孫志明徐 琪徐 祿倪谷音王金美

(1.無錫市動(dòng)物園管理處，無錫，214151；2.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州，225009)

白枕鶴(Grusvipio)是國(guó)家Ⅱ級(jí)保護(hù)動(dòng)物，IUCN將其列為易危(VU)，丹頂鶴(Grusjaponensis)是國(guó)家Ⅰ級(jí)保護(hù)動(dòng)物，IUCN將其列為瀕危(EN)，受到動(dòng)物飼養(yǎng)、保護(hù)機(jī)構(gòu)的高度重視和保護(hù)。這2種鶴均為單態(tài)性鳥，兩性形體相似，它們的性別無論是幼鳥還是成鳥都很難從外觀或行為上進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，在人工養(yǎng)殖時(shí)，給配對(duì)造成很大困難。目前這2種鶴無論是野外數(shù)量還是圈養(yǎng)數(shù)量都沒有明顯上升，圈養(yǎng)條件下成功地鑒定性別可人為提高鶴類配對(duì)指數(shù)和繁殖率。

目前在鶴類上常見性別鑒定方法主要有利用繁殖季行為特征觀察、泄殖腔翻檢、糞便中雌激素與睪酮比例的測(cè)定、染色體分析、內(nèi)窺鏡探測(cè)等，但是這些方法準(zhǔn)確度都不高，且有的傷害性大、有的費(fèi)時(shí)費(fèi)力。隨著鳥類基因組研究發(fā)展，多個(gè)基因在非平胸鳥類W、Z染色體上均存在差異，如染色體螺旋蛋白基因(Chromo-helicase-DNA-Binding gene，CHD)。該基因在非平胸鳥類上有2個(gè)同源拷貝CHD-W和CHD-Z，而兩者的外顯子序列和大小相似，但內(nèi)含子大小卻有很大差別。又如EE0.6序列在W、Z染色體上有一段同源序列，但它們?cè)诖蟛糠中蛄猩蠀s存在差異。因此可根據(jù)W、Z染色體上基因序列差異來鑒別鳥類的性別[1-2]。與傳統(tǒng)方法相比，這種方法準(zhǔn)確、快速、方便，對(duì)動(dòng)物傷害小，在鑒定鳥類性別上起重要作用。

基于此，本研究以無錫市動(dòng)物園飼養(yǎng)的白枕鶴和丹頂鶴為研究對(duì)象，分別運(yùn)用CHD基因鑒定法和EE0.6序列鑒定法，并根據(jù)這一結(jié)果對(duì)白枕鶴、丹頂鶴進(jìn)行配對(duì)，孵化，驗(yàn)證這2種方法在鶴類性別鑒定中的可行性。

1 材料與方法

1.1 主要材料

樣本來自于無錫動(dòng)物園圈養(yǎng)條件下的白枕鶴(5只，編號(hào)B1-B5)、丹頂鶴(3只，編號(hào)D1-D3)。利用乙二胺四乙酸(EDTA)或肝素鈉方法收集全血樣本。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的提取

按照禽血DNA抽提試劑盒(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)說明書提取基因組DNA，利用蛋白質(zhì)核酸分析儀檢測(cè)基因組DNA的含量和純度，保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì)

利用CHD基因內(nèi)含子兩側(cè)保守序列，以及EE0.6序列W、Z染色體上的特異性片斷設(shè)計(jì)特異性引物，引物信息見表1。

1.2.3 PCR擴(kuò)增與瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)檢測(cè)

PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為20 μL，含10×Buffer(含Mg)2 μL、dNTPs(2.5 mM)2 μL、上下游引物(10 pmol/μL)各1μL、Taq酶(5U/μL)0.2 μL、模板DNA(100～200 ng/μL)1 μL、滅菌蒸餾水12.8 μL。反應(yīng)條件為94℃ 5 min；94℃50 s，57℃ 50 s，72℃ 50 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用Gene Genius凝膠成像儀分析檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。

表1 CHD 和EE0.6引物信息

Tab.1 CHD and EE0.6 primer information

1.2.4 白枕鶴、丹頂鶴配對(duì)與孵化記錄

根據(jù)PCR鑒定結(jié)果，對(duì)白枕鶴、丹頂鶴配對(duì)，并記錄受精蛋和孵化率。

2 結(jié)果

2.1 白枕鶴、丹頂鶴性別鑒定結(jié)果

利用引物2550F/2718R對(duì)白枕鶴、丹頂鶴性染色體連鎖基因—CHD基因在W、Z兩個(gè)染色體上的同源部分進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果見圖1。從圖1可以看出，B1、B2、B3、B4、D1、D2個(gè)體僅能擴(kuò)增出1條帶，即為雄性，而B5、D3個(gè)體可擴(kuò)增出2條帶，即為雌性。利用引物組合BW/FZ、CW/FZ、CW/DZ對(duì)白枕鶴、丹頂鶴EE0.6序列W、Z兩個(gè)染色體上的同源部分進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，3對(duì)引物擴(kuò)增結(jié)果一致，B1、B2、B3、B4、D1、D2個(gè)體僅能擴(kuò)增出1條帶，即為雄性，而B5、D3個(gè)體可擴(kuò)增出2條帶，即為雌性。從上可以看出，2種PCR鑒定方法結(jié)果一致。

