陳崗，宋長(zhǎng)明，李九州

(1寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院，銀川750001；2壽光市中醫(yī)醫(yī)院；3濱州市人民醫(yī)院)

垂體腺瘤是最常見(jiàn)的顱內(nèi)原發(fā)腫瘤之一，其中10%～20%為生長(zhǎng)激素腺瘤[1～3]。垂體生長(zhǎng)激素腺瘤可分泌過(guò)量的生長(zhǎng)激素并誘導(dǎo)生成胰島素樣生長(zhǎng)因子-I(insulin-like growth factor I，IGF-I)作用于全身器官，導(dǎo)致巨人癥、肢端肥大癥、代謝障礙和循環(huán)呼吸系統(tǒng)疾病等[4～6]。部分垂體生長(zhǎng)激素腺瘤具有侵襲性生長(zhǎng)的特性，可累及海綿竇、頸內(nèi)動(dòng)脈等重要結(jié)構(gòu)，手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)大，全切除困難，術(shù)后易復(fù)發(fā)。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是指長(zhǎng)度超過(guò)200 nt、無(wú)蛋白編碼功能的RNA，多數(shù)由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄生成。lncRNA可通過(guò)多種機(jī)制調(diào)控生物進(jìn)程[7～9]。目前已發(fā)現(xiàn)lncRNA的異常表達(dá)與許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。lncRNA中的HOX基因的反義基因間RNA(HOX transcript anti-sense intergenic RNA,HOTAIR)即HOTAIR lncRNA，被證實(shí)與乳腺癌、肝癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤的發(fā)生相關(guān)，并可作為某些腫瘤診斷和預(yù)后判斷的一個(gè)重要標(biāo)志物[10,11]。但其在垂體生長(zhǎng)激素腺瘤發(fā)生發(fā)展和侵襲中的作用尚未明確。本研究觀察了非侵襲性垂體生長(zhǎng)激素腺瘤和侵襲性垂體生長(zhǎng)激素腺瘤組織中HOTAIR lncRNA的表達(dá)變化，同時(shí)干擾垂體瘤細(xì)胞株GH3的HOTAIR lncRNA表達(dá)并觀察其生長(zhǎng)激素分泌及細(xì)胞侵襲性變化，探討HOTAIR lncRNA對(duì)垂體生長(zhǎng)激素腺瘤侵襲和激素分泌的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2010年1月～2017年10月在寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院和濱州市人民醫(yī)院接受手術(shù)治療的初治垂體生長(zhǎng)激素腺瘤患者51例，男23例，女28例；年齡19～67(50.2±5.7)歲；其中侵襲性垂體生長(zhǎng)激素腺瘤17例，非侵襲性垂體生長(zhǎng)激素腺瘤34例。正常垂體前葉來(lái)源于5例組織捐獻(xiàn)者，男3例，女2例，年齡30～59(37.2±4.6)歲；捐獻(xiàn)者均無(wú)神經(jīng)系統(tǒng)或內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病。垂體生長(zhǎng)激素腺瘤組織和正常垂體前葉收集后保存于液氮中。本研究分別經(jīng)寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院和濱州市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞、試劑和儀器 垂體瘤細(xì)胞株GH3(為分泌過(guò)量生長(zhǎng)激素的垂體瘤細(xì)胞)購(gòu)于美國(guó)ATCC公司。TRIzol (Invitrogen，美國(guó))、NanoDrop1000 (Thermo Scientific，美國(guó))、第一鏈 cDNA 合成試劑盒(Invitrogen，美國(guó))、Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UD試劑盒(Invitrogen，美國(guó))、ABI 7500 Fast system (Applied Biosystems，美國(guó))、Lipofectamine 2000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen，美國(guó))，Growth Hormone ELISA Kit (Abcam, ab108643，美國(guó))。Transwell小室(Millipore，美國(guó))。

