冉豐，曾曉莉，張文娟，王妍,何治

(1三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北宜昌443002；2三峽大學(xué)附屬仁和醫(yī)院；3 湖北三峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院；4佛山市第一人民醫(yī)院)

隨著人口老齡化日益嚴(yán)重,腦血管疾病發(fā)病率日趨增高，尤以缺血性腦血管病最常見(jiàn)[1～3]。我國(guó)植物資源豐富,從傳統(tǒng)中草藥中尋找治療缺血性腦血管疾病的藥物是一條可以探索的道路。蝙蝠葛又名北豆根，其根莖可用于治療心血管疾病和血栓栓塞。蝙幅葛酚性堿(PAMD)是從蝙蝠葛根莖中提取的一種混合物,包含多種脂溶性生物堿，其主要成分是蝙蝠葛堿(Dau)和蝙蝠葛蘇林堿(Ds)，均為雙芐基異喹啉類(lèi)生物堿，脂溶性高，易透過(guò)血腦屏障[4,5]。PAMD能預(yù)防家兔腦缺血導(dǎo)致的神經(jīng)損傷[6,7]，但其具體作用機(jī)制不清楚。N-甲基-D-門(mén)冬氨酸受體(NMDAR)介導(dǎo)的興奮性神經(jīng)毒性是腦缺血再灌注損傷的核心機(jī)制。2016年7～10月，本研究觀察了PAMD灌胃對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的預(yù)防作用，現(xiàn)分析結(jié)果并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級(jí)雄性SD大鼠36只,體質(zhì)量250～300 g,由三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)4210200047)。PAMD為淡黃色粉末，純度>95%，由中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所潘錫平博士提供，用1 mol/L稀鹽酸溶解后，用1 mol/L NaOH調(diào)pH至6.4，過(guò)濾除菌后4 ℃保存。2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)購(gòu)自Sigma公司，批號(hào)為20100610。GAPDH一抗(兔抗鼠)購(gòu)自Santa Cruz 公司，批號(hào)為sc-25778，規(guī)格為1 mL。NMDAR2B一抗(兔抗鼠)購(gòu)自CST公司，批號(hào)為4212，規(guī)格為100 μL。Phospho NMDAR2B一抗(兔抗鼠)購(gòu)自CST公司，批號(hào)為4208，規(guī)格為100 μL。二抗(羊抗兔)購(gòu)自Santa Cruz公司，批號(hào)為sc-2030，規(guī)格為500 μL。水合氯醛購(gòu)自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；BCA蛋白定量試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程有限公司。

1.2 腦缺血再灌注損傷模型制作及分組干預(yù) 將36只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、PAMD組，每組12只。PAMD組先每日給予50 mg/kg的PAMD灌胃1周，假手術(shù)組和模型組分別給等體積生理鹽水。PAMD組和模型組采用大腦中動(dòng)脈線栓法制作大鼠局灶性腦缺血模型。大鼠禁食12 h，自由飲水。用10% 水合氯醛以0.35 mL/100 g的劑量腹腔注射麻醉，仰臥位固定，頸部去毛備皮，碘伏、乙醇消毒。取頸正中線切口，鈍性分離右側(cè)頸動(dòng)脈鞘；分離出光滑的頸總、頸內(nèi)和頸外動(dòng)脈，結(jié)扎右側(cè)頸總及頸外動(dòng)脈，于頸總動(dòng)脈下預(yù)留縫合線用于之后固定栓線。夾閉頸總動(dòng)脈，用眼科剪在距離頸外、頸內(nèi)動(dòng)脈分叉0.5 cm處的頸總動(dòng)脈上開(kāi)一小口，從開(kāi)口處往頸內(nèi)動(dòng)脈慢慢插入直徑0.235或0.265 mm的尼龍栓線，松開(kāi)夾子，將栓線插入2.5 cm左右可達(dá)到1.8～2.0 cm的插入深度，用預(yù)留線固定插入的尼龍栓線?？p合消毒后將大鼠放回籠內(nèi)。持續(xù)栓塞2 h后拔出栓線，再灌注4 h。動(dòng)物蘇醒后出現(xiàn)對(duì)側(cè)肢體運(yùn)動(dòng)障礙及血管栓塞的同側(cè)Hornor征，證實(shí)造模成功。假手術(shù)組操作過(guò)程同手術(shù)組，但不結(jié)扎右側(cè)頸總和頸外動(dòng)脈，也不插入栓線。術(shù)中保持動(dòng)物肛溫在 (37±0.5) ℃。

