魏 凱陳春山* 耿 琰盧 巖

(1.北京市水生野生動(dòng)植物救護(hù)中心，北京，102100；2.北京動(dòng)物園，北京，100044)

三線閉殼龜(Cuoratrifasciata)，又稱金錢龜，隸屬龜鱉目(Testudines)、龜科(Emydidae)、閉殼龜屬，國(guó)內(nèi)主要分布于海南、廣東、廣西等地，國(guó)外主要分布于老撾和越南[1]，國(guó)內(nèi)很多學(xué)者對(duì)其生物學(xué)特性[2-4]、疾病防治[5-6]和養(yǎng)殖模式[7-8]等方面開(kāi)展了大量研究。但隨著三線閉殼龜藥用保健和觀賞價(jià)值被逐漸挖掘，市場(chǎng)需求劇增，對(duì)其野生種群的過(guò)度利用情況相當(dāng)嚴(yán)重，從而導(dǎo)致其資源量在短時(shí)間內(nèi)顯著下降。目前，三線閉殼龜?shù)囊吧Y源已瀕臨滅絕，在平原及丘陵地區(qū)已經(jīng)絕跡[9-10]。為了更好地保護(hù)三線閉殼龜?shù)姆N群資源，我國(guó)于1988年將其列為國(guó)家Ⅱ級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物，《中國(guó)瀕危動(dòng)物紅皮書》也將其列入極危等級(jí)[11]，對(duì)其野生資源的利用進(jìn)行了嚴(yán)格的限制。在此背景下，我國(guó)南方地區(qū)的部分養(yǎng)殖戶從上世紀(jì)90年代開(kāi)始嘗試人工飼養(yǎng)三線閉殼龜，隨著養(yǎng)殖技術(shù)的不斷成熟，養(yǎng)殖個(gè)體數(shù)量也得到了較大提升，很大程度上緩解了市場(chǎng)對(duì)野生資源的消耗?？梢哉f(shuō)，人工養(yǎng)殖技術(shù)的發(fā)展是解決三線閉殼龜瀕危狀態(tài)的有效途徑之一。但除現(xiàn)有的技術(shù)成果之外，仍存在一些問(wèn)題，例如沒(méi)有針對(duì)三線閉殼龜?shù)膶Ｓ蔑暳希渌Ｒ?jiàn)的龜鱉飼料在粗蛋白含量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)配比方面也無(wú)法滿足其日常需求。因此，如何通過(guò)改良飼料配比來(lái)實(shí)現(xiàn)健康養(yǎng)殖目的依然是我們努力的方向。目前，通過(guò)在水產(chǎn)飼料中添加植物提取物[12]、微生態(tài)制劑[13]等成分來(lái)促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)和提高免疫能力的研究逐漸受到人們的重視，這對(duì)龜鱉養(yǎng)殖中的飼料配比合成也具有指導(dǎo)意義。

微生態(tài)制劑主要包括益生菌(Probiotics)、益生元(Prebiotics)及合生元(Synbiotics)。其中，益生元一般是指能夠選擇性地促進(jìn)腸道有益菌群的增殖，對(duì)宿主健康及生長(zhǎng)起到直接或間接作用的非消化性食物成分。目前常用的益生元主要是寡糖、多糖和酸化劑，常用來(lái)提高動(dòng)物對(duì)飼料的消化和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用，從而降低飼料原料中主要蛋白飼料的用量。近年來(lái)，通過(guò)在水產(chǎn)飼料中添加益生元來(lái)促進(jìn)個(gè)體生長(zhǎng)，提高蛋白酶活性，增強(qiáng)宿主非特異性免疫力的研究逐漸成為熱點(diǎn)，例如對(duì)草魚生長(zhǎng)和非特異性免疫能力的影響[14]；對(duì)大菱鲆幼魚生長(zhǎng)性能、體組成的影響[15]；對(duì)克氏原螯蝦生長(zhǎng)的影響[16]等研究。但目前還缺乏對(duì)三線閉殼龜個(gè)體生長(zhǎng)、免疫能力以及飼料配比的相關(guān)研究。本研究采用在三線閉殼龜?shù)娘暳现刑砑右欢ū壤娜樵葱砸嫔?百泰?-A，其有效組分為35%的粗蛋白和53%的寡糖)，以了解其對(duì)三線閉殼龜生長(zhǎng)性能以及營(yíng)養(yǎng)成分表觀消化率的影響，為今后篩選最適宜的添加比例提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料

