鄭爽，姜曉明，王薈凌，薛勇，李兆杰，薛長湖

(中國海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003)

1 概述

南極磷蝦(Euphausiasuperba)是一種生活在南極洲水域的磷蝦。有研究指出南極磷蝦中含有高品質(zhì)蛋白和豐富脂質(zhì)[1,2]，含量分別為16.31%和1.3%。富含礦物質(zhì)，含量為2.76%，高于日本對蝦(1.6%)、蛤蜊(2.2%)等多種海產(chǎn)品。其蛋白水解產(chǎn)物包含人體所需的8 種必需氨基酸，其中，谷氨酸含量最高，賴氨酸次之，具有巨大的開發(fā)潛力[3]。南極磷蝦不但營養(yǎng)物質(zhì)豐富，還含有多種活性物質(zhì)，如蛋白消化酶、類胞菌素氨基酸等[4]。中國的南極磷蝦產(chǎn)業(yè)發(fā)展勢頭良好，將成為世界主要南極磷蝦產(chǎn)業(yè)發(fā)展地之一。

近年來，人們對調(diào)味粉的要求已從單一的鮮味型轉(zhuǎn)向復(fù)合的天然風(fēng)味型、營養(yǎng)型、功能型。水產(chǎn)品調(diào)味粉因富含氨基酸、多肽、糖、有機酸、核苷酸等呈味成分和?；撬岬缺＝〕煞郑哂歇毺仫L(fēng)味而備受人們青睞。

本實驗以冷凍南極磷蝦為原料，采用二段復(fù)合酶解的方式，先用復(fù)合蛋白酶將蛋白質(zhì)水解為多肽片段，再用風(fēng)味蛋白酶去除苦味，增加鮮味。最后經(jīng)過美拉德反應(yīng)、復(fù)配調(diào)味，制成具有明顯蝦味的南極磷蝦調(diào)味粉。

2 材料與方法

2.1 材料與儀器

2.1.1 材料

整只南極磷蝦(Euphausiasuperba)冷凍蝦磚由日本水產(chǎn)株式會社提供，于低溫(≤-30 ℃)冷庫中經(jīng)粉碎機粉碎后置低溫(≤-30 ℃)下貯藏備用。復(fù)合蛋白酶(最適pH 5.5～7.5，1.5 AU/g)，購于諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司；風(fēng)味蛋白酶(最適pH 6.0～7.5，30 U/mg)，南寧東恒華道生物科技有限責(zé)任公司；Ca(OH)2、NaOH、NaCl、磷酸、三氯甲烷、甲醇，購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司；其他試劑，均為國產(chǎn)分析純。

2.1.2 儀器與設(shè)備

YC-1800實驗型噴霧干燥機 上海雅程儀器設(shè)備有限公司；CJF-0.05L實驗型高壓反應(yīng)釜 西安常儀儀器設(shè)備有限公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋、JJ-1精密增力電動攪拌器 常州國華電器有限公司；JB-1A型磁力攪拌器 上海精密科學(xué)儀器有限公司；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；Biochrom 30 型氨基酸自動分析儀 英國Biochrom公司;PF-1型氟電極、232型甘汞參比電極 上海雷磁精密科學(xué)儀器有限公司；PHS-3C型精密酸度計 上海雷磁儀器廠；GL-20M型高速冷凍離心機 上海盧湘儀離心機儀器廠；TDL-5-A型低速大容量離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；5973-6890N型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司；STARTER 3100型pH計 美國Ohaus公司；AB135-S型精密電子分析天平 瑞士Mettler-Toledo公司。

2.2 實驗方法

2.2.1 南極磷蝦調(diào)味粉的制備工藝

整蝦解凍→一段酶解→二段酶解→脫氟→調(diào)節(jié)pH→美拉德反應(yīng)→噴霧干燥→調(diào)配→成品。

2.2.2 二段復(fù)合酶解工藝

將低氟冷凍南極磷蝦整蝦于室溫解凍，加入3倍質(zhì)量的水，攪拌升溫，進行酶解反應(yīng)。

一段酶解：加入0.5%復(fù)合蛋白酶(58 ℃)，酶解時間分別為30，60，75，90，105，120，150 min；再進行二段酶解：加入0.4% 風(fēng)味蛋白酶(50 ℃)，酶解時間分別為30，60，75，90，105，120，150，180，210 min。兩段酶解完成后離心(5000 r/min，15 min)，取上清，棄渣，得到南極磷蝦酶解上清液。

