■胡振華 楊永平 楊 宇 葉勝強(qiáng) 王麗霞 鄧 兵 陳 星 龔 萍*

（1.武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，湖北武漢430208；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢430070；3.武漢市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，湖北武漢430016）

隨著我國經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，人們生活水平的大幅提高，食品安全、生活環(huán)境等話題已成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。曾在動(dòng)物的生長發(fā)育、飼料轉(zhuǎn)化率、動(dòng)物疫病防控等方面具有顯著效果的抗生素，其過量、長期及違規(guī)使用引起的細(xì)菌耐藥性和獸藥殘留問題[1-2]，也越來越受到人們的重視。尋找抗生素替代品用于預(yù)防疾病和促進(jìn)動(dòng)物生長成為世界范圍內(nèi)研究的熱點(diǎn)。其中，益生菌通過改善動(dòng)物胃腸道微生態(tài)平衡進(jìn)而促進(jìn)動(dòng)物健康生長，是飼用抗生素替代品的理想選擇之一。益生菌主要通過與腸道微生物之間、與宿主之間的相互作用而發(fā)揮作用[3]。益生菌可直接飼喂動(dòng)物，在數(shù)量及種類上彌補(bǔ)腸道內(nèi)減少或缺乏的有益菌群，促進(jìn)腸道內(nèi)乳酸菌等有益菌群的增殖，抑制大腸桿菌等致病菌的生長[4]，調(diào)整腸道微生態(tài)平衡，增強(qiáng)機(jī)體免疫力[5]；可產(chǎn)生消化酶、氨基酸、維生素、乳酸、丁酸等多種有益物質(zhì)，促進(jìn)機(jī)體對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，參與新陳代謝，促進(jìn)動(dòng)物生長[6]。益生菌添加到飼料中用于動(dòng)物生產(chǎn)，不存在耐藥性的問題，而且無毒、無污染、無殘留，同時(shí)又可起到提高動(dòng)物免疫力、提高動(dòng)物生產(chǎn)性能的作用。

篩選出不同功能的益生菌，研究其益生功效及安全性是微生物研究中重要的一部分，因此，研究者長期以來都在尋求自己的優(yōu)良菌源。本文就目前畜禽源益生菌的篩選方法及安全性進(jìn)行綜述，以期為畜禽優(yōu)良菌源的合理開發(fā)和應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 飼用益生菌的種類

并不是所有的微生物菌種都適用于微生態(tài)制劑的生產(chǎn)，益生菌應(yīng)具有無毒、生長繁殖快、能在腸道定植和抵抗病原菌等多種特性。我國農(nóng)業(yè)部《飼料添加劑品種目錄（2013）》中所列“飼用微生物”已達(dá)34種，按生物特性和作用特點(diǎn)大體可分為乳酸菌類（如雙歧桿菌、腸球菌等）、芽孢桿菌類（如地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌等）、酵母菌等[7]。其中乳酸菌是一類能利用可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的革蘭氏陽性細(xì)菌的通稱，為厭氧菌或兼性厭氧菌，是動(dòng)物腸道中的原籍菌群，參與宿主正常的代謝生理活動(dòng)。芽孢桿菌是一類好氧或兼性厭氧、能產(chǎn)生內(nèi)生孢子的桿狀細(xì)菌，具有抗逆性強(qiáng)、耐酸、耐膽鹽、耐高溫高壓等特性[1]。酵母菌是一類典型的兼性厭氧型單細(xì)胞真菌，在有氧和無氧條件下都能生存，且能使糖發(fā)酵分解成酒精和二氧化碳，是一種天然發(fā)酵劑。

2 畜禽源益生菌的篩選標(biāo)準(zhǔn)

篩選的益生菌要具有無毒、生長繁殖快、能在腸道定植和抵抗病原菌等多種特點(diǎn)，這樣后續(xù)的工作才具有意義。篩選益生菌時(shí)可參考以下標(biāo)準(zhǔn)[2，8-10]：①無毒、無致病性、無副作用，安全性是決定菌株能否成為益生菌的必要條件；②對(duì)胃腸道環(huán)境具有一定的耐受性；③可黏附定植于腸道上皮；④對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌等常見病原菌具有一定的抑制能力；⑤具有潛能的候選益生菌必須進(jìn)行分子鑒定。除了這些重要篩選標(biāo)準(zhǔn)，作為候選的益生菌還須具有其它的一些標(biāo)準(zhǔn)，比如具有產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶等消化酶的能力、耐高溫或低溫、抗氧化、能減少NH3、H2S等臭味氣體的排放等。飼用微生態(tài)制劑的效果如何與所選菌種的好壞有著密切的關(guān)系，只有用于制造成品制劑的菌種性狀優(yōu)良，最終的產(chǎn)品才具有較高的品質(zhì)。