本試驗(yàn)所用飼料由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所提供，基礎(chǔ)飼料中粗蛋白含量為44.78%、粗脂肪為7.78%、總能為17.61MJ/kg，基本可以滿足三線閉殼龜?shù)娜粘I(yíng)養(yǎng)需求[17-18]。在2個(gè)試驗(yàn)組中，分別添加0%(對(duì)照組)和1%(試驗(yàn)組)的益生元(百泰?-A)，以G0、G1組表示，本實(shí)驗(yàn)所用的益生元(百泰?-A)是由美國(guó)國(guó)際原料公司提供，由自溶性啤酒酵母、奶組分和曬干的發(fā)酵產(chǎn)物組成的天然產(chǎn)品，其有效組分為35%的粗蛋白和53%的寡糖。飼料原料粉碎后經(jīng)擠壓制成2.0 mm的膨化顆粒飼料，原料混合時(shí)每組飼料中添加0.1% Y2O3作為指示劑，用于測(cè)定各類營(yíng)養(yǎng)成分的表觀消化率。2組飼料配方及營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表1，氨基酸組成見(jiàn)表2。

表1 基礎(chǔ)日糧配方和營(yíng)養(yǎng)水平(%)

Tab.1 Diet formula and nutrition level

表2 2組飼料中的氨基酸組成(%)

Tab.2 Amino acids composition of two groups

1.2 試驗(yàn)龜及其飼養(yǎng)管理

1.2.1 試驗(yàn)分組

試驗(yàn)用龜購(gòu)自廣東某養(yǎng)殖場(chǎng)，均為3齡雌性個(gè)體。將30只體質(zhì)健康且無(wú)疾病的三線閉殼龜，隨機(jī)分為2組，經(jīng)單因子方差分析(One-way ANOVA)2組間的初始體重?zé)o顯著差異(P>0.05)。

1.2.2 試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)和養(yǎng)殖設(shè)施

試驗(yàn)在北京市水生野生動(dòng)植物救護(hù)中心爬行動(dòng)物飼養(yǎng)室進(jìn)行，養(yǎng)殖時(shí)長(zhǎng)為150 d。飼養(yǎng)設(shè)施采用“爬行天下”的PB-120型智能箱，規(guī)格為120 cm×50 cm×50 cm，具備UVA、UVB、陶瓷加熱及通風(fēng)網(wǎng)等設(shè)備，并采用控溫器保持水溫恒定(±0.1℃)，試驗(yàn)期間水溫控制在30℃。每箱養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)龜3只。試驗(yàn)開(kāi)始前用20%高錳酸鉀溶液刷洗缸底和缸壁，5%聚維酮碘溶液浸泡1 d后待用。

1.2.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)期間每天10：00定時(shí)投喂1次，2 h后清理殘余餌料。殘余餌料烘干后稱重，以準(zhǔn)確記錄每組龜?shù)臄z食量，每隔30 d稱量實(shí)驗(yàn)龜體重1次。

1.3 糞樣收集

本試驗(yàn)的糞便樣品收集方法參考沈建偉等[19]，待糞樣收集完畢后置于70℃烘箱烘干，-20°C冰箱備檢。

1.4 分析檢測(cè)

