黎智文 代俊杰 李 曉

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羊肚菌干子實(shí)體組織分離與孢子分離獲得菌種的比較試驗(yàn)

黎智文 代俊杰 李 曉*

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 食藥用菌教育部工程研究中心，吉林 長春 130118）

對(duì)干子實(shí)體組織分離與孢子分離兩種方法獲得羊肚菌菌種進(jìn)行比較試驗(yàn)的結(jié)果：萌發(fā)可純化時(shí)間分別為1～5天和2～5天；孢子萌發(fā)率較組織的萌發(fā)率高，分別為90%和80%；在萌發(fā)可純化時(shí)間內(nèi)，能純化出羊肚菌菌絲的幾率均為100%。

干羊肚菌；組織分離；孢子分離；菌種萌發(fā)

羊肚菌因其菌蓋似羊肚而得名，俗稱羊肚菜、羊肚子、羊肚蘑，是珍貴的食藥用真菌[1，2]。近年來羊肚菌在我國已進(jìn)行了大面積季節(jié)性人工栽培[3]，產(chǎn)量和質(zhì)量逐年提高。

因羊肚菌屬于子囊菌，菌種退化速度快，需要經(jīng)常制種[4]。本文對(duì)兩種簡單、快速、可周年化生產(chǎn)的羊肚菌菌種獲得方法進(jìn)行比較，為簡化菌種生產(chǎn)環(huán)節(jié)提供參考。

1 試驗(yàn)材料

干羊肚菌子實(shí)體，為田間選擇的理想的置于戶外陽光下曬干或自然風(fēng)干的羊肚菌子實(shí)體；或?yàn)榻?jīng)曬干或風(fēng)干后保藏的不發(fā)潮、不霉變的子實(shí)體。羊肚菌孢子由田間選擇采收的八分熟羊肚菌子實(shí)體直接置于室內(nèi)桌面的黑紙上過夜后收集獲得，保藏備用。

其他試驗(yàn)材料和工具包括鑷子、裝有PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿、空培養(yǎng)皿、封口膜、75%酒精、酒精燈和超凈工作臺(tái)等。

2 試驗(yàn)方法

2.1 PDA平板培養(yǎng)基的制作

以制作1 000 mL培養(yǎng)基為例：稱取馬鈴薯200 g，切塊置于1 000 mL水中煮至半熟，紗布過濾，得濾液。邊加熱濾液邊倒入20 g瓊脂粉攪拌均勻，瓊脂粉全溶解后倒入20 g葡萄糖和2 g MgSO4。將所得液體分裝到三角瓶中，與報(bào)紙包好的培養(yǎng)皿一起經(jīng)121 ℃高壓滅菌30 min。滅菌后，在超凈工作臺(tái)中每個(gè)培養(yǎng)皿倒入約15 mL的PDA培養(yǎng)液，冷卻后備用。

2.2 菌種制作方法

（1）組織分離。將一個(gè)空培養(yǎng)皿、無菌水、75%酒精、PDA平板培養(yǎng)基、接種用具等放入超凈工作臺(tái)中紫外滅菌30分鐘，然后，放入干羊肚菌子實(shí)體和含有羊肚菌孢子的紙條。雙手經(jīng)75%酒精消毒后，點(diǎn)燃酒精燈，打開空培養(yǎng)皿倒入適量的75%酒精，鑷子經(jīng)火焰滅菌，待冷卻后于菌柄上夾取高粱粒大小的菌肉，放入培養(yǎng)皿中浸泡1 min左右，再放入PDA平板培養(yǎng)基中間位置。每個(gè)培養(yǎng)基放一塊菌肉，根據(jù)所分離子實(shí)體的部位、制種數(shù)量等的需求，接種足夠數(shù)量的培養(yǎng)基。接種后，用封口膜封好，置于20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中無光培養(yǎng)2～5天，菌肉上長出可純化使用的菌絲[5～10]。

（2）多孢分離。試驗(yàn)準(zhǔn)備工作與組織分離類似，鑷子過無菌水濕潤后粘取羊肚菌孢子涂布到PDA平板培養(yǎng)基上，用封口膜密封。置于20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中無光培養(yǎng)。約1～5天，孢子即可萌發(fā)出可純化的菌絲。

（3）純化保藏。按照無菌操作流程，挑取以上兩種方法獲得的較尖端的無污染菌絲，轉(zhuǎn)接到未接菌的PDA平板培養(yǎng)基中，封口、培養(yǎng)。培養(yǎng)期間剔除污染平板培養(yǎng)基，待平板培養(yǎng)基有菌核形成時(shí)，按無菌操作規(guī)程將菌核接入PDA試管培養(yǎng)基表面，培養(yǎng)、篩選、保藏后，作為羊肚菌實(shí)驗(yàn)或生產(chǎn)使用的菌種。

3 結(jié)果與分析

試驗(yàn)結(jié)果：①萌發(fā)可純化時(shí)間是指菌體組織或其孢子在萌發(fā)出菌絲后可用于純化使用的時(shí)間，本試驗(yàn)羊肚菌組織分離方法與孢子分離方法的萌發(fā)可純化時(shí)間分別為1～5天和2～5天。到第5天后，菌絲與雜菌皆長滿培養(yǎng)皿，此時(shí)不利于純化使用；②萌發(fā)率是指所接的羊肚菌組織或所有的孢子能完好萌發(fā)的概率。試驗(yàn)中，孢子萌發(fā)率較組織萌發(fā)率高，分別為90%和80%；③純化出菌絲幾率是指在萌發(fā)可純化時(shí)間內(nèi)的所有適當(dāng)時(shí)間點(diǎn)能純化出羊肚菌菌絲的幾率，經(jīng)測試兩種方法均為100%。

干羊肚菌組織分離成功的關(guān)鍵在于選擇干凈無污染、無霉變、潔白或微黃的理想子實(shí)體，以及從鮮品到干品的處理過程無機(jī)械壓傷，無化學(xué)污染等。孢子分離的關(guān)鍵在于選用子實(shí)體的成熟度高及收集孢子時(shí)子實(shí)體所處的環(huán)境條件適宜[11]。

4 討 論

羊肚菌子實(shí)體可以干制，干制后其菌絲、孢子皆處于休眠狀態(tài)，在適宜的條件下可以再次萌發(fā)成菌絲。利用此屬性，可以周年化生產(chǎn)、保藏羊肚菌菌種，使羊肚菌周年化研究、生產(chǎn)成為可能。

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[11] 陳易飛. 羊肚菌子囊孢子釋放機(jī)理初探[J]. 中國食用菌, 2001, 20: 53-54.

黎智文、代俊杰，吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)在讀碩士研究生，研究方向?yàn)槭秤镁耘嗯c育種，E-mail：1134861016@qq.com。

，E-mail：lxmogu@163.com。

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