2.2.3 脫氟工藝

向南極磷蝦酶解上清液中加入液體質(zhì)量1% 的Ca(OH)2，室溫下攪拌15 min后，靜置30 min，離心(4500 r/min，20 min)，取上清，棄渣，得到南極磷蝦低氟酶解上清液。

2.2.4 調(diào)節(jié)pH

向南極磷蝦低氟酶解上清液中滴加食品級磷酸，邊攪拌邊調(diào)節(jié)液體pH至6.6～6.8，調(diào)節(jié)完成后攪拌15 min，靜置30 min，得到pH適合的南極磷蝦低氟酶解上清液。

2.2.5 美拉德反應(yīng)

向pH適合的南極磷蝦低氟酶解上清液中加入9% 的葡萄糖、4%的木糖、4%的酵母抽提物KA66，充分混合均勻后，升溫物料，使之于100 ℃進行美拉德反應(yīng)，時間6 min。待降溫后進行噴霧干燥。

2.2.6 噴霧干燥工藝

將熱反應(yīng)結(jié)束后pH適合的南極磷蝦低氟酶解上清液，置于YC-1800實驗型噴霧干燥機中，進行噴霧干燥。

2.2.7 單因素實驗

以鹽、白砂糖、味精、I+G為單因素，結(jié)合感官評價確定各因素的最佳用量，得到基本配方。

2.2.8 復(fù)配調(diào)味工藝

將噴霧干燥得到的南極磷蝦調(diào)味粉基料按照單因素實驗結(jié)果進行復(fù)配調(diào)味，并充分混合均勻。

2.2.9 南極磷蝦調(diào)味粉的基本成分測定及微生物指標(biāo)檢測

2.2.9.1 可溶性固形物含量

取少量南極磷蝦調(diào)味粉溶于去離子水后，采用高溫干燥法測定。

2.2.9.2 蛋白質(zhì)含量

采用福林酚法測定。繪制標(biāo)準曲線后，取少量南極磷蝦調(diào)味粉溶于去離子水，吸取樣液(南極磷蝦調(diào)味粉水溶液)1 mL，加入5 mL甲液(A液∶B液為5∶1，混合均勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。A液：Na2CO310 g，NaOH 2 g，酒石酸鉀鈉0.25 g，溶于500 mL蒸餾水中；B液：CuSO4·5H2O 0.25 g 溶于100 mL去離子水中)，靜置10 min；后加入0.5 mL乙液(福林酚試劑)，搖勻，靜置30 min，于OD650 nm處測吸光值，根據(jù)標(biāo)準曲線計算出蛋白質(zhì)含量。

2.2.9.3 總脂含量

采用氯仿-甲醇法提取南極磷蝦調(diào)味粉中的脂肪后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將氯仿蒸干，準確稱取旋蒸前后旋蒸瓶的質(zhì)量，計算出南極磷蝦調(diào)味粉中的脂肪含量即可。

2.2.9.4 氨基酸態(tài)氮含量

準確稱取5 g南極磷蝦調(diào)味粉，加去離子水定容至100 mL，吸取20 mL試液(南極磷蝦調(diào)味粉水溶液)，加入去離子水60 mL，用0.05 mol/L NaOH標(biāo)準溶液滴定至pH為8.2，記錄消耗的NaOH體積。向上述pH為8.2的溶液中加入10.00 mL 36%的中性甲醛溶液，再用NaOH標(biāo)準溶液滴定至pH為9.2，記錄消耗的NaOH體積V1，V2。需將試液換成去離子水進行空白滴定。

氟含量：采用高氯酸浸提-氟離子選擇電極法。精確稱取約1 g樣品于容量瓶中，加入10 mL 0.1 mol/L高氯酸消化2 h，加入TISAB 25 mL，用超純水定容至50 mL，以氟離子選擇電極進行測定即可。

