高春霞，劉俊義，謝從坤，鄧 紅，李 涵，袁 莉

（陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安 710062）

0 引言

異葒草素（Isoorientin），又名3',4',5,7-四羥基-6-吡喃葡萄糖基黃酮，是一種天然的黃酮類物質(zhì)，其結(jié)構(gòu)式如圖1，因最早從葒草中分離發(fā)現(xiàn)而得名[1]。異葒草素主要存在于玉米、黑蕎麥、竹筍、苦菜、山楂、百香果、西番蓮等食物中[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，異葒草素具有清除自由基[4]、抑制癌細(xì)胞增殖[5-6]、抗氧化[7-8]、抗炎[9-10]、保肝[11-13]、調(diào)節(jié)免疫能力[14]等生物活性。天然抗菌成分一般為多酚或黃酮類物質(zhì)，提取物己經(jīng)廣泛用于抑菌劑[15]，異葒草素作為一種水溶性黃酮，其對(duì)微生物的作用至今鮮有報(bào)道。試驗(yàn)以鼠傷寒沙門氏菌為供試菌，通過(guò)研究異葒草素對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的抑菌效果、抑菌圈大小、最小抑菌濃度、生長(zhǎng)曲線、蛋白質(zhì)含量、細(xì)胞膜通透性及核酸含量等方面的變化來(lái)闡述異葒草素的抑菌效果及作用機(jī)制，為開(kāi)發(fā)高效低毒的抗菌藥物提供理論依據(jù)。

異葒草素結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。

圖1 異葒草素結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium），陜西師范大學(xué)食品微生物專業(yè)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 主要試劑

異葒草素，江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司提供，含量99%；NA培養(yǎng)基：蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉、瓊脂粉分析純?cè)噭?，均?gòu)于西安晶博化玻儀器供應(yīng)站；AO，EB雙染試劑盒，購(gòu)于上海七海復(fù)泰生物科技有限公司；考巴斯亮藍(lán)G-250，購(gòu)于西安晶博化玻儀器供應(yīng)站。

1.3 主要儀器

GHP-9270型隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海申賢恒溫設(shè)備廠產(chǎn)品；THZ-C型恒溫振蕩器，江蘇省太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠產(chǎn)品；Multiskan Go型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，美國(guó)熱電公司產(chǎn)品；DDSJ-308A型電導(dǎo)率儀、超凈工作臺(tái)，哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司產(chǎn)品；BS-224-S型電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；LDZX-50KB型上海申安立式滅菌器、DF-101S型恒溫磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品；徠卡Leica AF6000型熒光顯微鏡系統(tǒng)。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 異葒草素抑菌效果的測(cè)定

采用濾紙片擴(kuò)散法[16-17]進(jìn)行測(cè)定。準(zhǔn)確吸取100 μL受試菌懸液注入到冷凝培養(yǎng)基平板表面，并在平板表面等距貼放4～5個(gè)濾紙片（121℃，30 min滅菌），中間濾紙片添加無(wú)菌水為空白，兩邊濾紙片分別添加5 μL的一定濃度異葒草素溶液，于37℃條件下恒溫培養(yǎng)24 h。用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑，重復(fù)3次，結(jié)果用mm表示。抑菌率的計(jì)算公式為：

1.4.2 異葒草素對(duì)菌體生長(zhǎng)曲線的影響

采用分光光度法測(cè)定異葒草素對(duì)鼠傷寒沙門氏菌生長(zhǎng)速度的影響[18-19]。其方法為：取出處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌，并分別加入異葒草素使其終濃度為1 mmol/L，以轉(zhuǎn)速180 r/min搖床37℃的條件恒溫培養(yǎng)，每隔2 h取樣測(cè)量OD600，連續(xù)測(cè)定24 h，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以O(shè)D600值為縱坐標(biāo)，用蒸餾水代替異葒草素溶液作為對(duì)照試驗(yàn)，繪制出異葒草素作用下鼠傷寒沙門氏菌的生長(zhǎng)曲線。

1.4.3 異葒草素對(duì)菌體細(xì)胞膜通透性的影響

通過(guò)相對(duì)電導(dǎo)率法[20]和AO-EB染色法[21]測(cè)定電導(dǎo)率，從而測(cè)定異葒草素對(duì)菌體細(xì)胞膜通透性的影響。

（1） 測(cè)定相對(duì)電導(dǎo)率。用PBS清洗活化后的菌體并使之混勻。并分別加入異葒草素使其終濃度為1 mmol/L。取3 mL，以轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心15 min，取上清液待用。菌懸液置于37℃，120 r/min的搖床中，每隔2 h取1次，離心，取上清液3 mL測(cè)此時(shí)電導(dǎo)率；然后100℃熱死處理，離心測(cè)定上清液的電導(dǎo)率值，以蒸餾水替代異葒草素溶液作為空白對(duì)照[17]。

其相對(duì)滲透率的計(jì)算公式為：

式中：K——某時(shí)間電解質(zhì)相對(duì)滲透率，%；

J0——零時(shí)間電導(dǎo)率，ms/cm；

J1——某時(shí)刻的電導(dǎo)率，ms/cm；

J2——煮沸20 min，冷卻至室溫后電導(dǎo)率，ms/cm。

（2） AO-EB染色法。PBS清洗活化后處于生長(zhǎng)期的菌體，取5 mL，以轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心5 min，取上清，PBS重懸，重復(fù)2次；并分別加入異葒草素使其終濃度為1 mmol/L，混勻；放入培養(yǎng)箱中37℃振蕩保存6 h；取出后離心，棄PBS，各加入10 μL AO、EB染液，取10 μL樣品置于載玻片，蓋上蓋玻片，置于熒光顯微鏡下觀察并采集圖片。以蒸餾水代替異葒草素溶液作為空白對(duì)照。

