解情況，LRG-1可能是通過調(diào)控細(xì)胞因子的釋放參與炎癥發(fā)生發(fā)展。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中，LRG-1促進(jìn)了非依賴于TNF-α信號(hào)通路的炎癥反應(yīng)，可作為評估病情活動(dòng)度的血清標(biāo)志物[5]。研究發(fā)現(xiàn)，與緩解期患者相比，活動(dòng)期UC患者的血清LRG-1顯著升高，且與臨床及內(nèi)鏡下的疾病活動(dòng)相關(guān)[3，6]。除IL-6外，IL-22、TNF-α等因子亦可誘導(dǎo)LRG-1的合成與分泌，這使得LRG-1比C反應(yīng)蛋白更為敏感[3，6]。同時(shí)，處于UC緩解期，且內(nèi)鏡及病理檢查提示黏膜愈合患者的血清LRG-1較活動(dòng)期患者相比顯著下降[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常結(jié)腸黏膜組織相比，LRG-1蛋白及mRNA表達(dá)在UC活動(dòng)期患者組織中表達(dá)明顯增高；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，在DSS誘導(dǎo)的小鼠腸炎模型中，LRG-1 mRNA表達(dá)較對照組明顯升高。提示LRG-1在UC發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定作用，且可作為監(jiān)測UC復(fù)發(fā)與緩解、組織黏膜愈合的有效生物學(xué)指標(biāo)。

已有研究表明，LRG-1與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，與正常人、慢性胰腺炎相比，胰腺癌患者的血清LRG-1明顯升高，進(jìn)展期患者升高尤為顯著[14]。聯(lián)合檢測LRG-1和CA-199有助于胰腺癌的早期診斷[14]。在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，LRG-1過表達(dá)，可能激活腫瘤生長因子-β(TGF-β)信號(hào)通路，下調(diào)E-cadherin的表達(dá)，從而促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移[15]。然而，在肺癌中，LRG-1被發(fā)現(xiàn)可抑制腫瘤細(xì)胞增殖[7]。因此，LRG-1對不同腫瘤的作用差異可能取決于組織特異性[4]。本研究結(jié)果顯示，與正常結(jié)腸黏膜組織相比，LRG-1蛋白及mRNA表達(dá)在CRC組織中明顯增高。既往研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，使用siRNA抑制CRC細(xì)胞株HCT116和SW480的LRG-1表達(dá)后，腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移能力明顯下降。反之，使用重組RNA使LRG-1表達(dá)增強(qiáng)后，腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移能力增加[4]。LRG-1高表達(dá)促進(jìn)CRC發(fā)生發(fā)展的機(jī)制尚不明確。研究發(fā)現(xiàn)LRG-1高表達(dá)可能通過激活HIF-1α誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)，促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和新生血管生成[4]。另外，LRG-1高表達(dá)激活TGF-β通路，增強(qiáng)Smad 1/5磷酸化，誘導(dǎo)新生血管生成可能亦是機(jī)制之一[16]。與CRC相比，腸炎相關(guān)性腸癌的機(jī)制研究相對較少，這主要是因?yàn)槟c炎相關(guān)性腸癌發(fā)病率相對較低，患者病程較長，臨床病例收集歷時(shí)長，因此動(dòng)物模型提供了較為理想的研究手段。參照既往的研究，我們選擇DSS誘導(dǎo)小鼠UC模型，其中慢性UC模型模擬了人UC的自然病程。同時(shí)，選擇AOM和DSS誘導(dǎo)小鼠腸炎相關(guān)性腸癌模型。我們首次發(fā)現(xiàn)，與對照組小鼠相比，急性UC、慢性UC及UC癌變組小鼠的LRG-1 mRNA相對表達(dá)量逐漸增高。隨之，在人結(jié)腸組織中進(jìn)一步驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)在人的正常結(jié)腸黏膜、UC及CRC組織中，LRG-1表達(dá)亦逐漸增高。我們推測，隨著病程慢性化，腸黏膜反復(fù)炎癥損傷組織修復(fù)過程中，LRG-1逐步高表達(dá)，促進(jìn)UC的發(fā)生發(fā)展，誘導(dǎo)UC癌變。正規(guī)結(jié)腸鏡監(jiān)測是防治腸炎相關(guān)性腸癌的有效方法，但其具有侵入性，有穿孔及加重病情的可能，花費(fèi)較高[6]。對病程較長、病情較重的UC高?；颊?，LRG-1可作為有效的生物標(biāo)志物監(jiān)測腸道黏膜癌變。

綜上所述，LRG-1在UC、CRC組織中表達(dá)升高，其可能參與了UC、CRC的發(fā)生發(fā)展。LRG-1可能是一個(gè)潛在的生物標(biāo)志物，有助于監(jiān)測UC相關(guān)性腸癌的發(fā)生。