■魏 晨郭永鵬計 成 趙麗紅*

(1.伊犁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆伊寧835000；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院動物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193)

科技的進(jìn)步推動了農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)的發(fā)展，人們的生活水平得到改善和提高，促使人們對畜產(chǎn)品和食品的質(zhì)量和安全更加關(guān)注。飼料霉菌毒素污染在很大程度上威脅畜禽生產(chǎn)和人類食品安全。美國飼料年報2002年將霉菌毒素列為僅次于二噁英的對人類食物鏈造成嚴(yán)重威脅的因素。在已被發(fā)現(xiàn)的300多種霉菌毒素中，黃曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）被認(rèn)為是毒性最大的霉菌毒素之一。AFT是一類主要由黃曲霉（Aspergillus flavus）、寄生曲霉（A.parasiticus）、特異曲霉（A.nomius）和假溜曲霉（A.pseudotamarii）等霉菌產(chǎn)生的有毒的次級代謝產(chǎn)物。AFT屬于二呋喃氧雜萘鄰?fù)难苌?，目前已分離鑒定出20余種異構(gòu)體，包括黃曲霉毒素B1（AFB1）、B2、G1、G2、B2a、G2a、M1、M2、P1等，分子量范圍為312～346，在各類毒素中以AFB1的毒性和致癌性最強(qiáng)，其毒性是砒霜的68倍、氰化鉀的100倍，致癌作用比已知的化學(xué)致癌物都強(qiáng)，比二甲基亞硝胺強(qiáng)75倍[1]。2011年眉山一奶牛公司的純牛奶被檢出致癌物黃曲霉毒素M1（AFM1），國家規(guī)定奶中AFM1最高值為0.5 μg/kg，被檢牛奶中AFM1實(shí)測值為1.2 μg/kg，超標(biāo)1.4倍。福建長富純牛奶（精品奶）也被檢出AFM1不合格，較標(biāo)準(zhǔn)超標(biāo)80%。2012年南山奶粉5批次被檢出含強(qiáng)致癌物AFM1。反芻動物奶牛對AFB1十分敏感，當(dāng)日糧AFB1含量超過30 μg/kg時，乳汁中AFM1的含量就會達(dá)到我國的安全限量（0.5 μg/kg）；當(dāng)日糧中AFB1含量超過3 μg/kg時，乳汁中AFM1的含量就會達(dá)到歐盟的安全限量（0.05 μg/kg）。AFB1被奶牛攝入后，會抑制奶牛的免疫力，影響牛對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，從而造成牛的營養(yǎng)不良，導(dǎo)致繁殖障礙、抵抗力下降和發(fā)病率提高。反芻動物肝臟中的酶可以將AFB1生物轉(zhuǎn)化成AFM1，生成的AFM1轉(zhuǎn)移到牛奶中，威脅人類食品安全。因此，掌握奶牛飼料中霉菌毒素的污染狀況，并采取相應(yīng)的毒素消減措施，可維持牛群正常健康生長，提高牛的產(chǎn)奶量和增強(qiáng)機(jī)體免疫機(jī)能。霉菌毒素傳統(tǒng)的物理、化學(xué)去毒方法存在諸多應(yīng)用缺陷，因此，微生物或酶的生物降解作為一種安全、高效、環(huán)保的方法，是未來飼料霉菌毒素消減領(lǐng)域最切實(shí)可行的技術(shù)手段。