NaCl含量：采用AgNO3滴定法。準確稱取南極磷蝦調(diào)味粉2～5 g，放置于坩堝中，炭化至無黑煙，用去離子水將炭化物完全轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中，冷卻后用去離子水定容至250 mL，用濾紙過濾，作為試液。吸取25～50 mL試液于錐形瓶中，加入酚酞指示劑，用0.01 mol/L Na2CO3或0.01 mol/L HAC調(diào)至pH為7，加入鉻酸鉀指示劑0.5 mL，以0.1000 mol/L AgNO3標(biāo)準溶液滴定，直至溶液呈現(xiàn)穩(wěn)定的淡橙色。

菌落總數(shù)的測定：按GB/T 4789.2-2016的規(guī)定操作[5]。

大腸菌群的測定：按GB/T 4789.3-2003的規(guī)定操作[6]。

致病菌(沙門氏菌、志賀氏菌、副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌)檢驗：按GB/T 4789.4-2016、GB/T 4789.5-2012、GB/T 4789.7-2013、GB/T 4789.10-2016的規(guī)定操作[7]。

2.2.10 南極磷蝦調(diào)味粉游離氨基酸測定[8]

準確稱取1.0000 g南極磷蝦調(diào)味粉，加入5 mL、20%的三氯乙酸溶液，均質(zhì)后以三氯乙酸定容至25 mL，用雙層濾紙過濾后取上清液。將上清液于4 ℃、10000 r/min離心20 min，取離心上清液過0.22 μm水膜，采用氨基酸自動分析儀測定。

2.2.11 南極磷蝦調(diào)味粉揮發(fā)性風(fēng)味成分測定[9]

為鑒定南極磷蝦調(diào)味粉的呈味物質(zhì)，采用SPME-GC-MS法對其揮發(fā)性成分進行測定。

精確稱取0.3 g左右的南極磷蝦調(diào)味粉，逐漸以1 mL超純水完全溶解后，50 ℃水浴下用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭萃取25 min，180 ℃解吸6 min。

氣相色譜條件：采用HP-5MS (30 m×0.25 mm×0.25 μm)非極性毛細管柱，升溫程序：初始溫度35 ℃，保持3 min，然后以8 ℃/min的速度升至250 ℃，保持10 min。進樣口溫度180 ℃，不分流；載氣為氦氣，流量1.3 mL/min。

質(zhì)譜條件：電離方式為EI，電子能量70 eV，接口溫度280 ℃，離子源溫度230 ℃，掃描周期2.84 次/s，質(zhì)量掃描范圍(m/z)5。

2.2.12 南極磷蝦調(diào)味粉的感官評價

表1 感官評分標(biāo)準

3 結(jié)果與分析

3.1 二段復(fù)合酶解中固形物含量變化

圖1 二段復(fù)合酶解過程中固形物含量隨酶解時間的變化

由圖1可知，固形物含量隨酶解時間增加而增加。在一段酶解中，進行到150 min時達到最高，但由于其與120 min時的結(jié)果基本持平，綜合成本考慮，確定一段酶解最佳時間為120 min，此時固形物含量為9.629%；二段酶解與一段酶解同理，確定二段酶解最佳時間為180 min，此時固形物含量達到16.126%。

3.2 南極磷蝦調(diào)味粉的基本成分和微生物安全分析結(jié)果

表2 南極磷蝦調(diào)味粉的基本成分

由表2可知，南極磷蝦調(diào)味粉是一種富含蛋白、脂質(zhì)適中、低氟安全的調(diào)味品。

表3 南極磷蝦調(diào)味粉的微生物指標(biāo)

由表3可知，南極磷蝦調(diào)味粉在微生物特征尤其是常見致病菌方面具有良好的安全性。

3.3 南極磷蝦調(diào)味粉的游離氨基酸組成分析結(jié)果

游離氨基酸代表水解物主要的營養(yǎng)成分和風(fēng)味物質(zhì)，其含量及組成直接影響到產(chǎn)品的營養(yǎng)和風(fēng)味[10]。Glu、Gly、Ala和Arg均是蝦類典型的呈味氨基酸，Asp則是南極磷蝦特有的呈味氨基酸。Glu可以增加水解的鮮味，而Gly、Ala、Ser、Thr可以增加水解的甜味。

