李 翀 翁書(shū)和 梁莉萍 宋 斐 吳思慧

（1.三亞市人民醫(yī)院，海南三亞572000； 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東廣州510405；3.廣東藥學(xué)院第一附屬醫(yī)院，廣東廣州510304）

膿毒癥（sepsis）表現(xiàn)為因感染引起宿主反應(yīng)失調(diào)而導(dǎo)致危及生命的器官功能障礙，全球每年有數(shù)百萬(wàn)人罹患膿毒癥，其中1/4甚至更多的患者死亡[1]。本病發(fā)病機(jī)制尚不能完全闡明，TLR4是其發(fā)病機(jī)制中可能的啟動(dòng)因子，并通過(guò)NF-κB等一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，導(dǎo)致炎癥因子“瀑布樣爆發(fā)”[2]。中醫(yī)認(rèn)為感染屬于毒熱證范疇，病機(jī)屬“熱毒熾盛”，而膿毒癥各個(gè)時(shí)期都可存在嚴(yán)重感染，使用清熱解毒法解決“毒邪”這一主要矛盾，必可取得良好療效[3]。本課題組前期采用黃連解毒湯作為基本方，發(fā)現(xiàn)加味黃連解毒湯能降低實(shí)熱證多器官功能障礙綜合征（MODS）患者器官衰竭的發(fā)生率和病死率[4]，但黃連解毒湯治療MODS的機(jī)理尚不明確。本研究觀察了黃連解毒湯對(duì)膿毒癥模型小鼠血清及肺組織炎癥因子表達(dá)、TLR4轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響，探究其對(duì)膿毒癥小鼠肺損傷保護(hù)作用的機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)ICR小鼠100只，雌雄各半，體重（20±1.2）g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（粵）2011-0092。

1.2 藥物與試劑 黃連解毒湯水煎劑由廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑中心制備，藥物組成：黃連10g、黃芩10g、黃柏10g、梔子10g（成人日服劑量），將藥物濃縮成50%、100%、200%藥液（相當(dāng)于生藥量0.13、0.27、0.53g/mL）各150mL并滅菌保存。酵母多糖A（Zymosan A）凍干粉，Sigma公司；白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）測(cè)試盒，上海酶聯(lián)生物科技；RT-PCR引物、實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR引物，上海英俊生物技術(shù)有限公司；RT-PCR、實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR試劑盒及相關(guān)溶液，Roche公司。

1.3 儀器 2400型PCR儀，Perkin Elmer公司；7300型實(shí)時(shí)定量PCR儀，ABI公司；5810R型超低溫高速離心機(jī)，Eppendorf公司；酶聯(lián)分析儀，Tecan Genio公司；BH-2顯微鏡，日本奧林巴斯公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組、造模與給藥 將100只小鼠按分層隨機(jī)抽樣法分為正常組、模型組和黃連解毒湯高、中、低劑量組，每組20只，每組又分為造模后24h和48h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)組，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)10只。按照胡森等[5-6]方法制作小鼠膿毒癥模型：把4g酵母多糖A與50mL滅菌石蠟油混合，高頻振蕩30min，超聲振蕩6h，制成造模用混懸液，無(wú)菌條件下，模型組每只動(dòng)物予腹腔注射1mg/kg劑量酵母多糖-石蠟混懸液，建立膿毒癥小鼠模型。造模后動(dòng)物出現(xiàn)呼吸急促、寒戰(zhàn)、活動(dòng)減少、反應(yīng)遲鈍、進(jìn)食進(jìn)水減少、排尿減少等膿毒癥表現(xiàn)，提示造模成功。造模同日開(kāi)始灌胃給藥。給藥劑量采用體表面積換算，中劑量組給藥劑量等效于成人（70kg計(jì)），即每日給予小鼠0.2mL/10g灌胃，低、中、高劑量組分別給予50%、100%、200%藥液，正常組和模型組給予等體積生理鹽水，1次/d，持續(xù)至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)。

2.2 動(dòng)物行為學(xué)觀察 造模后分別于24h、48h觀察各組動(dòng)物一般狀況，如動(dòng)物毛發(fā)色澤、活動(dòng)能力、進(jìn)食及飲水情況、排便情況。

2.3 血清炎癥因子檢測(cè) 造模后24h、48h動(dòng)物眼眶采血留取血清樣本備檢，采用ELISA法檢測(cè)TNF-α、IL-6水平。

2.4 熒光定量PCR法檢測(cè)肺組織NF-κBp65、TLR4 mRNA表達(dá) 按Takara公司試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA后，按Fermentas公司試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RT-PCR，RT條件：42℃×60min，70℃×5min。轉(zhuǎn)錄后的cDNA按Takara公司試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行real-time PCR（25μL體系）。TLR4引物序列：Forward Primer 5’-ttggggaggaa gaaaggtctaac-3’，Reverse Primer 5’-tgctgactgaaataaggtgaaagc-3’；NF-κBp65引物序列：Forward Primer 5’-gaatctccctggtcaccaaagac-3’，Reverse Primer 5’-cagcctcatagaagccatccc-3’。real-time PCR反應(yīng)條件（兩步法）：Stage 1，預(yù)變性，Repeat 1，95℃30s；Stage 2，PCR反應(yīng)，Repeat 40，95℃5s，60℃31s；Dissociation Stage，反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)Real Time PCR的擴(kuò)增曲線和溶解曲線。

