胡廣偉 廖天安

(海南省人民醫(yī)院口腔科，海南 海口 570311)

口腔癌是一種發(fā)生在嘴唇和口腔內(nèi)的惡性腫瘤，傳統(tǒng)上習(xí)慣將它定義為鱗狀細(xì)胞癌，因?yàn)樵谘揽茖W(xué)的領(lǐng)域，90%的腫瘤組織學(xué)上起源于鱗狀細(xì)胞〔1〕。鱗狀細(xì)胞癌有不同程度的分化及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的傾向。JARID1B，也被稱作PLU-1，是成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤結(jié)合蛋白(RBP)2同系物，是jumonji成員，具有H3K4去甲基化酶活性〔2,3〕，在幾種惡性腫瘤包括膀胱、前列腺、胸腺癌，肺癌等中過(guò)表達(dá)〔4～7〕。JARID1B與腫瘤細(xì)胞遷移、死亡率增加有關(guān)，下調(diào)JARID1B 可誘導(dǎo)細(xì)胞死亡〔8〕。目前，很少研究報(bào)道JARID1B對(duì)人口腔癌細(xì)胞增殖和遷移的作用。本文主要探討JARID1B下調(diào)后對(duì)口腔癌細(xì)胞增殖、遷移及干細(xì)胞樣屬性的影響。

1 材料與方法

1.1主要試劑 RPMI1640培養(yǎng)基(Dulbecco's modified Eagle's medium)，胎牛血清(FBS)，青-鏈霉素，購(gòu)自美國(guó)Invitrogen；anti-JARID1B購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；Oct4A、CD133、Nanog、FOXO1、HIF1alpha和β-actin購(gòu)自CST。

1.2病人篩選和細(xì)胞來(lái)源及培養(yǎng) 80例口腔癌患者，男70例，女10例。年齡30～90歲，研究已通過(guò)倫理審查，患者均簽署知情同意書(shū)。根據(jù)AJCC將病人分為4個(gè)階段：第一階段9例(11.25%)，第二階段22例(27.50%)，第三階段13例(16.25%)，第四階段36例(45.00%)，其中感染部位在頰黏膜36例(45.00%)，舌頭21例(26.25%)，齒齦7例(8.75%)，其他部位16例(20.00%)。在手術(shù)中，分別鉗取距癌灶2 cm的正常黏膜和腫瘤組織，處理后一部分用于病理組織學(xué)觀察，一部分用于Western印跡實(shí)驗(yàn)，還有一部分凍存于-80℃保存待用。

人口腔癌細(xì)胞系SAS細(xì)胞購(gòu)自ATCC(American Type Culture Collection,Manassas,VA,USA)。SAS細(xì)胞在RPMI1640中培養(yǎng)，RPMI1640培養(yǎng)基中含有10% FBS及青-鏈霉素(100 IU/ml)，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3方法

1.3.1shRNA腺病毒感染 包含有JARID1B shRNA的腺病毒從和元生物有限公司獲得。將SAS細(xì)胞接種小皿24 h之后，轉(zhuǎn)染JARID1B shRNA 48 h。JARID1B shRNA靶標(biāo)序列為5'-TTCCACAGCTTGCTGA-GATG-3'。

1.3.2劃痕實(shí)驗(yàn) SAS細(xì)胞與shJARID1B處理的SAS細(xì)胞(分別為SAS Control組，SAS shJARID1B組)分別接種于六孔板中，孵育48 h。然后用200 μl微量吸液管槍頭沿著板中軸在單層細(xì)胞劃痕。用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗掉細(xì)胞殘?jiān)?，新培養(yǎng)基加入六孔板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。檢測(cè)劃痕間隙距離。

1.3.3人工基底膜細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 用Transwell檢測(cè)人工基底膜細(xì)胞侵襲。將SAS Control組細(xì)胞與SAS shJARID1B組的SAS細(xì)胞懸浮于無(wú)血清培養(yǎng)基，接種于Transwell小室上層，下層裝有10%FBS全培養(yǎng)基。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h之后，用棉球擦掉上層沒(méi)有遷移的細(xì)胞，遷移到下層的細(xì)胞用0.1%結(jié)晶紫染色，然后在顯微鏡下計(jì)數(shù)。

1.3.4免疫組化實(shí)驗(yàn) 臨床標(biāo)本在10%甲醛中固定，并且包埋入石蠟之中；將切片脫蠟和水化。免疫組化染色之前，將脫蠟切片放入37℃烘片2 h，用1%H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物5 min，PBS洗3次，免疫染色封閉液封閉1 h，之后用抗JARID1B抗體(1∶200)孵育4℃過(guò)夜。把切片用PBS洗滌，然后用生物素連接的抗血清室溫下孵育1 h。再次洗滌切片，用3,3-二氨基聯(lián)苯胺鹽酸鹽著色1 min。雙蒸水洗滌，蘇木素染色1 min，在顯微鏡下觀察。