1.3 垂體生長(zhǎng)激素腺瘤組織和正常垂體前葉組織中的HOTAIR lncRNA mRNA檢測(cè) 取約100 mg受檢組織，TRIzol 提取總RNA，采用NanoDrop 1000明確其純度和濃度，A260/A280和A260/A230接近2.0。采用Platinum SYBR Green qPCR superMix-UD試劑盒建立25 μL反應(yīng)體系。HOTAIR lncRNA引物序列：正向(5′-3′)為GGTAGAAAAAGCAACCACGAAGC，反向(5′-3′)為ACATAAACCTCTGTCTGTGAGTGCC；內(nèi)參GAPDH引物序列：正向(5′-3′)為GAAGGTCGGAGTCAACGGATT，反向(5′-3′)為CGCTCCTGGAAGATGGTGAT。擴(kuò)增調(diào)節(jié)：Hold stage為50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min；Cycling stage為95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；Melt curve stage為95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min。HOTAIR lncRNA mRNA相對(duì)表達(dá)量以2-ΔCt(ΔCt=Ct目的基因-CtGAPDH)表示。HOTAIR lncRNA mRNA表達(dá)量高低以中位數(shù)為界。

1.4 垂體瘤細(xì)胞株GH3的HOTAIR lncRNA表達(dá)干擾、HOTAIR lncRNA mRNA及GH檢測(cè)、細(xì)胞侵襲力觀察 ①GH3細(xì)胞的HOTAIR lncRNA表達(dá)干擾：GH3細(xì)胞疏松貼壁培養(yǎng)于無(wú)酚紅的、含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期GH3細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將GH3細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、陰性對(duì)照組和HOTAIR lncRNA siRNA組：對(duì)照組不作特殊處理，陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染對(duì)照siRNA質(zhì)粒，HOTAIR lncRNA siRNA組轉(zhuǎn)染HOTAIR lncRNA siRNA質(zhì)粒后，培養(yǎng)72 h。陰性對(duì)照siRNA的引物序列：正向(5′-3′)為UUCUCCGAACGUGCACGUTT，反向(5′-3′)為ACGUGACACGUUCGGAGAATT；特異性抑制HOTAIR lncRNA 的siRNA引物序列：正向(5′-3′)為AAAUCCAGAACCCUCUGACAUUUGC，反向(5′-3′)為UUAAGUCUAGGAAGCACGAAGC。②各組GH3細(xì)胞的HOTAIR lncRNA mRNA檢測(cè)：方法同“1.3”。③各組GH3細(xì)胞培養(yǎng)液中生長(zhǎng)激素檢測(cè)：采用 Growth Hormone ELISA Kit (Abcam, ab108643)。按說(shuō)明書(shū)設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔，分別加入不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品50 μL和待測(cè)樣本10 μL+稀釋液40 μL，每孔各加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測(cè)抗體100 μL，空白孔不加。水浴，洗板，加底物(A、B各50 μL)，37 ℃避光孵育。加入終止液50 μL，孵育15 min，在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的光密度(OD)值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的OD值繪制線性回歸曲線，按曲線方程計(jì)算各樣本GH的濃度。④各組GH3細(xì)胞侵襲力觀察：采用 Transwell小室實(shí)驗(yàn)。收集陰性對(duì)照組、HOTAIR lncRNA siRNA組的細(xì)胞，消化后重懸于無(wú)血清培養(yǎng)基，制成5×104/mL細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液按每孔100 μL接種于預(yù)鋪基質(zhì)膠的8μm膜的Transwell小室上室，下室加入600 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。取出Transwell小室，PBS清洗， 5%戊二醛固定，0.01%結(jié)晶紫染色。顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野的穿膜細(xì)胞數(shù)(穿膜細(xì)胞數(shù)越少代表細(xì)胞侵襲力越小)，每組細(xì)胞設(shè)立3個(gè)平行復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 垂體生長(zhǎng)激素腺瘤組織和正常垂體前葉組織中的HOTAIR lncRNA mRNA表達(dá)比較 非侵襲性和侵襲性垂體生長(zhǎng)激素腺瘤及正常垂體前葉組織中的HOTAIR lncRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.60±0.25、 3.27±0.57、1.00±0.00；非侵襲性和侵襲性垂體生長(zhǎng)激素腺瘤組織中的HOTAIR lncRNA相對(duì)表達(dá)量與正常垂體組織相比，P均<0.05；侵襲性垂體生長(zhǎng)激素腺瘤組織中的HOTAIR lncRNA相對(duì)表達(dá)量與非侵襲性生長(zhǎng)激素腺相比，P<0.01。17例侵襲性垂體生長(zhǎng)激素腺瘤患者瘤組織中HOTAIR lncRNA mRNA高表達(dá)13例、低表達(dá)4例，34例非侵襲性垂體生長(zhǎng)激素腺瘤患者瘤組織中HOTAIR lncRNA mRNA高表達(dá)10例、低表達(dá)24例，兩者相比，P<0.01。

