吳 姣，張 麗，霍 永

（ 河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 動物科技學(xué)院，鄭州 450046）

體細(xì)胞核移植是近年來人類在發(fā)育生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域所取得的最強(qiáng)大的成果之一，然而該項(xiàng)技術(shù)成功率低，技術(shù)研究薄弱，因此，分析體細(xì)胞核移植技術(shù)存在的問題，成為近年來體細(xì)胞核移植技術(shù)的研究重點(diǎn)。本文分析影響核移植成功率的影響因素。

自1997年英國科學(xué)家Wilmut拉開了體細(xì)胞核移植時代的序幕以來，先后在小鼠、牛、山羊、豬、貓、兔等動物上獲得成功。盡管體細(xì)胞核移植在理論研究和技術(shù)完善方面取得了長足的進(jìn)步，但克隆效率低的瓶頸依然無法突破。

1 供體核影響因素

1.1 供體核的類型

用作供體的體細(xì)胞是核移植的主要核心部分，也是影響移植成功率的主要因素之一。自從體細(xì)胞核移植技術(shù)誕生以來，已經(jīng)使用過多種類型的體細(xì)胞，所使用的體細(xì)胞分化程度越低，發(fā)育后期胚胎的基因重編程越容易，重組胚的發(fā)育潛力越高。目前研究應(yīng)用比較廣泛的成體細(xì)胞是生殖系統(tǒng)的細(xì)胞、胎兒成纖維細(xì)胞和成體成纖維細(xì)胞。卵丘細(xì)胞在G0/G1期時處于自然靜止?fàn)顟B(tài)，染色體端粒較短，但細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性較高，細(xì)胞不會因?yàn)槿旧w端粒的變短而老化。胎兒成纖維細(xì)胞來源廣泛，分化程度低，復(fù)制速度較快且不易衰老。相對于胎兒成纖維細(xì)胞，成體纖維細(xì)胞具有取材方便，對消化液比較敏感的優(yōu)點(diǎn)，且易得到純化的細(xì)胞。目前使用尾尖成纖維細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞、乳腺上皮細(xì)胞及心肌成纖維細(xì)胞等，都成功取得核移植后代。

1.2 供體核周期

供體核的DNA合成情況與其所處的細(xì)胞周期相關(guān)，處于G0/G1期的細(xì)胞為二倍體核，發(fā)生核編程時能夠在第一次細(xì)胞分裂的末期維持正常的染色體倍數(shù)。許多研究者也支持這個觀點(diǎn)。誘導(dǎo)供體細(xì)胞進(jìn)入G0/G1期階段的方法主要有細(xì)胞分選法、血清饑餓法、周期抑制劑、接觸抑制法等，血清饑餓法最為常見。有人認(rèn)為使用血清饑餓發(fā)會引發(fā)不同程度細(xì)胞凋亡，但大多數(shù)結(jié)果顯示，經(jīng)過血清饑餓處理過的供體細(xì)胞處于G0期利于重構(gòu)胚發(fā)育。而處于G2/M期的細(xì)胞用作供體核，染色質(zhì)發(fā)生成熟前染色質(zhì)凝集（PCC），很大程度會形成四倍體，經(jīng)復(fù)制形成八倍體染色體，胚胎無法正常發(fā)育。

1.3 受體

在早期試驗(yàn)中，人們嘗試使用卵母細(xì)胞、合子、早期胚胎等作為受體細(xì)胞用作核移植。研究結(jié)果表明，處于MⅡ期卵母細(xì)胞作為核受體后期發(fā)育情況較佳。MⅡ期卵母細(xì)胞胞質(zhì)被稱為“萬能胞質(zhì)”，胞質(zhì)內(nèi)MPF水平較高，能接受處于各個階段的體細(xì)胞核甚至胚胎卵裂球或早期胎兒細(xì)胞，能夠有效的構(gòu)建重組細(xì)胞，能支持胚胎的全程發(fā)育。

2 卵母細(xì)胞的顯微操作

去除卵母細(xì)胞的染色體-紡錘體得到卵母細(xì)胞胞質(zhì)作為受體細(xì)胞，保證重構(gòu)胚染色體正常，否則會影響重組胚的發(fā)育會受到阻滯。因此，保證重組胚正常發(fā)育的條件是得到既完整去除細(xì)胞核又減少卵母細(xì)胞胞質(zhì)的損傷。Willad?sen發(fā)明了3種去核方法：盲吸法、半卵法、功能性去核法；隨后，人們以Willadsen去核法為基礎(chǔ)，不斷進(jìn)行創(chuàng)新衍生出紡錘體圖像觀察系統(tǒng)去核法、染色示蹤去核法、化學(xué)試劑去核法、點(diǎn)壓法、末期去核法、蔗糖去核法等。

3 重構(gòu)胚的培養(yǎng)

哺乳動物重構(gòu)胚在體外培養(yǎng)時，培養(yǎng)液成分不適宜會阻礙胚胎發(fā)育。不同動物的培養(yǎng)液成分不同，小鼠胚胎常用CZB、牛羊胚胎多用SOF培養(yǎng)液。單純的CZB或SOF培養(yǎng)液成分簡單，不能提供胚胎早期發(fā)育需要的全部能量，添加能量底物（如血清、氨基酸、葡萄糖）可促進(jìn)胚胎發(fā)育。血清作為常用的能量底物可以保持細(xì)胞活性并對胚胎的生長發(fā)育發(fā)揮重要作用，但血清成分復(fù)雜，對重構(gòu)胚發(fā)育影響尚有不確定性。除添加能量底物外在培養(yǎng)液中添加輔助細(xì)胞（如輸卵管上皮細(xì)胞、卵丘細(xì)胞等）進(jìn)行共培養(yǎng)，通過輔助細(xì)胞分泌的營養(yǎng)因子有利于促進(jìn)胚胎發(fā)育。其中以輸卵管上皮細(xì)胞最常使用，并在豬、綿羊、小鼠等哺乳動物上能顯著性提高早期胚胎的發(fā)育率。在胚胎的體外培養(yǎng)系統(tǒng)中，使用共培養(yǎng)系統(tǒng)幫助胚胎渡過阻滯期的效果最為顯著。

4 前景展望

哺乳動物體細(xì)胞核移植具有非常廣闊的應(yīng)用前景，主要表現(xiàn)為：（1）通過核移植技術(shù)大量擴(kuò)增具有優(yōu)良性狀的個體，大大加速遺傳改良和育種進(jìn)程。（2）與轉(zhuǎn)基因技術(shù)相結(jié)合。生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物，通過體細(xì)胞核移植技術(shù)，簡化了轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)環(huán)節(jié)。（3）利用病人的組織細(xì)胞作為供體進(jìn)行核移植，克隆出早期胚胎培養(yǎng)新的胚胎干細(xì)胞系，體外誘導(dǎo)分化后進(jìn)行疾病治療。（4）其他科學(xué)研究，如生產(chǎn)藥用蛋白、保護(hù)瀕危物種、培育各種疾病動物模型。隨著這項(xiàng)技術(shù)的不斷完善，將會為人類帶來巨大的福利。