飼料中的粗蛋白、粗脂肪、水分和灰分的測(cè)定分別按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法GB/T6432-1994、GB/T6433-2006、GB/T6435-2006和GB/T6438-1992進(jìn)行檢測(cè)?？偰懿捎醚鯊椚紵y(cè)定。

飼料和糞便中的氨基酸測(cè)定按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 18246-2000進(jìn)行檢測(cè)。飼料和糞便中三氧化二釔(Y2O3)含量測(cè)定依據(jù)王赤龍等[20]方法，采用等離子發(fā)射光譜ICP-AES法測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)計(jì)算及統(tǒng)計(jì)分析

1.5.1 各營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率

各營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率(Apparent digestibility coefficients，ADCS)的計(jì)算公式如下：

ADCS%=[1-(F/D×DY/FY)]×100

式中：D-飼料中某種營(yíng)養(yǎng)成分的含量(%)；F-糞便中相應(yīng)營(yíng)養(yǎng)成分的含量(%)；DY-飼料中三氧化二釔(Y2O3)的含量(%)；FY-糞便中三氧化二釔(Y2O3)的含量(%)。

1.5.2 生長(zhǎng)性能的評(píng)價(jià)指標(biāo)及計(jì)算方法

試驗(yàn)龜體重凈增量、日增重量、相對(duì)增重率、飼料系數(shù)、攝食率計(jì)算如下：

體重凈增量(g)=終末體重-初始體重；日增重量(g/d)=體重凈增量/飼養(yǎng)天數(shù)；增重率(%)=(體重凈增量/初始體重)×100；飼料系數(shù)=攝食量/體重凈增量；攝食率(%)=攝食量/[(初始體重+終末體重)/2×飼養(yǎng)天數(shù)]×100；蛋白質(zhì)效率(%)=(體重凈增量/粗蛋白質(zhì)攝入量)×100。

1.5.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。所有數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS19.0軟件進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)(Homogeneity test for variance)，如果方差齊性，采用單因子方差分析(One-way ANOVA)；如果方差不齊，則進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)(K-W分析)，P<0.05時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 飼料中添加乳源性益生元后對(duì)三線閉殼龜生長(zhǎng)性能的影響

研究結(jié)果表明，飼料中添加乳源性益生元后G1組的終末體重、相對(duì)增重率、日增重量、蛋白質(zhì)效率均顯著高于G0組(P<0.05)，而飼料系數(shù)及攝食率均顯著低于G0組(P<0.05)(表3)。

表3 三線閉殼龜?shù)纳L(zhǎng)性能(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)

Tab.3 Growth index of Cuora trifasciata

注：同一行數(shù)據(jù)肩標(biāo)字母不同，表示存在顯著差異(P<0.05)。下表同

Note：The same line of data is different from the superscript letter，which means there is a significant difference(P<0.05).The following table is the same

2.2 飼料中添加乳源性益生元后對(duì)蛋白質(zhì)和干物質(zhì)表觀消化率的影響

結(jié)果表明，飼料中添加乳源性益生元后對(duì)G0組和G1組的蛋白質(zhì)和干物質(zhì)消化率分別為，G1組均顯著高于G0組(P<0.05)(表4)。

表4 蛋白質(zhì)和干物質(zhì)表觀消化率結(jié)果(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)(%)

Tab.4 Apparent digestibility of protein and dry matter

2.3 飼料中添加益生元后對(duì)氨基酸消化率的影響

結(jié)果表明：G0組和G1組間總氨基酸消化率沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。必需氨基酸中，G1組的蛋氨酸、組氨酸、賴氨酸、亮氨酸、蘇氨酸的消化率均顯著高于G0組(P<0.05)；非必需氨基酸中，G1組的胱氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸的消化率顯著高于G0組(P<0.05)(表5)，其余的氨基酸消化率沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。由于分析檢測(cè)過(guò)程中色氨酸被破壞，故無(wú)法檢出比較。

表5 兩組飼料的氨基酸表觀消化率(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)(%)