1 青貯飼料霉菌毒素污染現(xiàn)狀

青貯飼料是奶牛的主要飼料來源，其飼用安全問題日益受到人們的關(guān)注。青貯飼料常受到黃曲霉毒素（AFT）、玉米赤霉烯酮（ZEN）、嘔吐毒素（DON）、T-2毒素、赭曲霉毒素A和煙曲霉毒素的污染。這些霉菌毒素通常在有氧情況下產(chǎn)生，制作青貯飼料時如果原料未填壓實(shí)，青貯飼料在開窖接觸空氣后，好氧性霉菌非常容易繁殖，從而使青貯飼料容易受到霉菌毒素污染。孫國君等[2]研究表明，青貯飼料中AFT、DON和ZEN含量與季節(jié)交替變換有一定關(guān)系，夏季顯著高于秋季。1988年美國明尼蘇達(dá)州對采集的631個玉米樣品進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)有34個樣品的AFT含量大于20 μg/kg，最高濃度可達(dá)423 μg/kg，該州青貯玉米的AFT含量達(dá)80～100 μg/kg。2007年，澳大利亞對玉米青貯樣本進(jìn)行霉菌毒素檢測分析，結(jié)果表明92.5%的玉米青貯受到DON污染，最大含量為5 815 μg/kg，81.3%的玉米青貯受到ZEN污染，最高含量為1 043 μg/kg[3]。敖志剛等（2008）[4]對中國飼料及飼料原料的霉菌毒素污染情況進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)奶牛全混合日糧污染AFT也非常嚴(yán)重，在被檢的全混合日糧中，AFT的檢出率為100%，平均含量達(dá)到了5.95 μg/kg，沒有超過我國奶牛日糧AFT的限量值；但是如果按歐盟奶中AFM1限量規(guī)定（0.05 μg/kg），這個水平的日糧AFB1對奶牛有一定的風(fēng)險，可能會導(dǎo)致奶中AFM1含量超過0.05 μg/kg。周建川等（2016）[5]測定了國內(nèi)各省(市)區(qū)域的玉米、玉米副產(chǎn)物、小麥及麩皮、粕類和全價飼料等1 304個樣品霉菌毒素含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，玉米、玉米副產(chǎn)物、小麥及麩皮、粕類和全價料中AFB1檢出率非常高，在這些飼料或飼料原料中AFB1的檢出率分別為92.14%、91.48%、66.23%、97.53%和83.06%，超標(biāo)率分別為31.94%、25.00%、7.79%、81.48%和11.29%；ZEN的檢出率分別為79.93%、95.45%、76.62%、72.84%和88.98%，超標(biāo)率分別達(dá)到4.35%、58.52%、10.39%、18.52%和7.26%；DON的檢出率分別為96.49%、96.59%、100.00%、74.07%和90.32%，超標(biāo)率分別達(dá)到51.17%、82.39%、83.12%、3.70%和42.20%。其中玉米副產(chǎn)物和小麥及麩皮是霉菌毒素污染最為嚴(yán)重的飼料原料，是霉菌毒素風(fēng)險控制的主要關(guān)注對象。

2 黃曲霉毒素對反芻動物的危害

反芻動物的急性黃曲霉毒素中毒癥主要包括采食量下降、泌乳量驟降、體重減輕和肝臟損害等。自然條件下，反芻動物如果發(fā)生黃曲霉毒素慢性中毒，持續(xù)時間則較長，通常伴有飼料轉(zhuǎn)化效率降低、免疫功能抑制、繁殖性能下降等癥狀，這種持續(xù)性的、長時間的慢性中毒現(xiàn)象給養(yǎng)殖者造成的經(jīng)濟(jì)損失可能比急性中毒所造成的損失要大。比如奶牛長期采食高劑量黃曲霉毒素（AFT含量達(dá)到100 μg/kg）的玉米，不但奶中AFM1含量超標(biāo)，還會出現(xiàn)腹瀉、急性乳房炎、呼吸系統(tǒng)失調(diào)、直腸脫垂、脫毛，所產(chǎn)的犢牛小而不健康等癥狀。飼料黃曲霉毒素對反芻動物的采食量影響不明顯，相關(guān)文獻(xiàn)報道育肥牛日糧中AFT含量在300 μg/kg時，其采食量一般不會受到影響，如果日糧中AFT含量達(dá)到600 μg/kg時，牛的采食量呈顯著降低[6]。

人們關(guān)注黃曲霉毒素對奶牛危害的同時也非常關(guān)注牛奶的質(zhì)量安全。奶牛黃曲霉毒素中毒的另一大特點(diǎn)是黃曲霉毒素B1在肝臟中被羥化為黃曲霉毒素M1和黃曲霉毒素M2后分泌到乳中[7]，不但危害犢牛，同時造成動物性食品的污染，危及人類健康。奶牛采食被AFT污染的飼料2 d后，乳中出現(xiàn)AFM1，但停喂4 d后，乳中AFM1就會消失[8]。日糧AFB1向牛奶中轉(zhuǎn)化AFM1的效率大約為1%～2%，造成轉(zhuǎn)化效率不同的因素很多，包括個體的健康狀況、肝臟功能、個體消化率、日糧中AFB1的含量，以及飼料原料種類等。有試驗(yàn)證明，高產(chǎn)母牛由于飼料采食量大，食入的AFB1多，其轉(zhuǎn)化成AFM1的效率高達(dá)6%[9]。

