馮曉靜 劉 娟 段少華 朱 靜 王曉利

(承德市中心醫(yī)院醫(yī)院感染管理科，河北 承德 067000)

耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌多見于醫(yī)院獲得性感染，老年人因免疫力下降屬于易感人群，治療預(yù)后很差〔1〕。該領(lǐng)域研究者已報(bào)道，在無(wú)肝膽病史患者中發(fā)現(xiàn)了肺炎克雷伯菌性肝膿腫，并發(fā)生轉(zhuǎn)移感染，因該類菌株的生物學(xué)特性和致病能力與普通肺炎克雷伯菌存在差異，因此定義為高毒力肺炎克雷伯菌〔2〕。肺炎克雷伯菌毒力增強(qiáng)與莢膜多糖、毒力基因有關(guān)，包含78種以上的莢膜血清型，毒力最強(qiáng)的為K1、K2，是毒力決定元素〔3〕。目前對(duì)多重耐藥的高毒力肺炎克雷伯菌研究較少，特別是耐碳青霉烯的高毒力肺炎克雷伯菌。相關(guān)研究顯示，碳青霉烯酶Kpc基因轉(zhuǎn)入K2莢膜型肺炎克雷伯菌后對(duì)碳青霉烯類藥物耐藥〔4〕。本研究旨在探討老年患者中分離的18株耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的耐藥機(jī)制和毒力基因情況。

1 材料與方法

1.1材料 收集2016年1月至2017年3月承德市中心醫(yī)院收治的老年患者中分離出的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌18株，剔除同一患者相同部位的重復(fù)樣本，男11例，女7例；樣本類型：痰液8份，血液、尿液、導(dǎo)管各2份，膽汁、咽拭子、肺泡灌洗液、傷口分泌物各1份。

1.2菌株鑒定和藥敏試驗(yàn) 常規(guī)行細(xì)菌接種培養(yǎng)純化后，使用Phoenix 100全自動(dòng)微生物鑒定儀對(duì)菌株進(jìn)行鑒定；采用K-B法檢測(cè)美羅培南、頭孢哌酮-舒巴坦藥敏，MTS法測(cè)定替加環(huán)素藥敏，碳青霉烯藥敏采用亞胺培南紙片復(fù)篩。

1.3碳青霉烯酶表型試驗(yàn) (1)改良Hodge試驗(yàn)：配置大腸埃希氏菌NCTC12900懸液，培養(yǎng)液10倍稀釋后接種到M-H瓊脂平皿，干燥后加入美羅培南紙片，取4～5個(gè)待測(cè)菌落接種到紙片邊緣，35℃孵育18～20 h后觀察。(2)EDTA協(xié)同試驗(yàn)：將待測(cè)菌懸液涂于M-H平皿上，干燥后貼亞胺培南紙片，取其中一張滴加20 μl 1.0 mmol/L的乙二胺四乙酸溶液，第二張不滴加任何試劑，在35℃環(huán)境中靜置22～24 h，測(cè)量紙片間的抑菌環(huán)差值，>5 mm為陽(yáng)性。(3)Carba NP試驗(yàn)：依據(jù)2016年美國(guó)臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)制定的藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)產(chǎn)碳青霉烯酶情況，并進(jìn)行分類。

1.4毒力表型試驗(yàn) (1)拉絲試驗(yàn)：待測(cè)菌株接種到血清瓊脂平板，在27℃環(huán)境中靜置24 h后，用接種環(huán)挑取菌種在培養(yǎng)基上劃線，當(dāng)黏液絲長(zhǎng)度≥5 mm為陽(yáng)性。(2)生物被膜形成試驗(yàn)：調(diào)整肺炎克雷伯菌濃度為1×106CFU/ml，96孔板中每孔分別加入100 μl菌液，常規(guī)孵育24 h，每孔加入30 μl結(jié)晶紫，混勻后孵育20 min，洗滌后上酶標(biāo)儀讀取590 nm處吸光度，OD值>0.5為高產(chǎn)生物被膜，0.1～0.5為中產(chǎn)生物被膜，<0.1為低產(chǎn)生物被膜。(3)血清殺傷敏感性試驗(yàn)：吸取1×106CFU/ml 30 μl菌液加入80 μl健康體檢者2 ml血清中，分別于0、60、120、180 min移去一半細(xì)菌懸液，MH肉湯稀釋10倍，20 μl接種到MH平板，孵育20～24 h后判讀結(jié)果。