3 畜禽源益生菌的篩選

3.1 益生菌的鑒定

在益生菌的研究中，候選益生菌的準(zhǔn)確分類非常重要，也是益生菌安全性評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)。FAO/WHO[10]建議采用表型鑒定和基因型鑒定相結(jié)合的方法對(duì)候選益生菌進(jìn)行分類。特別在鑒定分離微生物的種屬水平時(shí)，最好采用分子技術(shù)[11]，因?yàn)閱我坏谋硇丸b定結(jié)果不夠充分。我國也已經(jīng)把分子技術(shù)納入到分離微生物的種屬鑒定中。常用的表型鑒定方法如：形態(tài)學(xué)評(píng)估、革蘭氏染色、生理生化反應(yīng)等，這些傳統(tǒng)的分離鑒定方法僅用于益生菌的初步篩選。目前分子技術(shù)已廣泛用于分離微生物的種屬鑒定，如：rRNA基因測序、蛋白質(zhì)分析、核型分析、PCR技術(shù)等，這些技術(shù)能夠?qū)σ嫔M(jìn)行準(zhǔn)確的區(qū)分，幫助研究者確定菌株的種屬關(guān)系。然而16SrRNA基因序列分析是一種比較常用的微生物分類方法。

3.2 胃腸道環(huán)境耐受性

畜禽胃部的pH值相對(duì)比較低，能夠破壞大部分被攝入腸道內(nèi)的微生物。腸道內(nèi)膽汁鹽的濃度隨著時(shí)間變化，其中小腸部位膽汁鹽濃度平均在0.3%左右。益生菌要在畜禽腸道內(nèi)發(fā)揮益生功效必須具有酸耐受性和膽鹽耐受性。因此篩選益生菌要依次進(jìn)行耐酸特性、耐膽鹽特性、人工胃液耐受性和人工腸液耐受性檢測。具體地，將初篩的菌株培養(yǎng)液分別接種于不同pH值（2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0等）的液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，測定OD600nm；將初篩的菌株培養(yǎng)液分別接種于不同膽鹽濃度（0.1%、0.3%、0.5%、0.7%等）的液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，通過平板計(jì)數(shù)法計(jì)算活菌數(shù)；將初篩的菌株培養(yǎng)液接種于人工胃液、人工腸液中，37℃培養(yǎng)，分別在0、30、60、180 min采用平板計(jì)數(shù)法測定活菌數(shù)。目前對(duì)于胃腸道環(huán)境耐受性沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)的方法也不盡相同。馮媛媛等[12]建議選用人工模擬的胃腸液，但pH值、酶及膽鹽濃度應(yīng)盡可能與畜禽的胃腸液一致。因此研究者在篩選畜禽源益生菌時(shí)，要綜合考慮畜禽胃腸道環(huán)境中的pH值、酶、膽鹽以及個(gè)體等因素，這樣才能保證篩選出的益生菌在應(yīng)用時(shí)充分發(fā)揮益生功效。