1.3 各組神經(jīng)功能損傷評(píng)分 造模3 h，采用Longa Zea的6級(jí)評(píng)分法對(duì)各組行神經(jīng)功能損傷評(píng)分：無(wú)神經(jīng)損傷癥狀計(jì)0分；不能完全伸展栓塞對(duì)側(cè)前爪計(jì)1分；向栓塞對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)圈計(jì)2分；向栓塞對(duì)側(cè)傾倒計(jì)3分；不能自發(fā)行走、昏迷計(jì)4分；死亡計(jì)5分。

1.4 各組缺血再灌注側(cè)腦梗死情況觀察 神經(jīng)功能損傷評(píng)分結(jié)束后各組取3只大鼠麻醉后斷頭取腦，從大腦視交叉處平行于冠狀面切成2 mm厚的腦片，浸入用0.2 mol/L的 PBS配制的2% TTC染色液中，避光染色6～15 min，取出腦片放整齊并拍照保存。采用ImageJ圖像分析軟件計(jì)算每張染色圖片中腦梗死面積(白色區(qū)域?yàn)楣Ｋ滥X組織，紅色區(qū)域?yàn)檎ＤX組織)。腦片厚度與各腦片梗死面積之和相乘即為腦梗死體積。腦梗死體積 (%)=梗死區(qū)體積/(梗死區(qū)體積+非梗死區(qū)體積)×100%。

1.5 各組缺血再灌注腦皮層組織NR2B和p-NR2B檢測(cè) 采用Western blotting法。取各組缺血再灌注腦皮層組織，提取總蛋白，蛋白濕轉(zhuǎn)入硝酸纖維膜上，經(jīng)5%牛奶封閉30 min，4% BSA封閉5 min。加入兔源NR2B、p-NR2B一抗，4 ℃孵育18 h，0.02 mol/L TBS洗膜10 min×3次，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體，37 ℃孵育1 h，0.02 mol/L TBS洗膜10 min×3次，ECL顯色曝光。以GAPDH為內(nèi)參照， NR2B、p-NR2B相對(duì)表達(dá)量以NR2B和p-NR2B條帶與GAPDH條帶灰度值之比表示。

2 結(jié)果

2.1 各組神經(jīng)功能損傷評(píng)分比較 PAMD組、模型組、假手術(shù)組神經(jīng)功能損傷評(píng)分分別為(0.84±0.26 )、(2.41±0.72)、0分。PAMD組、模型組神經(jīng)功能損傷評(píng)分高于假手術(shù)組(P均<0.05)，PAMD組神經(jīng)功能損傷評(píng)分低于模型組(P<0.05)。

2.2 各組缺血再灌注側(cè)腦梗死情況比較 肉眼可觀察到模型組、PAMD組缺血側(cè)有不同程度的梗死灶，對(duì)側(cè)無(wú)梗死灶，梗死區(qū)域與大腦中動(dòng)脈所支配的腦區(qū)一致。PAMD組、模型組、假手術(shù)組再灌注側(cè)腦梗死體積分別為(23.56±5.47)%、(37.42±6.55)%、0。PAMD組、模型組再灌注側(cè)腦梗死體積大于假手術(shù)組(P均<0.05)，PAMD組腦梗死體積小于模型組(P<0.05)。

