華燕青 王云云 李娟麗

（楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西楊凌712100）

薄荷為唇形科植物薄荷（Mentha haplocalyx Briq.）的干燥地上部分，具有疏散風(fēng)熱、清利頭目、利咽、透疹、疏肝行氣的功效[1]，其主要化學(xué)成分有揮發(fā)油、黃酮類、蒽醌類、酚酸類等[2]。藥理學(xué)研究表明，薄荷黃酮具有良好的抗病毒、抗氧化、抗炎等作用，其中含量較高的橙皮苷、香葉木苷、香蜂草苷、蒙花苷具有抗流感病毒、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫力等良好的藥理活性[3]。目前薄荷中總黃酮的提取工藝主要采用了有機(jī)溶劑提取法和超聲波提取法[4-7]，相對于這些提取方法，超臨界CO2萃取技術(shù)以超臨界狀態(tài)下的流體作為萃取劑，能有效從植物中萃取有效成分，具有萃取速度快、操作溫度低、提取效率高、有機(jī)溶劑用量少等優(yōu)點(diǎn)[8]，該技術(shù)已在植物黃酮類成分的提取中得到廣泛應(yīng)用[9-10]。本研究采用超臨界二氧化碳萃取技術(shù)對薄荷進(jìn)行萃取，并探討優(yōu)化萃取工藝條件，以期為薄荷的進(jìn)一步開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器與設(shè)備 HA120-50-01型超臨界萃取裝置（江蘇南通華安超臨界萃取有限公司）；UV1800紫外-可見分光光度儀（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；RA-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；電子分析天平（常州科源電子儀器廠）；KQ-100DE超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）。

1.2 藥物與試劑 薄荷藥材，購于北京同仁堂陜西經(jīng)銷部；二氧化碳，純度99.5%，購于楊凌建一工業(yè)氣體供應(yīng)站；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（批號110753-201415）購于中國藥品生物制品檢定所；水為自制超純水；無水乙醇、石油醚（30-60）、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉均為分析純。

2 方法

2.1 薄荷總黃酮的提取方法 薄荷干燥莖葉粉碎過10目篩，準(zhǔn)確稱取干粉100g裝入1L萃取釜中，啟動冷循環(huán)，設(shè)定萃取與分離溫度，達(dá)到設(shè)定溫度后，打開鋼瓶閥門，開啟CO2泵，CO2經(jīng)過濾后由壓縮機(jī)壓縮入萃取罐，達(dá)到設(shè)定壓力，加入一定量的夾帶劑進(jìn)行超臨界萃取，一定時間后收集萃取物，將萃取物用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至膏狀。所得膏狀物用石油醚萃取除去脂溶性雜質(zhì)，收集萃余相，用70%乙醇溶解，得總黃酮萃取溶液。

2.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的測定 吸收光譜的測定：準(zhǔn)確稱取干燥并恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.0121g，用70%的乙醇稀釋定容至25mL量瓶中，搖勻，超聲溶解，放冷，配成0.2mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。分別取2支25mL比色管，標(biāo)記為1號、2號管。1號管作空白，準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液1.0mL置于2號管中，兩管各加入70%的乙醇至10.0mL，加入5%的亞硝酸鈉1mL，搖勻，放置6min，加10%硝酸鋁1mL，搖勻，放置6min，再加4%氫氧化鈉10mL，加水至刻度，搖勻，放置15min。用1號管作空白對照，在190～600nm對2號管進(jìn)行掃描，經(jīng)過比較，確定其最佳吸收波長為510nm。

標(biāo)準(zhǔn)溶液工作曲線的繪制：準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL，分別置于25mL量瓶中，按標(biāo)準(zhǔn)溶液相同方法顯色，以70%乙醇為空白，在510nm下測定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到吸光度（A）-蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（C）的回歸方程：A=14.859C-0.056，相關(guān)系數(shù)r=0.9993。

2.3 樣品溶液的測定 準(zhǔn)確吸取總黃酮萃取溶液各1.0mL置于25mL比色管中，采用與標(biāo)準(zhǔn)溶液相同的方法顯色，測定總黃酮濃度，根據(jù)下式計(jì)算薄荷總黃酮提取率，式中C為總黃酮質(zhì)量濃度（mg/mL），V為總黃酮萃取液體積（mL），m為薄荷原料質(zhì)量（g）。

提取率（%）=C×V×稀釋倍數(shù)/m×10-3×100%

3 結(jié)果

3.1 夾帶劑的選擇 黃酮類成分極性較大，所以采用CO2作為超臨界流體進(jìn)行萃取時需加入夾帶劑。夾帶劑種類首選乙醇，黃酮苷一般易溶于熱水、甲醇、乙醇、稀堿液等強(qiáng)極性溶劑中。薄荷中含有大量的黃酮苷類物質(zhì)，使用較大極性的溶劑提取效果較好[7]。由于低濃度的乙醇在制冷過程中容易造成超臨界流體萃取管路堵塞，因此選擇50%、60%、70%、80%、90%乙醇為夾帶劑，改變流體極性，進(jìn)行超臨界萃取，比較不同濃度乙醇對提取率的影響。

按照2.1項(xiàng)下的提取方法，控制萃取條件：萃取壓力25MPa，萃取溫度55℃，萃取時間60min，CO2流量25L/h，夾帶劑加入量600mL，考察總黃酮提取率的變化。結(jié)果表明采用70%乙醇體積分?jǐn)?shù)時，總黃酮提取率最高，見表1，所以選定70%乙醇作為夾帶劑進(jìn)行超臨界萃取。