2.2 陰性對(duì)照組、HOTAIR lncRNA siRNA組的GH3細(xì)胞HOTAIR lncRNA mRNA、生長(zhǎng)激素表達(dá)量、細(xì)胞侵襲力比較 陰性對(duì)照組、HOTAIR lncRNA siRNA組的HOTAIR lncRNA mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.00、0.50±0.20，兩組相比，P<0.01。陰性對(duì)照組、HOTAIR lncRNA siRNA組的生長(zhǎng)激素表達(dá)量分別為(1.00±0.00)ng/mL、(0.64±0.15)ng/mL，兩組相比，P<0.05。陰性對(duì)照組、HOTAIR lncRNA siRNA組的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(177±11)、(57±9)個(gè)/視野，兩組相比，P<0.05。

3 討論

垂體生長(zhǎng)激素腺瘤是緩慢進(jìn)展的疾病, 但往往可造成多器官功能損害，在人群中總發(fā)病率約70/100萬(wàn)，每年新發(fā)病例約2/100萬(wàn)[12]。由于垂體生長(zhǎng)激素腺瘤生長(zhǎng)隱匿、發(fā)展緩慢，在患病 4～10 a才能確診，多診斷為大腺瘤和侵襲性腺瘤。侵襲性垂體生長(zhǎng)激素腺瘤因侵襲海綿竇、頸內(nèi)動(dòng)脈、下丘腦等重要結(jié)構(gòu)，手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)極大，根治性手術(shù)難以實(shí)施，且術(shù)后易復(fù)發(fā)[13]。因此，侵襲性垂體生長(zhǎng)激素腺瘤是臨床治療的難點(diǎn)。lncRNA的發(fā)現(xiàn)和功能學(xué)研究為腫瘤發(fā)病機(jī)制的探索提供了新的線索，也成為潛在的診斷標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)。HOTAIR lncRNA是首個(gè)被發(fā)現(xiàn)以反轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因表達(dá)的lncRNA，長(zhǎng)度為2 185 nt，位于12號(hào)染色體HOXC11與HOXC12之間。盡管HOTAIR基因序列保守性差，且同源間存在較大差異，但發(fā)揮生物學(xué)功能的區(qū)段的基因序列和結(jié)構(gòu)高度保守，可通過(guò)結(jié)合多梳蛋白調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)而發(fā)揮生物學(xué)作用[10]。2010年Gupta等[14]首次發(fā)現(xiàn)HOTAIR lncRNA在乳腺癌腫瘤組織及其轉(zhuǎn)移灶組織中的表達(dá)水平較癌旁組織顯著增高，且在轉(zhuǎn)移灶組織中普遍偏高，多因素分析顯示HOTAIR lncRNA高表達(dá)是預(yù)測(cè)患者轉(zhuǎn)移及高死亡率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一。Li等[15]在喉鱗狀細(xì)胞癌的研究中發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中的HOTAIR lncRNA顯著高于癌旁組織，且可作為一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因素和潛在的治療靶點(diǎn)。Yang等[16]對(duì)肝癌中HOTAIR lncRNA的表達(dá)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)肝癌組織HOTAIR lncRNA的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，且與肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。體外研究也證實(shí)，下調(diào)HOTAIR lncRNA表達(dá)可顯著提高腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑或柔比多星的敏感性，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，提示HOTAIR lncRNA可作為肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的一個(gè)潛在治療靶點(diǎn)。Kogo等[17]在結(jié)直腸腫瘤中也進(jìn)行了類(lèi)似研究，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中的HOTAIR lncRNA表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，且其表達(dá)水平與患者預(yù)后呈正相關(guān)，多因素分析也說(shuō)明HOTAIR lncRNA是患者生存期的獨(dú)立的危險(xiǎn)預(yù)測(cè)因子。此外， HOTAIR lncRNA的高表達(dá)亦可顯著提高腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。Gupta等[14]在體外研究發(fā)現(xiàn)高表達(dá)HOTAIR lncRNA顯著增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的侵襲性，而下調(diào)HOTAIR lncRNA表達(dá)則有效降低腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。Geng等[18]研究發(fā)現(xiàn)與癌旁組織相比，肝癌組織中HOTAIR lncRNA的表達(dá)水平顯著升高，且與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在顯著相關(guān)性，提示HOTAIR lncRNA可作為肝癌患者有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。Nakagawa等[19]研究發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌患者中，與原發(fā)性癌組織相比，腦轉(zhuǎn)移瘤組織中的HOTAIR lncRNA表達(dá)水平更高，且體外研究證實(shí)HOTAIR lncRNA高表達(dá)可誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞遷移。Niinuma等[20]發(fā)現(xiàn)HOTAIR lncRNA高表達(dá)與胃腸間質(zhì)瘤患者的高風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)及腫瘤轉(zhuǎn)移、侵襲能力密切相關(guān)，體外研究也證實(shí)下調(diào)HOTAIR lncRNA表達(dá)則可抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。Kim等[21]同樣發(fā)現(xiàn)HOTAIR lncRNA在胰腺癌細(xì)胞侵襲方面起著重要作用。