表4 南極磷蝦調(diào)味粉中游離氨基酸的分析結(jié)果 mg/mL

由表4可知，南極磷蝦調(diào)味粉中 Lys 含量最高，達到4.38 mg/mL，同時富含Glu、Gly、Ala和Arg這些蝦類典型的呈味氨基酸，其中主要呈鮮味的Glu含量達到了2.39 mg/mL，主要呈蝦味的Gly、Ala和Arg分別達到了3.29，2.99，4.86 mg/mL，南極磷蝦特有的呈味氨基酸Asp含量達到了1.45 mg/mL。因此，南極磷蝦調(diào)味粉水溶液中，游離氨基酸種類及含量十分豐富。據(jù)此可知，南極磷蝦調(diào)味粉是一種鮮味和蝦味特征顯著、營養(yǎng)價值高的調(diào)味品。

3.4 南極磷蝦調(diào)味粉揮發(fā)性風(fēng)味成分分析結(jié)果

表5 南極磷蝦調(diào)味粉揮發(fā)性風(fēng)味成分的GC/MS鑒定結(jié)果及其含量

續(xù) 表

由表5可知，能有效測定的南極磷蝦調(diào)味粉的揮發(fā)性呈味成分有32種。其中， 3-呋喃甲醇(含氧化合物)、2-乙?；量?、2,3-二氫-3,5-二羥基-6-甲基-4(H)-吡喃-4-酮(吡啶類及含氮化合物)、5-甲基糠醇(醇類)、苯乙醛、苯甲醛、糠醛(醛類)、十六酸乙酯、9-十六碳烯酸乙酯(酯類)、乙酸(酸類)10種揮發(fā)性成分在南極磷蝦調(diào)味粉的呈味成分中起到?jīng)Q定性作用。3-呋喃甲醇、2-乙酰基吡咯、苯乙醛、苯甲醛、十六酸乙酯、糠醛含量明顯高于其他呈味物質(zhì)，含量分別為46.29，26.54，21.47，20.03，18.62，17.69 μg/100 g。其次是乙酸、9-十六碳烯酸乙酯、2,3-二氫-3,5-二羥基-6-甲基-4(H)-吡喃-4-酮，含量分別為10.75，8.71，8.23 μg/100 g。

3.5 單因素實驗結(jié)合感官評價結(jié)果

表6 復(fù)配調(diào)味單因素實驗結(jié)合感官評價結(jié)果

由表6可知，方案1和方案3由于適口性差，可直接舍去。方案2和方案4感官評價類似，但由于方案2中，南極磷蝦調(diào)味粉基料比重過大，不利于實際生產(chǎn)中成本的控制，綜上所述，可確定方案4為最佳配方。

3.6 南極磷蝦調(diào)味粉感官評價結(jié)果

表7 南極磷蝦調(diào)味粉感官評價結(jié)果

由表7可知，南極磷蝦調(diào)味粉在色澤、滋味與氣味、形態(tài)、雜質(zhì)上均有良好表現(xiàn)，其色澤呈淺黃褐色，滋味鮮香適口、蝦味濃郁，質(zhì)地細膩均勻、不結(jié)塊，無肉眼可見雜質(zhì)，感官評價總分達到95分。因此，南極磷蝦調(diào)味粉是一款感官評價良好的調(diào)味粉。

4 結(jié)論

以冷凍南極磷蝦為原料，結(jié)合傳統(tǒng)調(diào)味粉的制作方法，打破傳統(tǒng)一段酶解的局限，采用高效的二段復(fù)合酶解，綜合單因素實驗與感官評價的結(jié)果，最終確定工藝為：以復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶的蛋白酶組合作為水解用酶，分段水解5 h后，加入還原糖和呈味物質(zhì)，在100 ℃下進行美拉德熱反應(yīng) 6 min，復(fù)配調(diào)味后，噴霧干燥。

通過該工藝可制備出一種低氟含量、磷蝦特征明顯、風(fēng)味濃郁的調(diào)味粉，解決了當(dāng)下南極磷蝦體內(nèi)氟含量高，不能為人所食用的缺陷。同時加入的多種呈味物質(zhì)，凸顯了南極磷蝦獨特的蝦味，并在酶解產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)的前提下，進一步增加了調(diào)味粉的鮮香風(fēng)味；復(fù)配調(diào)味工藝中，多種常見的、低成本調(diào)味用品的加入，大大增強了南極磷蝦調(diào)味粉的適口性，為南極磷蝦的進一步加工利用提供了有力的技術(shù)支持。

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