鑒于AFM1的高致癌性，很多國家都設(shè)定了牛奶中AFM1的限量值。我國及美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）規(guī)定，牛奶中AFM1的最高限量為0.5 μg/kg；歐盟規(guī)定牛奶中黃曲霉毒素M1的最高限量為0.05 μg/kg。

3 反芻動物黃曲霉毒素去毒方法研究進(jìn)展

飼料霉菌毒素傳統(tǒng)的去毒方法包括物理和化學(xué)方法。其中，物理去毒方法包括合格原料稀釋法、研磨法、密度篩選法等。合格原料稀釋法可以減輕動物的中毒癥狀，但使毒素的污染范圍加大，威脅到更多動物的健康和畜禽產(chǎn)品的安全；研磨、密度篩選等方法的生產(chǎn)效率較低、能耗較大?；瘜W(xué)方法主要有堿處理、氧化處理，化學(xué)物質(zhì)降解等方法。堿處理、氧化處理導(dǎo)致飼料的感官品質(zhì)變差，飼料的營養(yǎng)價值大幅度降低，且化學(xué)品的殘留問題無法有效而經(jīng)濟(jì)地解決，多數(shù)不實(shí)用，存在潛在的危險。目前在實(shí)際生產(chǎn)中，反芻動物飼料黃曲霉毒素消減技術(shù)主要有兩種，一種是在飼料中添加霉菌毒素吸附劑，對日糧中的AFT進(jìn)行物理性吸附，另一種是在日糧中添加霉菌毒素生物降解劑，在反芻動物的瘤胃或腸道中，通過微生物或酶的作用對黃曲霉毒素進(jìn)行生物降解，從而徹底消除毒素。

常用的霉菌毒素吸附劑主要有硅藻土、蒙脫石、膨潤土、黏土等無機(jī)吸附劑和酵母細(xì)胞壁提取物、酯化甘露聚糖等有機(jī)吸附劑。在日糧中添加霉菌毒素吸附劑屬于物理去毒，這種方法有其應(yīng)用上的弊端。比如：黏土類吸附劑在吸附AFB1的同時還吸附飼料中的維生素和微量元素；吸附劑和毒素結(jié)合形成的復(fù)合體在胃腸道環(huán)境中不穩(wěn)定，毒素可在瘤胃或小腸末端釋放，導(dǎo)致毒素局部聚集，使胃腸黏膜受到損傷，進(jìn)而影響營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用；生物學(xué)效價偏低，蒙脫石用于奶牛飼料AFT吸附劑時添加量需要達(dá)到全混合日糧（TMR）干物質(zhì)含量的1%；吸附劑結(jié)合的霉菌毒素會隨糞便排出，對環(huán)境造成二次污染。

動物試驗(yàn)證實(shí)，國內(nèi)外一些吸附劑產(chǎn)品對單胃動物飼料中的AFT有一定的吸附效果，一定程度上可改善動物的生產(chǎn)性能，緩解毒素中毒癥狀。但是，吸附劑應(yīng)用在反芻動物日糧中卻沒有起到很好的去毒效果，吸附劑不能有效降低奶中AFM1的殘留。Firmin等（2011）[10]研究結(jié)果表明，在AFB1污染的奶牛日糧中添加酵母細(xì)胞壁，可以降低奶牛消化道對AFB1的吸收，增加糞中AFB1和AFM1的排出，但對降低飼料中AFB1向奶中AFM1的轉(zhuǎn)化沒有顯著影響。Ogunade等（2016）[11]研究霉菌毒素吸附劑對采食AFB1污染日糧奶牛奶中AFM1的濃度、生產(chǎn)性能和免疫指標(biāo)的影響，結(jié)果表明在攻毒期吸附劑并沒有顯著降低奶中AFM1濃度；在清除期，奶中AFM1的濃度降低到FDA規(guī)定的限量值所需的時間，吸附劑組低于對照組（24 h vs 48 h）。吸附劑對反芻動物不能很好發(fā)揮效果的原因在于，反芻動物瘤胃內(nèi)容物含水量大約為84%～94%，全消化道中67%的內(nèi)容物在瘤胃中。消化道食糜在瘤胃內(nèi)停留時間大約為20～48 h，相當(dāng)于整個消化過程的一半時間，因此，瘤胃中被吸附劑吸附的黃曲霉毒素又會被解吸附下來。瘤胃有吸收小分子有機(jī)化合物的功能，且瘤胃內(nèi)的水有較強(qiáng)的張力，加上瘤胃蠕動，會競爭被吸附的黃曲霉毒素，使游離的黃曲霉毒素又會被瘤胃壁吸收。