表1 不同夾帶劑對提取率的影響

3.2 單因素試驗(yàn)

3.2.1 夾帶劑用量 按照2.1項(xiàng)下提取方法，在萃取溫度55℃、萃取壓力25MPa、萃取時間60min，以70%乙醇做夾帶劑，分別按3、4、5、6、7mL/g加入夾帶劑，考察不同用量的夾帶劑對薄荷總黃酮提取率的影響。結(jié)果見圖1。由圖1可知，隨著夾帶劑用量的增加，總黃酮提取率逐漸增大，70%乙醇用量為6mL/g時的提取效果較好，用量增大后提取率變化不顯著，進(jìn)一步增大夾帶劑用量會造成乙醇損耗增加，故選擇6mL/g為適宜夾帶劑加入量。

圖1 夾帶劑用量對提取率的影響

3.2.2 萃取壓力 超臨界流體具有很大的可壓性，在一定溫度下，壓力增大，超臨界流體的密度增加，溶質(zhì)在流體中的溶解度增大，萃取效率提高，有利于提高總黃酮的萃取量。按照2.1項(xiàng)下的提取方法，設(shè)定萃取溫度55℃，以70%乙醇為夾帶劑，用量6mL/g，考察萃取壓力為10、15、20、25、30MPa時，超臨界萃取60min后，總黃酮提取率的變化。結(jié)果見圖2。由圖2可知，隨著萃取壓力增大，提取率升高。壓力為30MPa的提取率相對于25MPa的提取率雖有小量增幅，但萃取壓力過高，生產(chǎn)成本、不安全因素也會增加，因此萃取壓力選擇25MPa。

圖2 萃取壓力對提取率的影響

3.2.3 萃取溫度 按照2.1項(xiàng)下的提取方法，在萃取壓力25MPa，70%乙醇夾帶劑用量6mL/g時，考察萃取溫度分別為45、50、55、60、65℃時，超臨界萃取60min后，考察不同萃取溫度下總黃酮提取率的變化。結(jié)果見圖3。由圖3可知，總黃酮的提取率隨溫度升高呈上升趨勢，萃取溫度為55℃達(dá)到一個最大值，之后減小，因此正交試驗(yàn)選擇50℃、55℃、60℃作為試驗(yàn)值。

圖3 萃取溫度對提取率的影響

3.2.4 萃取時間 按照2.1項(xiàng)下的提取方法，在萃取溫度55℃、萃取壓力25MPa、夾帶劑用量6mL/g條件下，選擇萃取時間30、60、90、120、150min，考察不同萃取時間對薄荷總黃酮提取率的影響。結(jié)果見圖4。由圖4可知，萃取時間增加，總黃酮提取率逐漸增大，但增加趨勢緩慢，萃取90min時，提取率最高，隨后提取率下降。因此，正交試驗(yàn)選擇60min、90min、120min為試驗(yàn)值。

圖4 萃取時間對提取率的影響

3.3 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)因素水平，見表2，通過正交試驗(yàn)測定不同組合下薄荷總黃酮的提取率，并對所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行極差分析，結(jié)果見表3。結(jié)果表明正交試驗(yàn)各因素的影響主次關(guān)系為：夾帶劑用量＞萃取壓力＞萃取時間＞萃取溫度。通過極差分析結(jié)果可知，最佳的工藝條件為：A3B3C2D2，即夾帶劑用量6mL/g、萃取壓力25MPa、萃取溫度55℃、萃取時間90min。采用此優(yōu)化的工藝條件進(jìn)行超臨界萃取操作，所得薄荷總黃酮的最高提取率達(dá)到3.72%，重復(fù)3次驗(yàn)證試驗(yàn)的平均提取率為3.58%，基本接近正交試驗(yàn)結(jié)果，故此法的最優(yōu)工藝條件穩(wěn)定可靠。

表2 正交試驗(yàn)水平

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

4 討論

超臨界CO2萃取技術(shù)在中草藥有效成分的萃取中應(yīng)用頗多，適用于非極性或極性小的化合物的提取，但對極性物質(zhì)的溶解度很低。薄荷中含有大量的黃酮苷類物質(zhì)和少量的游離黃酮類，應(yīng)采用強(qiáng)極性溶劑萃取，試驗(yàn)中使用40%乙醇為夾帶劑時，物料容易結(jié)塊，影響萃取效果。單因素試驗(yàn)中隨著萃取溫度的升高，超臨界CO2流體的密度會下降，但物質(zhì)的擴(kuò)散系數(shù)和傳質(zhì)效率增大，使CO2流體溶解能力與溫度成正比，導(dǎo)致物質(zhì)在CO2流體中的溶解度增大。但黃酮類物質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)不夠穩(wěn)定，部分隨溫度升高而分解，最終導(dǎo)致其含量下降。超過一定溫度，CO2的密度降低，其溶解能力會降低，黃酮類成分的萃取率也下降。

本試驗(yàn)以采收期薄荷莖葉為材料，研究超臨界CO2萃取薄荷中黃酮類成分的最佳工藝條件，采用紫外分光光度法測定總黃酮含量，優(yōu)選夾帶劑種類，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，探究夾帶劑用量、萃取壓力、萃取溫度等對萃取率的影響。結(jié)果表明最佳的工藝條件為：以70%乙醇為夾帶劑，其用量6mL/g，萃取壓力25MPa，萃取溫度55℃，萃取時間90min。超臨界CO2萃取法具有提取率高，產(chǎn)品的純度好，有機(jī)溶劑用量少，工藝簡單方便的優(yōu)點(diǎn)。

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