Gupta等[14]和Shi等[22]研究發(fā)現(xiàn)，HOTAIR與多梳蛋白抑制復(fù)合物(Polycomb repressive complex 2，PRC2)結(jié)合后作用于靶基因(包括JAM2、PCDH10等多個(gè)已知的抑癌基因)，導(dǎo)致H3組蛋白第27位賴氨酸三甲基化(H3K27me3)和H3組蛋白第4位賴氨酸二甲基化(H3K4me2)，使該位點(diǎn)的堿基發(fā)生表觀遺傳學(xué)沉默，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)。

在垂體瘤研究中，Li等[23]研究表明HOTAIR lncRNA的表達(dá)或與無(wú)功能垂體腺瘤的發(fā)展與侵襲有關(guān)。李九洲等[24]也指出下調(diào)內(nèi)源性HOTAIR lncRNA的表達(dá)可有效地增強(qiáng)替莫唑胺引起的垂體腺瘤細(xì)胞凋亡。在此基礎(chǔ)上，本研究就HOTAIR lncRNA對(duì)垂體生長(zhǎng)激素腺瘤侵襲和激素分泌的影響進(jìn)行了進(jìn)一步的探索，結(jié)果表明HOTAIR lncRNA在垂體生長(zhǎng)激素腺瘤的表達(dá)水平較正常垂體前葉明顯增加，且侵襲性垂體生長(zhǎng)激素腺瘤中的表達(dá)量較非侵襲性垂體生長(zhǎng)激素腺瘤明顯增加。由此推測(cè)HOTAIR lncRNA的高表達(dá)與垂體生長(zhǎng)激素腺瘤的侵襲性密切相關(guān)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)HOTAIRlncRNA siRNA轉(zhuǎn)染的GH3細(xì)胞GH分泌水平和腫瘤細(xì)胞侵襲性較陰性對(duì)照組顯著下降，由此推測(cè)HOTAIR lncRNA表達(dá)上調(diào)或可導(dǎo)致機(jī)體抗腫瘤效應(yīng)缺失，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤分泌功能和侵襲性增強(qiáng)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)垂體生長(zhǎng)激素腺瘤組織中HOTAIR lncRNA mRNA表達(dá)異常，且該表達(dá)異常與腫瘤的侵襲性密切相關(guān)，提示HOTAIR lncRNA可作為識(shí)別侵襲性垂體生長(zhǎng)激素腺瘤的新指標(biāo)。在垂體瘤GH3細(xì)胞中，抑制HOTAIR lncRNA的表達(dá)可降低GH3細(xì)胞的侵襲性和GH分泌能力，但具體調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步研究。推測(cè)HOTAIR lncRNA可能是垂體生長(zhǎng)激素腺瘤GH分泌水平和腫瘤細(xì)胞侵襲性的重要調(diào)控因素，隨著對(duì)HOTAIR lncRNA功能研究的不斷深入，其有望成為垂體生長(zhǎng)激素腺瘤的治療新靶點(diǎn)。