圖1 CHD基因引物2550F/2718R擴(kuò)增結(jié)果電泳圖Fig.1 Electrophoresis diagram of amplification result of CHD gene primer 2550F/2718R 注：B1、B2、B3、B4、B5為白枕鶴；D1、D2、D3為丹頂鶴；M：1 000 bp DNA Ladder Marker Note：B1、B2、B3、B4、B5 are white-naped crane；D1、D2、D3 are red-crowned crane；M：1 000 bp DNA Ladder Marker

圖2 EE0.6序列不同引物組合BW/FZ、CW/FZ、CW/DZ部分?jǐn)U增結(jié)果電泳圖Fig.2 Electrophoresis diagram of partial amplification of BW/FZ，CW/FZ and CW/DZ in different combinations of EE0.6 sequences 注：B1、B2、B3、B4、B5為白枕鶴；D1、D2、D3為丹頂鶴；M：500 bp DNA Ladder Marker Note：B1、B2、B3、B4、B5 are white-naped crane；D1、D2、D3 are red-crowned crane；M：500 bp DNA Ladder Marker

2.2 白枕鶴、丹頂鶴配對(duì)與孵化結(jié)果

根據(jù)PCR鑒定結(jié)果，對(duì)白枕鶴、丹頂鶴配對(duì)，并記錄產(chǎn)蛋數(shù)，受精率和受精蛋孵化率(表2)。

表2 白枕鶴、丹頂鶴配對(duì)與孵化結(jié)果

Tab.2 Pairing and hatching results of white-naped cranes and red crowned cranes

3 討論

本研究分別利用CHD基因鑒定法和EE0.6序列鑒定法，對(duì)無錫動(dòng)物園5只白枕鶴和3只丹頂鶴進(jìn)行性別鑒定。2種鑒定方法的結(jié)果一致，B1、B2、B3、B4、D1、D2個(gè)體為雄性，B5、D3個(gè)體為雌性。CHD基因鑒定法和EE0.6序列鑒定法已先后在丹頂鶴、蓑羽鶴(Anthropoidesvirgo)、灰鶴(Grusgrus)、白鶴(Grusleucogeranus)、東方白鸛(Ciconiaboyciana)、黑冠鶴(Balearicapavonina)等珍稀鶴類擴(kuò)增出不同的片段[3-5]，劉鑫等[6]曾嘗試?yán)肊E0.6序列對(duì)白枕鶴的性別進(jìn)行鑒定，張紅霞[7]也曾利用CHD基因引物2550F/2718R和EE0.6序列鑒別了白枕鶴、蓑羽鶴、黑冠鶴、丹頂鶴和灰鶴性別，盡管這些方法能對(duì)性別作出判斷，有利于珍稀鶴類的繁殖，但是真正在生產(chǎn)中應(yīng)用案例還很少見。本研究為了驗(yàn)證該方法的實(shí)際可操作性，根據(jù)PCR鑒定結(jié)果對(duì)白枕鶴、丹頂鶴進(jìn)行配對(duì)，結(jié)果均成功孵化出后代，表明該P(yáng)CR鑒定結(jié)果可靠。與傳統(tǒng)鑒定性別相比，該方法采樣量小，取樣容易，對(duì)鶴類應(yīng)激反應(yīng)也不大，相對(duì)安全；利用穩(wěn)定遺傳的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增應(yīng)用來鑒定性別，結(jié)果更可靠；鑒定不受年齡的限制，從剛出生到成年個(gè)體均可通過PCR鑒定性別；操作簡(jiǎn)便、周期短，也易推廣。研究結(jié)果可為進(jìn)入繁殖期鶴類進(jìn)行配對(duì)提供了依據(jù)，避免了同性配對(duì)，從而提高繁殖效率，有效地保護(hù)物種。

[1] 陳武，謝淑敏，謝高基，等.PCR技術(shù)在鳥類性別鑒定上的應(yīng)用[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2006，36(6)：485-488.

[2] 包文斌，胡飛，徐琪，等.鳥類性別鑒定的分子生物學(xué)方法[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2007，34(10)：33-36.

[3] 田秀華，劉鑄，何相寶，等.7種鶴形目鳥類性別的分子鑒定[J].動(dòng)物學(xué)雜志，2006，41(5)：62-67.

[4] 劉鑄，田秀華，白素英.一種準(zhǔn)確簡(jiǎn)便的東方白鶴性別分子鑒定方法[J].野生動(dòng)物，2006，27(3)：50-53.

[5] Itoh Y，Suzuki M，Ogawa A，et al.Identification of the sex of a wide range of Carinatae birds by PCR using primer sets selected from chicken EE0.6 and its related sequences[J].Journal of Heredity，2001，92(4)：315-321.

[6] 劉鑫，張紅霞，包文斌，等.白枕鶴性別的分子鑒定方法[J].揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)：農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版，2009，30(1)：42-44.

[7] 張紅霞.鶴性別鑒定及線粒體遺傳多樣性與鶴系統(tǒng)發(fā)育分析[D].揚(yáng)州：揚(yáng)州大學(xué)，2008.