1.5耐藥基因、高毒力莢膜血清型及基因檢測(cè) PCR檢測(cè)耐藥基因分布情況，包括碳青霉烯基因(Kpc、Imp、Vim等)、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因(Tem、Shv、Ctx-M)、AmpC酶基因(DHA)，膜孔蛋白編碼基因(Ompk35、36)。高毒力莢膜血清型(K1、K2、K5等)；毒力基因(rmpA、Acrobactin、FimH-1)。操作步驟：煮沸法制備菌株DNA模板，PCR引物序列由北京天恩澤生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。反應(yīng)體系20 μl：dNTP 2 μl、Taq DNA聚合酶3 μl、10×Buffer 3 μl、上下游引物各1 μl、cDNA 1 μl、雙蒸餾水9 μl。反應(yīng)條件：94℃ 2 min、94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 45 s，共40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后分析各條帶。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS19.0軟件行χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1碳青霉烯酶表型試驗(yàn)結(jié)果 18株耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌中改良Hodge試驗(yàn)陽(yáng)性9株，弱陽(yáng)性1株，見圖1A；EDTA協(xié)同試驗(yàn)陽(yáng)性10株，見圖1B；18株Carba NP試驗(yàn)均為產(chǎn)酶菌，A類酶10株，同時(shí)產(chǎn)A類、B類或D類酶8株。

2.2耐藥基因和膜孔蛋白檢測(cè)結(jié)果 Kpc、Ndm、Tem、Shv、Ctx-M、Dha基因在相應(yīng)的位置均出現(xiàn)條帶，但I(xiàn)mp、Sim、Vim、Oxa-48基因未出現(xiàn)條帶。18株耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌中碳青霉烯酶檢出Kpc基因6株(33.33%)，Ndm基因7株(38.89%)；超廣譜β-內(nèi)酰胺酶中Shv檢出15株(83.33%)，明顯高于Ctx-M基因10株(55.56%)、Tem基因7株(38.89%)(P<0.01)；AmpC酶中檢出DHA基因2株(11.11%)；見圖2。膜孔蛋白基因PCR電泳顯示，Ompk35編碼基因缺失7株(38.89%)，Ompk36缺失10株(55.56%)，Ompk36編碼基因缺失率明顯高于Ompk35(P<0.05)；且當(dāng)Ompk35基因缺失時(shí)Ompk36也缺失；見圖3。

A:M-H平皿中心為美羅培南紙片，1為肺炎克雷伯菌陽(yáng)性對(duì)照，2為陰性對(duì)照，3為該院內(nèi)分離得到的產(chǎn)碳青霉烯肺炎克雷伯菌，4為碳青霉烯酶陰性肺炎克雷伯菌；B:M-H平皿上的兩張亞胺培南紙片圖1 耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶表型試驗(yàn)

圖2 耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌耐藥基因PCR電泳圖

圖3 膜孔蛋白編碼基因PCR電泳圖

2.3毒力表型試驗(yàn)結(jié)果 拉絲試驗(yàn)顯示，18株耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌中陽(yáng)性2株；生物被膜形成試驗(yàn)顯示，高、中、低產(chǎn)生物被膜分別檢出6株、5株、7株；血清殺傷敏感性試驗(yàn)顯示，抵抗、中介敏感、高敏感分別為5株、5株、8株。

2.4高毒力莢膜血清型及毒力基因檢出情況 18株耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌進(jìn)行莢膜分型顯示，K1型4株，K57型2株，未檢出K2、5、20及54，未分型12株。rmpA陽(yáng)性7株(38.89%)、Acrobactin陽(yáng)性4株(22.22%)、二者同時(shí)陽(yáng)性7株(38.89%)，rmpA陽(yáng)性率明顯高于Acrobactin(P<0.05)；4株K1型肺炎克雷伯菌均攜帶rmpA基因，其中1株同時(shí)攜帶Acrobactin基因；2株K57型肺炎克雷伯菌均攜帶rmpA基因；18株耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌均攜帶FimH-1基因。見圖4。

