朱冬辰，朱彧，牛文彥

(1天津醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)系，天津 300070；2天津市環(huán)湖醫(yī)院/天津市腦血管與神經(jīng)變性重點實驗室；3天津醫(yī)科大學(xué)代謝病醫(yī)院)

腦梗死是一種致殘率及病死率較高的疾病[1]。短暫性腦缺血發(fā)作被認(rèn)為是腦梗死的先兆[2]。人體腸道微生態(tài)已被證明參與多種生理和病理過程，在心血管疾病中發(fā)揮重要作用[3]。腦梗死的發(fā)生發(fā)展與人體脂代謝紊亂具有密切聯(lián)系[4]。載脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)是血脂的重要組成部分，參與動脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病、心臟病以及高血脂等疾病過程，其血清水平與腦血管疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5]。有研究[6，7]發(fā)現(xiàn)，腸道菌群結(jié)構(gòu)和腸道功能紊亂可引起ApoE表達(dá)的增加，進(jìn)而導(dǎo)致某些疾病的發(fā)生發(fā)展。但是，短暫性腦缺血和腦梗死患者腸道菌群微生物相對豐度、群落結(jié)構(gòu)、微生物豐富程度的變化及其與ApoE表達(dá)的關(guān)系尚不清楚。本研究觀察了腦梗死和短暫性腦缺血患者腸道菌群變化，并分析及其與血清ApoE水平的相關(guān)性，探討腸道菌群紊亂與腦部缺血性疾病的關(guān)系，為腦血管疾病的發(fā)病機(jī)制研究提供新的方向。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 本研究選取2015年5月～2017年10月天津市環(huán)湖醫(yī)院收治的經(jīng)頭部CT檢查確診的腦梗死患者30例(腦梗死組)、短暫性腦缺血患者30例(短暫性腦缺血組)以及同期體檢健康者30例(健康組)為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：腦梗死組、短暫性腦缺血組均符合全國第四屆腦血管病學(xué)術(shù)會議制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)頭部CT檢查確診。健康組經(jīng)體檢證實無心腦血管疾病和血脂異常。排除標(biāo)準(zhǔn)：所有研究對象排除嚴(yán)重心肝腎功能不全者，排除近4周內(nèi)接受降脂治療者，排除全身感染性疾病、自身免疫性疾病、惡性腫瘤、血液系統(tǒng)疾病以及其他系統(tǒng)血栓栓塞性疾病患者。研究對象年齡39～75歲，平均60.8歲，各組間性別和年齡有可比性(P均>0.05)。腦梗死組、短暫性腦缺血組發(fā)病24 h內(nèi)留取糞便標(biāo)本、血清標(biāo)本，健康組統(tǒng)一留取糞便標(biāo)本、血清標(biāo)本。

1.2 主要試劑與儀器 糞便基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)，TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒(美國Illumina公司)，ApoE酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒(美國Abcam公司)，NanoDrop One/OneC微量核酸蛋白濃度測定儀(美國賽默飛世爾科技公司)，MK3型酶標(biāo)儀(美國賽默飛世爾科技公司)，120C離心機(jī)(北京白洋淀醫(yī)療器械有限公司)。

1.3 糞便菌群檢測分析 取研究對象500 mg 中段糞便，采用糞便基因組提取試劑盒提取總RNA并對細(xì)菌16S rRNA基因V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，V4上游引物5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′、下游引物5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。PCR條件為94 ℃變性2 min，94 ℃、 30 s，52 ℃、 30 s，72 ℃、 45 s，共30個循環(huán)，72 ℃延伸5 min。采用TruSeq DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進(jìn)行基因組文庫構(gòu)建，通過HiSeq2500 PE250平臺對細(xì)菌rRNA基因V4可變區(qū)進(jìn)行測序，通過各樣品測序數(shù)據(jù)對細(xì)菌物種間的親緣關(guān)系和物種間的差異進(jìn)行分析，獲得細(xì)菌分類、細(xì)菌相對豐度(微生物相對豐度即一個樣品里某一微生物種占所有微生物種的比例。根據(jù)生物的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理功能可將生物劃分為界、門、綱、目、科、屬、種不同的等級)和細(xì)菌群落相互關(guān)系等信息。文庫構(gòu)建和測序工作由北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成。

1.4 血清ApoE檢測 血清ApoE檢測采用ELISA法，酶標(biāo)儀(吸收波長492 nm)記錄光密度值(OD值)，根據(jù)OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出樣本中ApoE的濃度。

2 結(jié)果

2.1 三組腸道菌群在門水平上最大相對豐度、群落結(jié)構(gòu)(各組每個樣本細(xì)菌種類和豐度)異質(zhì)性和物種豐富程度比較 三組腸道菌群在門水平上最大相對豐度排前9位的依次為厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、疣微菌門、軟壁菌門、放線菌門、藍(lán)藻門、互養(yǎng)菌門和浮霉菌門，其相對豐度腦梗死組分別為0.423 2±0.219 3、0.298 9±0.124 1、0.238 4±0.113 8、0.001 4±0.000 8、0.011 2±0.008 1、0.021 5±0.002 4、0.001 0±0.000 2、0.000 2±0.000 1、0.000 1±0.000 0，短暫性腦缺血組分別為0.300 6±0.186 9、0.272 8±0.181 7、0.311 1±0.047 8、0.002 4±0.001 0、0.057 6±0.007 1、0.045 8±0.002 4、0.006 2±0.000 5、0.000 2±0.000 1、0.001 4±0.001 0，健康組分別為0.344 2±0.127 9、0.225 4±0.167 9、0.349 0±0.141 6、0.025 3±0.005 2、0.010 5±0.003 9、0.026 5±0.001 2、0.012 0±0.007 2、0.001 1±0.000 9、0.003 1±0.001 2；腦梗死組的擬桿菌門、疣微菌門、放線菌門、藍(lán)藻門、互養(yǎng)菌門、浮霉菌門菌群相對豐度與健康組相比，P均<0.05；短暫性腦缺血組的疣微菌門、軟壁菌門、放線菌門、藍(lán)藻門、互養(yǎng)菌門、浮霉菌門菌群相對豐度與健康組相比，P均<0.05；腦梗死組的厚壁菌門、擬桿菌門、疣微菌門、軟壁菌門、放線菌門、藍(lán)藻門、浮霉菌門菌群相對豐度與短暫性腦缺血組相比，P均<0.05。