1.3.5Western印跡實(shí)驗(yàn) 用細(xì)胞裂解液RIPA(蛋白酶抑制劑∶RIPA為1∶1 000)裂解SAS細(xì)胞與shJARID1B處理的SAS細(xì)胞，制備細(xì)胞裂解產(chǎn)物，離心取上清(組織用勻漿機(jī)勻漿之后，離心去上清)，用BCA工作蛋白定量。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白，之后電轉(zhuǎn)到聚偏氟乙烯(PVDF)膜。5%脫脂牛奶封閉1 h，之后不同一抗孵育過(guò)夜，包括抗JARID1B,Slug,Vimentin,KLF4,Oct4A和 β-actin，TBST洗滌，孵育相應(yīng)的二抗，TBST洗滌，用自動(dòng)顯影儀顯影。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。采用ImageJ軟件及Image Lab軟件對(duì)條帶的灰度值進(jìn)行定量分析。統(tǒng)計(jì)圖用GraphPad Prism5軟件分析。

2 結(jié) 果

2.1JARID1B高表達(dá)于口腔鱗狀細(xì)胞癌組織 JARID1B主要分布于正?？谇簧掀ぜ?xì)胞口腔鱗狀細(xì)胞的核，并且JARID1B在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中的分布顯著多于正常組織。Western實(shí)驗(yàn)也表明JARID1B顯著高表達(dá)于口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中(P<0.01)，見(jiàn)圖1。

圖1 正?？谇火つず涂谇击[狀細(xì)胞癌組織中JARID1B的表達(dá)

2.2JARID1B調(diào)節(jié)SAS細(xì)胞侵襲增殖能力 Western印跡實(shí)驗(yàn)顯示，轉(zhuǎn)染shJARID1B腺病毒可沉默JARID1B在細(xì)胞中的表達(dá)，見(jiàn)圖2。人工基底膜實(shí)驗(yàn)表明下調(diào)JARID1B顯著抑制SAS細(xì)胞侵襲能力(P<0.01)，見(jiàn)圖3。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明SAS shJARID1B細(xì)胞劃痕相對(duì)距離顯著少于SAS Control細(xì)胞，沉默JARID1B可以抑制SAS細(xì)胞遷移(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

2.3JARID1B調(diào)節(jié)SAS細(xì)胞多功能性及致癌性 沉默JARID1B顯著抑制Oct4、Nanog、CD133、FOXO1及HIF1alpha表達(dá)(P<0.001)。見(jiàn)圖5。

圖2 Western印跡檢測(cè)JARID1B的表達(dá)

圖3 人工基底膜實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力

圖4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

圖5 沉默JARID1B抑制SAS細(xì)胞多能性及致癌因子

3 討 論

口腔鱗狀細(xì)胞癌具有干細(xì)胞特質(zhì)，容易對(duì)藥物以及輻射產(chǎn)生抵抗〔9～11〕。因此，針對(duì)腫瘤干細(xì)胞特異性靶標(biāo)獲得了很大的關(guān)注，這也成為強(qiáng)有效的抗腫瘤治療策略〔12〕。JARID1B屬于組蛋白賴氨酸脫甲基酶家族，能夠特異性H3K4的靶基因脫甲基〔13〕。

本文中，Western印跡和免疫組化實(shí)驗(yàn)表明JARID1B在口腔鱗狀細(xì)胞癌病人過(guò)表達(dá)，所以JARID1B可能是口腔鱗狀細(xì)胞癌重要的預(yù)后因素。JARID1B表達(dá)與口腔癌細(xì)胞生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)有關(guān)，并且與干細(xì)胞標(biāo)志物蛋白表達(dá)呈正比，如Oct4、Nanog、CD133、FOXO1及HIF1alpha。這些表明JARID1B可能是新型的口腔鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)志物。本研究與之前報(bào)道相符，Stewart等〔14〕發(fā)現(xiàn)其高表達(dá)于急性髓性白血病，敲除JARID1B可中和造血干細(xì)胞自我更新的能力，從而說(shuō)明JARID1B正性調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞能力。

本文從蛋白水平證明，在口腔鱗狀細(xì)胞癌中JARID1B與多能標(biāo)志物(Oct4、CD113等)有關(guān)。證明JARID1B是惡性口腔鱗狀細(xì)胞癌有潛力的標(biāo)志物，也證明JARID1B致腫瘤功能是通過(guò)促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞樣活性及而促進(jìn)細(xì)胞侵襲、遷移。

本研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充了對(duì)于頭頸部腫瘤生物學(xué)組蛋白脫甲基的認(rèn)知，提供了潛在的新型的治療惡性口腔鱗狀細(xì)胞癌的靶標(biāo)。

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