4 生物降解技術(shù)在反芻動物生產(chǎn)上的應(yīng)用前景

物理和化學(xué)去毒方法存在諸多應(yīng)用上的弊端，而不能被廣泛應(yīng)用到飼料霉菌毒素的脫毒實(shí)踐中。近20年來，霉菌毒素生物降解技術(shù)備受研究者的關(guān)注，生物降解是指霉菌毒素被微生物、植物及其代謝產(chǎn)生的酶作用，毒素分子結(jié)構(gòu)中的毒性基團(tuán)被破壞，生成無毒代謝產(chǎn)物的過程[12]。生物降解的優(yōu)勢在于：解毒效率高、特異性強(qiáng)、本身是蛋白質(zhì)，不影響飼料的適口性，可以循環(huán)利用；對維生素、微量元素等小分子有機(jī)化合物沒有吸附作用，不影響飼料的營養(yǎng)價值；降解產(chǎn)物無毒無害，排出體外不會對環(huán)境造成污染；一些微生物本身是有益微生物，具有促生長作用，可增強(qiáng)動物免疫力，可同時用作益生菌。

4.1 降解黃曲霉毒素的微生物

一些研究者認(rèn)為日糧中的黃曲霉毒素在反芻動物瘤胃中能被部分微生物降解，降解產(chǎn)物主要為黃曲霉毒素醇。Smiley等（2000）[13]報道橙色黃桿菌（F.au?rantiacum）發(fā)酵液中的粗蛋白提取物可以降解AFB1，降解率達(dá)到74.5%，而用熱處理粗蛋白會降低對毒素的降解效率（對AFB1的降解率降到5.5%），說明降解AFB1的物質(zhì)可能是一種對熱敏感的酶。Teniola等（2005）[14]報道一株分支桿菌（M.fluoranthenivorans）可以有效降解AFB1，其胞外提取物與AFB1混合反應(yīng)4 h，90%的AFB1可被降解。Alberts等（2006）[15]對紅串紅球菌（R.erythropolis）降解AFB1進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵液中的胞外代謝物與AFB1反應(yīng)72 h，可以降解66.8%的AFB1。Zhao等（2011）[16]研究發(fā)現(xiàn)一株橙紅色粘球菌（Myxococcus fulvus）ANSM068可高效降解AFB1，試驗(yàn)進(jìn)一步確定降解活性物質(zhì)是一種細(xì)菌所產(chǎn)胞外酶。Gao等（2011）[17]從魚腸道分離出一株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）ANSB060，其發(fā)酵液在72 h內(nèi)對AFB1、AFG1和AFM1的降解率分別達(dá)到81.5%、80.7%和60.0%，該株菌同時具有較強(qiáng)的益生性和抗逆性，能夠抵抗胃酸和膽鹽，對大腸桿菌、沙門氏菌以及金黃色葡萄球菌有顯著的抑制作用。

反芻動物的瘤胃內(nèi)定植大量的微生物，是天然的發(fā)酵罐。具有降解黃曲霉毒素能力的微生物在瘤胃內(nèi)如果正常增殖，會產(chǎn)生具有降解毒素的酶類或者蛋白質(zhì)，酶與毒素結(jié)合，勢必發(fā)揮其降解毒素的功效，從而減少瘤胃內(nèi)毒素的量，降低毒素對反芻動物的危害。