NMDS分析發(fā)現(xiàn)，健康組和腦梗死組腸道菌群群落結(jié)構(gòu)異質(zhì)性(脅迫系數(shù)stress<0.05，P<0.05)高于短暫性腦缺血組和健康組腸道菌群群落結(jié)構(gòu)的異質(zhì)性(脅迫系數(shù)stress>0.05，P>0.05)。

腦梗死組、短暫性腦缺血組、健康組腸道菌群的物種豐富程度即Chao1指數(shù)分別為591.775 5±198.472 2、778.844 5±71.197 9、799.345 5±69.689 0；腦梗死組與短暫性腦缺血組和健康組相比,P均<0.05；短暫腦缺血組與健康組相比，P>0.05。

2.2 三組血清中ApoE水平比較 腦梗死組、短暫性腦缺血組、健康組血清ApoE水平分別為(36.2±6.3) 、(33.2±5.4)、(32.8±5.7)mg/L；腦梗死組與短暫腦缺血組和健康組相比,P均<0.05；短暫腦缺血組與健康組相比，P>0.05。

2.3 三組在門水平上最大相對豐度排前9位的腸道菌群相對豐度與血清ApoE水平的相關(guān)性 三組擬桿菌門相對豐度與血清ApoE水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.606 8，P<0.05)，其他8種腸道菌群相對豐度與ApoE水平無顯著相關(guān)性(r=0.3，P>0.05)。

3 討論

腦梗死是一種腦血管循環(huán)障礙性疾病，短暫性腦缺血發(fā)作是由于短暫性腦血管血液供應(yīng)不足引起的局灶性腦缺血，被認(rèn)為是腦梗死的早期表現(xiàn)[8，9]。腦梗死和短暫性腦缺血等腦部缺血性疾病的發(fā)病和進(jìn)展機(jī)制尚未完全清楚。

人體腸道菌群對維持人體的健康具有重要作用[10，11]。本研究發(fā)現(xiàn)，腦梗死和短暫性腦缺血患者腸道菌群主要微生物相對豐度、群落結(jié)構(gòu)以及物種豐富程度均發(fā)生了一定變化。推測這一變化可能在腦血管疾病發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要角色，可能是腦部缺血性疾病的潛在致病因素[12]。

NMDS分析發(fā)現(xiàn)，腦梗死組與健康組腸道菌群的群落結(jié)構(gòu)差異顯著，同時腦梗死組腸道菌群多樣性顯著低于健康組，而短暫性腦缺血組和健康組腸道菌群多樣性未見顯著差異。上述結(jié)果表明腸道菌群的變化可能與腦缺血程度有關(guān)，進(jìn)一步證實腸道菌群與腦部缺血性疾病的潛在聯(lián)系[13]。ApoE是腦部缺血性疾病的獨立風(fēng)險因素之一，也是腸道菌群影響腦缺血和腦梗死發(fā)病過程的重要機(jī)制[14]。本研究也發(fā)現(xiàn)，短暫性腦缺血組和腦梗死組血清ApoE水平顯著高于健康組，與文獻(xiàn)[15]報道一致。已有研究[16]發(fā)現(xiàn)腸道微生態(tài)失調(diào)可導(dǎo)致人體代謝的紊亂。擬桿菌門是人體腸道菌群的主要組成之一，可受到遺傳、年齡、飲食、疾病和藥物等因素影響，具有調(diào)控人體脂代謝的功能[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，擬桿菌門在腦梗死組患者糞便中相對豐度顯著下調(diào)且下調(diào)水平高于短暫性腦缺血組，即擬桿菌門相對豐度與腦缺血程度有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，健康組、短暫性腦缺血組和腦梗死組腸道菌群中擬桿菌門相對豐度與血清ApoE水平成負(fù)相關(guān)，而其他主要微生物種類與血清ApoE水平無顯著相關(guān)性。因此，我們認(rèn)為擬桿菌門可能通過調(diào)節(jié)ApoE代謝影響腦部缺血性疾病的發(fā)生發(fā)展。

對正常無菌小鼠喂食帕金森等患者腸道菌群可導(dǎo)致小鼠神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生改變，證明腸道菌群可以通過多種因素誘導(dǎo)疾病的發(fā)生[18]。根據(jù)本研究結(jié)果，也可以推測腦梗死患者飲食、代謝和其他原因?qū)е铝四c道微生態(tài)的改變，同時腸道微生態(tài)的改變也通過代謝等因素誘發(fā)或加重了腦缺血和腦梗死的發(fā)生或發(fā)展，形成正反饋，這需要在今后的研究中進(jìn)一步證實。