2.5 肺組織病理觀察 造模后24h、48h取血后頸椎脫臼法處死小鼠，剪取肺組織置于4%甲醛溶液中固定，經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟等處理，采用HE染色后于光鏡下觀察病理改變，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科完成。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以（±s）表示，符合正態(tài)分布者采用 t 檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布者采用非參數(shù)檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 各組小鼠不同時(shí)點(diǎn)血清炎癥因子水平比較（±s）

表1 各組小鼠不同時(shí)點(diǎn)血清炎癥因子水平比較（±s）

注： 與正常組比較，**P＜0.01；與同時(shí)點(diǎn)模型組比較，##P＜0.01；與同時(shí)點(diǎn)低劑量組比較，△△P＜0.01；與本組24h比較，◆◆P＜0.01。

正常組24h1042.50±9.1041.08±9.13 48h1040.67±7.9639.81±8.83模型組24h10612.23±38.28**267.32±28.01**48h10757.11±38.47**◆◆321.60±37.76**◆◆黃連解毒湯低劑量組24h10550.25±51.92**##196.06±13.66**##48h10486.85±42.53**##◆◆146.79±16.40**##◆◆黃連解毒湯中劑量組24h10466.00±49.42**##△△161.24±23.92**##△△48h10205.33±54.09**##△△◆◆125.61±23.42**##△△◆◆黃連解毒湯高劑量組24h10441.74±56.40**##△△155.33±17.67**##△△48h10189.41±39.43**##△△◆◆116.88±19.90**##△△◆◆

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 小鼠行為學(xué)觀察 正常組小鼠呼吸均勻，毛色光亮，活動(dòng)靈敏，進(jìn)食飲水正常，大小便顏色和頻次正常。模型組小鼠在造模24h后普遍出現(xiàn)鼠毛臟濕、膚溫涼、眼瞼充血水腫、呼吸促、肢體顫抖、活動(dòng)減少、反應(yīng)遲鈍、進(jìn)食進(jìn)水減少、排便排尿減少的表現(xiàn)，48h時(shí)上述癥狀明顯加重。黃連解毒湯各劑量組小鼠在造模后也普遍出現(xiàn)鼠毛臟濕、活動(dòng)減少、進(jìn)食進(jìn)水減少的表現(xiàn)，但呼吸、活動(dòng)、進(jìn)食水及排便情況均明顯優(yōu)于模型組，尤其以中、高劑量組情況更佳，48h時(shí)上述癥狀明顯減輕。

3.2 各組小鼠血清炎癥因子水平比較 結(jié)果見(jiàn)表1。造模后，與正常組比較，模型組小鼠血清IL-6、TNF-α均明顯升高（P＜0.01），48h組較24h組有明顯增加（P＜0.01）。黃連解毒湯各劑量組小鼠血清IL-6、TNF-α水平雖仍顯著高于正常組（P＜0.01），但各時(shí)點(diǎn)均顯著低于模型組（P＜0.01），48h顯著低于24h（P＜0.01），以中、高劑量組效果更為明顯，中、高劑量組組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3.3 各組小鼠肺組織NF-κBp65、TLR4 mRNA轉(zhuǎn)錄水平比較 見(jiàn)表2。NF-κBp65、TLR4 mRNA在小鼠肺組織中均有表達(dá)。模型組各時(shí)點(diǎn)NF-κBp65、TLR4 mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯高于正常組（P＜0.01），其中48h時(shí)點(diǎn)表達(dá)量更高（P＜0.01）；黃連解毒湯中、高劑量組TLR4 mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯低于模型組（P＜0.01），黃連解毒湯各劑量組NF-κBp65 mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯低于模型組（P＜0.01）。黃連解毒湯中、高劑量組水平明顯低于低劑量組（P＜0.01），中、高劑量組組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。中、高劑量組48h水平明顯低于24h（P＜0.05，P＜0.01）。

3.4 各組小鼠肺組織病理變化 光鏡下觀察各組小鼠的肺組織病理變化見(jiàn)圖1。正常組小鼠肺組織未見(jiàn)損害。模型組肺泡隔明顯增寬，大部分肺泡萎陷，部分肺泡內(nèi)見(jiàn)較多紅細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞質(zhì)疏松、染色變淺，細(xì)胞核增大、染色變淺，48h時(shí)上述病理改變加重。黃連解毒湯各劑量組肺損害較模型組明顯減輕，僅見(jiàn)部分肺泡隔增寬和肺泡萎陷，肺泡內(nèi)見(jiàn)少量紅細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)疏松、染色正常，細(xì)胞核增大、染色正常，但48h時(shí)上述病理改變較24h仍有加重。