圖4 耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌高毒力莢膜血清型及毒力基因PCR電泳圖

2.5毒力表型試驗(yàn)與高毒力莢膜血清型及毒力基因的關(guān)系 拉絲試驗(yàn)呈陽(yáng)性的2株均未檢出高毒力莢膜血清型，K1和K57型的6株拉絲試驗(yàn)為陰性。4株K1型中1株血清殺傷作用抵抗，高產(chǎn)生物被膜；3株血清殺傷作用高敏感，低產(chǎn)生物被膜。2株K57型均對(duì)血清殺傷作用中間抵抗，中產(chǎn)生生物被膜。

2.6耐藥基因與高毒力莢膜血清型及毒力基因的關(guān)系 7株攜帶rmpA基因的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌株均產(chǎn)碳青霉烯酶，其中4株產(chǎn)Kpc、2株產(chǎn)Ndm，1株同時(shí)產(chǎn)Kpc和Ndm，均合并膜孔蛋白變異。4株攜帶Acrobactin基因的菌株中3株產(chǎn)碳青霉烯酶，其中2株產(chǎn)Kpc、1株產(chǎn)Ndm，均合并膜孔蛋白變異。

3 討 論

肺炎克雷伯菌是醫(yī)院及社區(qū)獲得性感染的重要條件致病菌，機(jī)體免疫力下降的老年人群?？梢l(fā)呼吸道、泌尿道感染，甚至導(dǎo)致敗血癥。碳青霉烯類抗菌藥物是目前臨床治療肺炎克雷伯菌的一線藥物，但近年來(lái)耐藥性逐漸增加，耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的治療預(yù)后很差，特別是老年患者。研究發(fā)現(xiàn)碳青霉烯類耐藥機(jī)制可能包括攜帶多種碳青霉烯酶，分泌超廣譜β-內(nèi)酰胺酶或AmpC酶合并外膜孔蛋白變異，藥物作用靶位點(diǎn)改變〔5〕。Kpc基因是我國(guó)近年來(lái)流行的碳青霉烯酶，Ndm基因自發(fā)現(xiàn)起已在全球范圍內(nèi)廣泛傳播〔6〕。本次研究18株耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌株中均產(chǎn)碳青霉烯，提示碳青霉烯酶是承德市中心醫(yī)院老年患者中肺炎克雷伯菌耐藥的主要因素之一。

肺炎克雷伯菌分泌超廣譜β-內(nèi)酰胺酶或AmpC酶合并膜孔蛋白編碼基因變異時(shí)，會(huì)引發(fā)厄他培南耐藥，提升亞胺培南的MIC值〔7〕。本次研究中發(fā)現(xiàn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶或合并膜孔蛋白變異的菌株出現(xiàn)耐藥，還發(fā)現(xiàn)Ompk36在肺炎克雷伯菌株對(duì)碳青霉烯耐藥中發(fā)揮重要作用。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，K1、K2、K5莢膜型以及rmpA、Acrobactin等毒力相關(guān)基因表達(dá)水平與肺炎克雷伯菌毒力存在明顯關(guān)聯(lián)〔8〕。本次研究中成功分離出4株K1型菌株，分離率較高，且均攜帶rmpA基因，1株同時(shí)攜帶Acrobactin基因。此外還檢出2株菌株，均攜帶rmpA基因。rmpA基因可調(diào)控莢膜合成，Acrobactin基因是肺炎克雷伯菌中主要鐵載體細(xì)胞，上述兩種基因是除莢膜型之外毒力最常見的決定元素。研究者已從耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌株中檢出產(chǎn)Kpc基因的高毒力莢膜血清型菌株〔9〕。本次研究從18株菌株中檢出產(chǎn)Kpc基因6株，高毒力莢膜型菌株4株；相關(guān)研究顯示，K1-Hvkp可獲得攜帶Kpc基因的質(zhì)粒，產(chǎn)生高耐藥、高毒力的菌株〔10〕。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可推測(cè)高毒力菌株與碳青霉烯類耐藥存在關(guān)聯(lián)。

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