3.3 黏附性

益生菌的黏附能力是評(píng)價(jià)該菌株是否能夠定植到腸道的一個(gè)決定因素，只有菌株定植到腸道內(nèi)才能發(fā)揮益生功效。研究表明黏附到腸黏膜上的益生菌具有提高機(jī)體免疫能力、平衡腸道菌群、減少病原菌數(shù)量等能力[13-14]。因此評(píng)價(jià)菌株的黏附能力是作為候選益生菌的一個(gè)重要指標(biāo)。評(píng)價(jià)菌株黏附性的方法主要有直接測定法和間接評(píng)價(jià)法。其中，直接測定法是采用體外構(gòu)建模型的方法評(píng)價(jià)菌株對(duì)上皮細(xì)胞或黏蛋白的黏附情況。體外細(xì)胞模型通常采用Caco-2、HT-29和HeLa細(xì)胞[15]，將等體積的菌株培養(yǎng)液接種于含有蓋玻片的細(xì)胞孔內(nèi)并培養(yǎng)至細(xì)胞完全融合的細(xì)胞孔內(nèi)，孵育1～2 h，甲醇固定，革蘭氏染色，顯微觀察計(jì)數(shù)，計(jì)算黏附率。但該方法有一定的缺陷，可能不能完全反映體內(nèi)的黏附情況，通常情況下菌體與腸道上皮細(xì)胞之間存在一層黏液層，益生菌若與上皮細(xì)胞間發(fā)生作用引起特異應(yīng)答，首先需要黏附于黏液層[15]。因此，可采用體外黏蛋白模型評(píng)價(jià)菌株對(duì)黏蛋白的黏附特性，該模型常采用ELISA法進(jìn)行。具體步驟為：①腸黏液蛋白的制備：刮取健康畜禽腸黏膜蛋白混合物，PBS混勻后離心收集上清。用BCA（Bicinchoninic Acid，二喹啉甲酸）法測定黏蛋白濃度，并調(diào)整濃度后-80℃保存?zhèn)溆茫虎诰w懸液的制備：將菌株培養(yǎng)液離心去上清，PBS洗滌后重懸，并調(diào)整菌液濃度后4℃保存?zhèn)溆?；③體外黏附：在96孔酶標(biāo)板中加入調(diào)整好濃度的黏液蛋白100 μl/孔，4℃孵育過夜，使蛋白固定在細(xì)胞培養(yǎng)板上；用PBS沖洗以除去未固定的黏液蛋白，每孔加入100 μl菌體懸液，37℃孵1 h后用PBS沖洗以除去未黏附的細(xì)菌；最后加入0.1%的Triton X-100裂解液200 μl，釋放黏附的細(xì)菌，37℃孵育30 min；梯度稀釋后，采用平板計(jì)數(shù)法測定活菌數(shù)，計(jì)算黏附率。

間接評(píng)價(jià)法包括細(xì)菌表面的疏水性和自聚合力等，可間接反映其黏附性的強(qiáng)弱，疏水性或自聚合力越大，黏附性越高[16]。但不同菌株的表面疏水性和自聚合力與其黏附性的相關(guān)程度不同，有些呈正相關(guān)，有些可能不相關(guān)。因此，采用間接評(píng)價(jià)法時(shí)，需結(jié)合直接測定法的結(jié)果進(jìn)行綜合評(píng)估。

3.4 抑菌能力

在養(yǎng)殖管理中不可避免的會(huì)引入大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等病原菌進(jìn)入畜禽的腸道內(nèi)，進(jìn)入腸道的病原菌會(huì)通過產(chǎn)生毒素和有害物質(zhì)減少腸道微生物的種類與數(shù)量，降低腸道微生物的多樣性[17]。腸道微生物多樣性的減少會(huì)降低腸內(nèi)穩(wěn)態(tài)和抵御病原菌的能力。因此篩選具有抑菌能力的益生菌株是一個(gè)重要的因素。研究已經(jīng)表明，具有益生功效的益生菌能夠分泌細(xì)菌素類的抗菌活性物質(zhì)或者通過降低腸道pH值抑制病原菌的生長繁殖[18]，因此作為候選益生菌要具有一定的抑菌能力。目前常采用濾紙片擴(kuò)散法、牛津杯法、平板打孔法、點(diǎn)種法以及雙層平板法篩選具有抑菌活力的菌株。以牛津杯法為例，將新鮮培養(yǎng)的指示菌（如大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等）按1‰接種量加入已高壓滅菌的培養(yǎng)基中混勻倒平板。用鑷子將無菌牛津杯輕輕放入培養(yǎng)皿中，在牛津杯中加入初篩的菌株培養(yǎng)液，以加入原始培養(yǎng)基的牛津杯為對(duì)照，37℃培養(yǎng)過夜，測量抑菌圈直徑。無論采用哪種方法，所篩選的候選菌株都要結(jié)合體內(nèi)抑菌模型判斷該菌株的抑菌能力。