2.3 各組缺血再灌注側(cè)腦皮質(zhì)NR2B、p-NR2B相對(duì)表達(dá)量比較 PAMD組、模型組、假手術(shù)組再灌注側(cè)腦皮質(zhì)NR2B相對(duì)表達(dá)量分別為0.26±0.05、0.25±0.03、0.24±0.02。三組缺血再灌注側(cè)腦皮質(zhì)NR2B相對(duì)表達(dá)量相比，P>0.05。PAMD組、模型組、假手術(shù)組缺血再灌注側(cè)腦皮質(zhì)p-NR2B相對(duì)表達(dá)量分別為0.39±0.09、0.49±0.04、0.37±0.06，PAMD組、模型組再灌注側(cè)腦皮質(zhì)p-NR2B相對(duì)表達(dá)量高于假手術(shù)組(P均<0.05)，PAMD組再灌注側(cè)腦皮質(zhì)p-NR2B相對(duì)表達(dá)量低于模型組(P<0.05)。

3 討論

缺血性腦血管疾病常導(dǎo)致血腦屏障受損和破壞，從而伴發(fā)腦水腫。本研究結(jié)果顯示，PAMD可減少腦缺血再灌注導(dǎo)致的大鼠腦梗死體積，降低神經(jīng)功能損傷評(píng)分，證實(shí)其可預(yù)防腦缺血再灌注損傷。腦缺血時(shí)病理?yè)p害涉及的病理生理變化較復(fù)雜，包括多個(gè)方面，興奮性毒性損害是目前廣泛認(rèn)可的機(jī)制之一。腦缺血后，腦組織缺氧缺糖，能量供給障礙，細(xì)胞膜去極化，缺血中心區(qū)細(xì)胞迅速壞死，缺血損傷進(jìn)一步級(jí)聯(lián)損害缺血半暗帶，引起谷氨酸等興奮性氨基酸遞質(zhì)生物功能增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，大量生成自由基，引發(fā)線粒體功能異常和氧化應(yīng)激損傷。由谷氨酸誘導(dǎo)的興奮性神經(jīng)毒性在缺血性神經(jīng)元損傷發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮復(fù)雜而重要的作用，離子型谷氨酸受體NMDAR被認(rèn)為與興奮性神經(jīng)毒性密切相關(guān)[8～10]。

NMDAR是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一類(lèi)重要的興奮性氨基酸受體，具有配體、電壓雙重門(mén)控特性，對(duì)Ca2+有高通透性，但靜息狀態(tài)下Mg2+結(jié)合在通道內(nèi)，阻止Ca2+內(nèi)流。當(dāng)受體激活后，離子通道打開(kāi)，Ca2+、Na+內(nèi)流和K+外流，突觸后膜產(chǎn)生興奮性去極化電位，內(nèi)流的Ca2+激活細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號(hào)通路，產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。NMDAR是由NR1、NR2A-D及NR3A-B等7種亞單位組成的異源四聚體復(fù)合物，其中NR1是該受體的功能亞單位，NR2是該受體的調(diào)節(jié)亞單位，功能性 NMDAR主要是由2個(gè) NR1亞單位結(jié)合2個(gè)NR2亞單位構(gòu)成[11～13]。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組再灌注側(cè)腦皮質(zhì)NR2B表達(dá)量無(wú)明顯差異，但p-NR2B表達(dá)量增加；與模型組比較，PAMD組再灌注側(cè)腦皮質(zhì)p-NR2B表達(dá)量降低。有文獻(xiàn)報(bào)道，在缺血損傷24 h或缺血15 min再灌注6 h后，沙鼠海馬中NR2B蛋白表達(dá)量無(wú)明顯變化[14,15]。推測(cè)本研究大鼠腦缺血再灌注后皮層部位的損傷可能由于其比海馬較為豐富的側(cè)支循環(huán)而出現(xiàn)較晚且程度較輕，因而NR2B蛋白表達(dá)雖有變化但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。另外，與假手術(shù)組比較，模型組皮層p-NR2B蛋白表達(dá)顯著升高，說(shuō)明NR2B蛋白磷酸化能引起腦缺血再灌注后腦組織損傷。有報(bào)道，沙鼠海馬中p-NR2B蛋白在缺血15 min表達(dá)量顯著降低，再灌注15 min即迅速上升，并可維持48 h的高表達(dá)狀態(tài)[15]；本研究結(jié)果與其相符。

綜上所述，PAMD對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷有預(yù)防作用；其機(jī)制可能與抑制NR2B磷酸化有關(guān)。

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