Tab.5 Apparent digestibility of amino acids of two groups

3 討論

3.1 飼料中添加益生元對(duì)促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的作用

益生元作為一種微生態(tài)調(diào)節(jié)劑，具有選擇性地促進(jìn)有益菌的增殖、降低病原菌的致病力以及調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)等功能[21]，相比使用傳統(tǒng)抗生素所帶來(lái)的耐藥性、藥物殘留等風(fēng)險(xiǎn)，益生元是一種更為安全有效的促生長(zhǎng)劑。目前，在很多水產(chǎn)飼料中都添加了各類益生元成分，周小秋等[22]研究了在基礎(chǔ)餌料中添加不同比例甘果寡糖對(duì)鯉魚生長(zhǎng)的影響，其結(jié)果表明寡聚糖對(duì)鯉魚有顯著的促生長(zhǎng)作用。蘇純陽(yáng)等[23]研究了在基礎(chǔ)飼料中添加一定比例的益康素(寡聚糖類產(chǎn)品)對(duì)南美白對(duì)蝦生長(zhǎng)性能的影響，試驗(yàn)組在增重、成活率、飼料系數(shù)等指標(biāo)上均與對(duì)照組有顯著差異。肖明松等[24]研究了在飼料中添加不同種類和含量的益生元對(duì)中華鱉生長(zhǎng)、免疫功能和消化酶活力的影響，結(jié)果表明益生元有一定的促生長(zhǎng)作用，并可以提高多種酶活力。本文所添加的乳源性益生元(百泰?-A)是由自溶性啤酒酵母、奶組分和曬干的發(fā)酵產(chǎn)物組成。Li等[25]研究了在雜交條紋鱸餌料中添加百泰?-A能提高其增重率。本試驗(yàn)中，通過(guò)在基礎(chǔ)飼料中添加百泰?-A可以顯著提高三線閉殼龜?shù)脑鲋芈屎偷鞍踪|(zhì)效率，同時(shí)使飼料系數(shù)顯著降低。

3.2 益生元對(duì)促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收的作用

龜鱉和其他動(dòng)物一樣，為滿足生理需要，要從飼料中攝取蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、維生素和無(wú)機(jī)鹽等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其中蛋白質(zhì)是最重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。從其生理作用來(lái)看，蛋白質(zhì)是決定動(dòng)物生長(zhǎng)快慢的關(guān)鍵因素，Burr[26]研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加1%的百泰?-A能顯著提高美國(guó)紅魚(Sciaenopsocellatus)對(duì)高豆粕日糧蛋白質(zhì)的表觀消化率，并能顯著促進(jìn)其前腸上皮細(xì)胞和微絨毛發(fā)育，這是促進(jìn)其對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收的重要因素。而龜鱉對(duì)蛋白質(zhì)的需要量，其實(shí)質(zhì)是對(duì)氨基酸的需要，周小秋等[27-29]研究指出賴氨酸和蛋氨酸對(duì)水生生物蛋白質(zhì)的合成起到關(guān)鍵作用，賴氨酸缺乏會(huì)降低鱉的生活力，導(dǎo)致其食欲下降、生長(zhǎng)受阻，賴氨酸對(duì)鱉的增重、飼料系數(shù)、體蛋白沉積等指標(biāo)影響極顯著(P<0.01)；而蛋氨酸水平對(duì)特定生長(zhǎng)率、攝食量、飼料系數(shù)有極其顯著或顯著影響(P<0.01或P<0.05)。因此，賴氨酸或蛋氨酸缺乏引起攝餌量下降可能是導(dǎo)致蛋白合成能力下降的主要原因之一。本試驗(yàn)中，在飼料中添加益生元雖然對(duì)總氨基酸消化率沒(méi)有影響，但對(duì)賴氨酸和蛋氨酸消化率卻造成顯著差異(P<0.05)，這可能是造成2組三線閉殼龜?shù)鞍踪|(zhì)合成、吸收及其他生長(zhǎng)指標(biāo)出現(xiàn)差異的重要原因。