表2 各組小鼠不同時(shí)點(diǎn)肺組織NF-κBp65、TLR4 mRNA轉(zhuǎn)錄水平比較（±s）

表2 各組小鼠不同時(shí)點(diǎn)肺組織NF-κBp65、TLR4 mRNA轉(zhuǎn)錄水平比較（±s）

注： 與正常組比較，**P＜0.01；與同時(shí)點(diǎn)模型組比較，##P＜0.01；與同時(shí)點(diǎn)低劑量組比較，△△P＜0.01；與本組24h比較，◆P＜0.05，◆◆P＜0.01。

正常組24h101.01±0.170.459±0.170 48h100.928±0.180.477±0.212模型組24h105.08±1.17**3.143±1.036**48h107.13±1.20**◆◆3.917±0.728**◆◆黃連解毒湯低劑量組24h104.25±0.90**##2.65±0.68**48h103.89±0.85**##2.22±0.74**##黃連解毒湯中劑量組24h102.48±0.61**##△△2.143±0.610**##△△48h101.83±0.52**##△△◆◆1.565±0.733**##△△◆黃連解毒湯高劑量組24h102.7±0.68**##△△1.994±0.618**##△△48h102.01±0.59**##△△◆◆1.508±0.718**##△△◆◆

圖1 各組小鼠肺組織病理變化（HE染色，×100）

4 討論

TLR樣受體（Toll-like receptors，TLRs）被認(rèn)為是生物體最重要的模式識(shí)別受體，其在天然免疫細(xì)胞的表達(dá)使機(jī)體能夠及時(shí)感知感染等危險(xiǎn)信號(hào)[7]。其中，TLR4可以識(shí)別不同的細(xì)菌或病毒產(chǎn)物，它識(shí)別革蘭陰性菌內(nèi)毒素脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），通過(guò)MyD88依賴(lài)和非MyD88依賴(lài)兩種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路途徑誘導(dǎo)NF-κβ，使之移位進(jìn)入細(xì)胞核，啟動(dòng)炎癥因子如TNF-α和IL-6等的大量表達(dá)，最終導(dǎo)致肺等器官的損傷甚至多器官功能障礙綜合征[2，7-8]。

中醫(yī)理論認(rèn)為，“毒邪”是膿毒癥發(fā)生發(fā)展中必要的病理因素，熱毒煎熬血分，最后導(dǎo)致正虛邪實(shí)，氣滯血瘀，陰陽(yáng)逆亂，衰而竭之[3，9]，因此清熱解毒法在膿毒癥治療中有著重要的地位。研究表明，清熱解毒代表方黃連解毒湯對(duì)銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和沙門(mén)菌等多種細(xì)菌均有高效抑制作用，能對(duì)抗細(xì)菌毒素，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[10-12]；能阻斷LPS所誘導(dǎo)的TLR4高表達(dá)，從而抑制相關(guān)基因表達(dá)產(chǎn)物TNF-α、IFN-β過(guò)度分泌[13]；還可以延長(zhǎng)膿毒癥大鼠的生存時(shí)間，減輕炎癥因子對(duì)器官的損傷，降低死亡率[14-15]。

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)酵母多糖腹腔注射造模后，各組小鼠血清IL-6、TNF-α含量明顯升高，造模后48h更高于24h，這與人體發(fā)生膿毒癥后炎癥因子在體內(nèi)進(jìn)行性升高相符合。黃連解毒湯各劑量組較模型組同時(shí)間點(diǎn)血清IL-6、TNF-α水平均有明顯下降，以中、高劑量組作用尤其顯著。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與模型組各時(shí)段相比較，黃連解毒湯各劑量組肺組織NF-κBp65、TLR4 mRNA基因表達(dá)水平均有顯著降低，這一趨勢(shì)與血清炎癥因子的降低基本吻合。同時(shí)，病理結(jié)果顯示，黃連解毒湯能顯著保護(hù)小鼠肺組織結(jié)構(gòu)的完整性，減輕肺泡塌陷和細(xì)胞水腫。提示黃連解毒湯可能是通過(guò)調(diào)控TLR4、NF-κB的表達(dá)進(jìn)而抑制膿毒癥小鼠的炎癥反應(yīng)，減少炎癥因子的表達(dá)，以降低肺損傷的程度。中、高劑量效果更為顯著，但組間并無(wú)顯著性差異，證實(shí)了黃連解毒湯中劑量即可達(dá)到較好的療效，因此治療最佳劑量確定為中劑量即臨床常用劑量。下一步課題組擬探討黃連解毒湯對(duì)膿毒癥小鼠TLR4/NF-κβ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上其他級(jí)聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物的影響。

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