4.2 降解黃曲霉毒素的蛋白及酶

Motomura等（2003）[18]從真菌糙皮側(cè)耳（Pleurotus ostreatus）的代謝產(chǎn)物中分離純化出一種胞外酶，其分子量為90 kDa，該酶具有降解黃曲霉毒素的功能，熒光檢測認(rèn)為其作用機(jī)制為酶可以斷裂黃曲霉毒素的內(nèi)酯環(huán)。暨南大學(xué)微生物研究組從真菌假蜜環(huán)菌（Armillariella tabescens）的細(xì)胞中提取到一種降解AFB1的酶，其粗酶液與AFB1反應(yīng)，可以降解80%的AFB1，同時，對假蜜環(huán)菌黃曲霉毒素降解酶（ADTZ）進(jìn)行分離純化，獲得分子量為73～77 kDa的酶蛋白[19]。左振宇等（2007）[20]根據(jù)畢赤酵母密碼子的偏好性，對來源于假蜜環(huán)菌的黃曲霉毒素解毒酶ADTZ基因進(jìn)行優(yōu)化，構(gòu)建重組質(zhì)粒pNOA，轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115中，實(shí)現(xiàn)了密碼子優(yōu)化的rADTZ組成型分泌表達(dá)。Taylor等（2010）[21]報道了一種結(jié)核分支桿菌（M.smeg?matis），可以產(chǎn)生降解黃曲霉毒素的酶，這種酶屬于F420H2依賴的還原酶（FDR-A和-B）家族。Zhao等（2011）[16]用離子交換和分子篩層析方法，分離純化出一種降解黃曲霉毒素的粘細(xì)菌黃曲霉毒素降解酶（MADE），分子量約為32 kDa，該酶可同時高效降解溶液中的AFB1、G1以及M1。Alberts等（2009）[22]將來源于白腐真菌（T.versicolor）的漆酶基因在黑曲霉中重組表達(dá)，重組漆酶（118 U/l）對AFB1的降解率為55%。

4.3 降解黃曲霉毒素的微生態(tài)制劑

由于各種局限性，目前很少有黃曲霉毒素降解酶制劑在實(shí)際生產(chǎn)中推廣應(yīng)用的報道，只發(fā)現(xiàn)有黃曲霉毒素生物降解型微生態(tài)制劑的研究和應(yīng)用報道。Ma等（2012）[23]研究表明，降解黃曲霉毒素的微生態(tài)制劑（主要成分枯草芽孢桿菌ANSB060）可顯著改善攝入黃曲霉毒素蛋雞的產(chǎn)蛋性能、蛋品質(zhì)以及肝臟和血液生化指標(biāo)，緩解毒素對組織器官的損傷。肉雞飼養(yǎng)試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，降解黃曲霉毒素的微生態(tài)制劑（主要成分枯草芽孢桿菌ANSB060）可顯著改善攝入黃曲霉毒素肉雞的生長性能、肉品質(zhì)、血清生化指標(biāo)和抗氧化能力，減少十二指腸食糜和肝臟中黃曲霉毒素的殘留量，緩解毒素對肝臟的損傷[24-25]。奶牛試驗(yàn)結(jié)果表明，采食不含AFB1日糧的奶牛乳中沒有AFM1的殘留；采食含有黃曲霉毒素（AFB1=63 μg/kg）日糧的奶牛，第 4 d時乳中AFM1殘留量達(dá)到0.66 μg/kg；日糧中添加降解黃曲霉毒素的微生態(tài)制劑后，能夠有效減少乳中AFM1的殘留，使乳中AFM1殘留量降低到國家標(biāo)準(zhǔn)以下（未發(fā)表）。

5 結(jié)語

霉菌毒素生物降解是目前飼料工業(yè)及養(yǎng)殖行業(yè)備受關(guān)注的話題之一。一些微生物菌株，雖然具有較高的降解黃曲霉毒素活性，但不能直接應(yīng)用于食品或飼料中；從野生菌株中分離純化酶，不具有實(shí)際應(yīng)用價值，因?yàn)槲⑸锩傅姆蛛x純化過程復(fù)雜、野生菌株所產(chǎn)酶量低、活性不高，穩(wěn)定性差，很難直接進(jìn)行規(guī)模化發(fā)酵生產(chǎn)。因此，應(yīng)用現(xiàn)代分子生物學(xué)方法及基因工程手段，挖掘新的降解酶基因，并對活性高的降解酶進(jìn)行外源高效表達(dá)和產(chǎn)酶條件優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)降解酶的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用，是黃曲霉毒素生物降解未來發(fā)展的重要方向。只有真正靶到活性高、特異性強(qiáng)的酶，且能實(shí)現(xiàn)酶的高效表達(dá)，才能推動該技術(shù)在飼料和養(yǎng)殖領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。