3.3 單一性使用益生元的局限性

雖然很多研究[30-32]已證實(shí)益生元可以促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，有效提高動(dòng)物的非特異性免疫。但也有很多國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)[33-34]指出益生元對(duì)試驗(yàn)對(duì)象的生長(zhǎng)沒(méi)有起到促進(jìn)作用，除了物種之間存在的生長(zhǎng)差異，還可能與益生元本身的作用機(jī)制有關(guān)。益生元是選擇性地促進(jìn)腸道有益微生物菌群的生長(zhǎng)繁殖和代謝以及優(yōu)化腸道有益微生物菌群的結(jié)構(gòu)和豐度的。因此，如果沒(méi)有相應(yīng)益生菌的參與，動(dòng)物腸道內(nèi)缺乏有益微生物菌群的話，單純使用益生元是無(wú)法競(jìng)爭(zhēng)性抑制病原微生物的生長(zhǎng)，而只能促進(jìn)已有的有益菌群生長(zhǎng)。因此，考慮到益生元的局限性，很多研究[35-37]已將益生菌和益生元的復(fù)合制劑(也稱為合生元)應(yīng)用在動(dòng)物養(yǎng)殖環(huán)節(jié)中，它的特點(diǎn)是高效配伍特定的益生菌和益生元，通過(guò)有針對(duì)性地促進(jìn)外源性益生菌在動(dòng)物腸道中定植和生長(zhǎng)，并選擇性刺激內(nèi)源有益菌群的增殖，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，改善動(dòng)物腸道微生態(tài)群系平衡，起到益生菌和益生元的雙重作用，從而更好地促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)和健康。下一步，我們也將在現(xiàn)有基礎(chǔ)上，重點(diǎn)研究飼料中添加合生元對(duì)三線閉殼龜生長(zhǎng)、非特異性免疫等方面的作用。

3.4 健康養(yǎng)殖模式的推廣對(duì)野生種群資源恢復(fù)的重要意義

物種的瀕危主要由環(huán)境因素、遺傳因素、經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展因素所決定。對(duì)于瀕危物種的資源恢復(fù)來(lái)說(shuō)，開(kāi)展人工養(yǎng)殖是一種有效的保育手段，目前所倡導(dǎo)的健康養(yǎng)殖模式則是未來(lái)人工養(yǎng)殖技術(shù)的主要發(fā)展方向。它是一個(gè)系統(tǒng)工程，是一種可持續(xù)的發(fā)展模式，可以保障動(dòng)物健康和經(jīng)濟(jì)效益的同步發(fā)展，其主要涉及養(yǎng)殖配套設(shè)施、飼料管理、動(dòng)物福利、疾病防治等方面。經(jīng)過(guò)20多年的發(fā)展，三線閉殼龜?shù)娜斯ゐB(yǎng)殖已經(jīng)逐漸走出了庭院式養(yǎng)殖，并向規(guī)?；?、專業(yè)化、生態(tài)化方向發(fā)展。隨著健康養(yǎng)殖模式的不斷完善、推廣，已能夠滿足市場(chǎng)對(duì)三線閉殼龜?shù)氖秤脭?shù)量、質(zhì)量安全性和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的多重需求，減少對(duì)野生種群的利用和破壞。本文從飼料配比方面入手，初步研究了益生元對(duì)三線閉殼龜?shù)淖饔茫兄谔岣呱L(zhǎng)性能，增強(qiáng)其抗病能力，并減少對(duì)抗生素的依賴，在一定程度上可以緩解經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展因素對(duì)野生三線閉殼龜?shù)膲毫?。該成果還可以應(yīng)用于物種保育技術(shù)研究，對(duì)野生種群資源恢復(fù)有一定意義。

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