除了上述重要的篩選標(biāo)準(zhǔn)之外，候選菌株的產(chǎn)酶能力、抗氧化、除NH3或H2S能力以及耐低溫或高溫等，研究者可根據(jù)研究目的或?qū)嶋H生產(chǎn)需求將上述標(biāo)準(zhǔn)以不同的加權(quán)值或選擇其中的部分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，最終獲得各具功能的系列益生菌。

4 益生菌的安全性

目前，益生菌在食品和飼料工業(yè)領(lǐng)域已經(jīng)廣泛應(yīng)用，并且商品化的益生菌在市場上日趨增多，如何對(duì)篩選的候選菌株進(jìn)行有效的安全評(píng)估也越來越受到人們的關(guān)注。劉小杰等[19]報(bào)道畜禽源益生菌的安全性應(yīng)該包括：①應(yīng)用益生菌的來源和使用對(duì)象應(yīng)該一致；②益生菌必須來源于健康的動(dòng)物；③益生菌必須對(duì)畜禽無致病性；④益生菌不能具有膽鹽水解酶活性；⑤益生菌不能攜帶可以轉(zhuǎn)移的抗抗生素基因；⑥益生菌不能產(chǎn)生對(duì)畜禽有毒的代謝產(chǎn)物。因此為了確保所篩選的候選菌株的安全性，需要對(duì)篩選菌株進(jìn)行安全性評(píng)估。楊寶蘭等[20]指出益生菌的安全性至少對(duì)其進(jìn)行耐藥性評(píng)價(jià)、代謝活性評(píng)估、對(duì)人體的副作用評(píng)估以及銷售后對(duì)其出現(xiàn)的相關(guān)副作用進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查等。不同特性的益生菌菌株具有不同的評(píng)價(jià)方法和指標(biāo)，研究者要根據(jù)研究菌株的特性，選擇合適的指標(biāo)和方法對(duì)其進(jìn)行安全性評(píng)估。畜禽源益生菌作為一種新型飼料添加劑越來越來受到飼料工業(yè)領(lǐng)域的關(guān)注，但其還存在許多不容忽視的問題，如產(chǎn)生有毒的代謝產(chǎn)物、抗生素抗性、存在一些毒性基因等。這些因素直接或間接和畜禽的生長、健康以及畜產(chǎn)品的安全有關(guān)。因此正確認(rèn)識(shí)和評(píng)價(jià)畜禽源益生菌的安全性是必要的。

5 益生菌的發(fā)展前景

隨著抗生素在畜牧業(yè)中的大量廣泛使用所引發(fā)的耐藥性、食品殘留、機(jī)體免疫力下降、環(huán)境破壞等一系列問題，尋找抗生素替代品的研究已成為生物、農(nóng)業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)的熱點(diǎn)。益生菌因其安全無毒、無副作用且效果顯著等優(yōu)點(diǎn)日益受到人們的關(guān)注。根據(jù)現(xiàn)階段益生菌在畜禽中的廣泛應(yīng)用和研究，表明益生菌作為抗生素的替代品具有較好的實(shí)際意義和良好的前景[7]。目前作為益生菌應(yīng)用到飼料添加劑中的微生物種類還很少，還有很多具有益生特性的菌種有待進(jìn)一步的開發(fā)，如根據(jù)生產(chǎn)需求篩選高黏附性、高產(chǎn)蛋白酶、高抑菌活性、耐低溫、高頡頏NH3等具有不同優(yōu)良特性的菌株。當(dāng)前為提高益生菌添加劑的作用效果，充分利用不同微生物的協(xié)同作用，可將多種益生菌配套組合，形成復(fù)合益生菌制劑。另外，酶制劑、植物提取物等也可作為飼料添加劑，不同種類的添加劑具有不同的優(yōu)勢，可聯(lián)合使用協(xié)同作用，形成復(fù)合微生物制劑，發(fā)揮更顯著的效果。飼用微生物制劑的研究還應(yīng)該根據(jù)不同生長階段的不同動(dòng)物種類及不同的目的（如促進(jìn)生長、防治疾病、改善環(huán)境等），選擇不同的益生菌菌種[8]。將針對(duì)性地篩選出的益生菌及研制的復(fù)合微生物制劑應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)中，促進(jìn)畜禽的生長，改善畜禽生長環(huán)境，提高經(jīng)濟(jì)效益。