1.4.4 異葒草素對(duì)菌體可溶性蛋白質(zhì)的影響

用考馬斯亮藍(lán)比色法[22]測(cè)定異葒草素對(duì)受試菌菌體可溶性蛋白質(zhì)含量的影響[18]。其方法為：菌體活化后用PBS清洗3次，混勻。加入并分別加入異葒草素，使其終濃度為1 mmol/L。菌懸液置于37℃，120 r/min的搖床中培養(yǎng)，每隔2 h取樣，離心，取上清液，加入考馬斯亮藍(lán)試劑于595 nm處測(cè)樣品管的吸光值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2）查得待測(cè)樣品的蛋白質(zhì)含量。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，蛋白含量為縱坐標(biāo)，繪制蛋白含量變化曲線，以蒸餾水作為空白對(duì)照。

蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2。

圖2 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.4.5 異葒草素對(duì)鼠傷寒總核酸泄露的影響

用PBS清洗活化后處于生長(zhǎng)期的受試菌株，并分別加入異葒草素使其終濃度為1 mmol/L，混勻，37℃，100 r/min環(huán)境下恒溫培養(yǎng)。每2 h取樣1次，將取樣液3 000 r/min離心15 min，取上清液加入96孔板用酶標(biāo)儀測(cè)量260 nm下的吸光度并記錄數(shù)據(jù)，以蒸餾水作對(duì)照組，每組平行3次，取平均值[23]。

2 結(jié)果與討論

2.1 異葒草素對(duì)鼠傷寒沙門氏菌抑菌效果的測(cè)定結(jié)果

異葒草素對(duì)鼠傷寒沙門氏菌抑菌效果見(jiàn)圖3，異葒草素對(duì)鼠傷寒沙門氏菌DIZ的檢測(cè)結(jié)果（X±s，n=5） 見(jiàn)表 1。

圖3 異葒草素對(duì)鼠傷寒沙門氏菌抑菌效果

表1 異葒草素對(duì)鼠傷寒沙門氏菌DIZ的檢測(cè)結(jié)果（X±s，n=5）

由表1可知，異葒草素對(duì)鼠傷寒沙門氏菌有一定的抑制效果，且隨著異葒草素濃度的增加，抑菌效果有一定的增強(qiáng)。當(dāng)異葒草素的濃度增加到30 mmol/L時(shí)，抑菌圈直徑和抑菌率達(dá)到最大，抑菌圈直徑為15.5±0.41 mm，抑菌率為91.36%。這說(shuō)明異葒草素有著一定的抑菌能力，且高濃度的異葒草素對(duì)鼠傷寒沙門氏菌有著較強(qiáng)的抑制作用。

2.2 異葒草素對(duì)鼠傷寒沙門氏菌菌體生長(zhǎng)曲線影響的結(jié)果

按照分光光度法測(cè)定異葒草素對(duì)鼠傷寒沙門氏菌生長(zhǎng)速度的影響。

異葒草素對(duì)鼠傷寒沙門氏菌生長(zhǎng)曲線的影響見(jiàn)圖4。

由圖4可以看出，隨著時(shí)間的增加，空白和加藥組的吸光度值都是不斷增加的，但增加的速度有所差別，空白組在0～14 h內(nèi)，吸光值不斷增加，在14～26 h內(nèi)吸光值趨于平穩(wěn)，說(shuō)明在有限的生存空間和營(yíng)養(yǎng)條件下，細(xì)菌的數(shù)量已經(jīng)達(dá)到了最大值。而加藥組，在0～2 h內(nèi)，細(xì)菌生長(zhǎng)速度與空白組相差不大，在2～18 h內(nèi)吸光度值不斷升高，但細(xì)菌生長(zhǎng)速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于空白組，這說(shuō)明異葒草素破壞了細(xì)菌正常的生長(zhǎng)周期和細(xì)菌的細(xì)胞分裂；18～26 h內(nèi)，吸光度值趨于平穩(wěn)，在16～26h內(nèi)空白組與加藥組的吸光度值之差逐漸減小。加藥組與空白組相比結(jié)果可以說(shuō)明異葒草素對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的的菌體生長(zhǎng)周期及細(xì)胞分裂有一定的抑制作用[24]，且隨著抑菌時(shí)間的增加，抑制作用逐漸降低。

圖4 異葒草素對(duì)鼠傷寒沙門氏菌生長(zhǎng)曲線的影響

2.3 異葒草素對(duì)鼠傷寒沙門氏菌菌體細(xì)胞膜通透性的影響結(jié)果

按照相對(duì)電導(dǎo)率法進(jìn)行試驗(yàn)，異葒草素對(duì)受試菌電導(dǎo)率的影響試驗(yàn)。

異葒草素對(duì)鼠傷寒沙門氏菌電導(dǎo)率的影響見(jiàn)圖5。

圖5 異葒草素對(duì)鼠傷寒沙門氏菌電導(dǎo)率的影響

由圖5可以看出，加入異葒草素的受試菌體細(xì)胞的相對(duì)滲透率明顯高于對(duì)照組。隨著異葒草素對(duì)菌體作用時(shí)間的延長(zhǎng)，受試菌體細(xì)胞的相對(duì)滲透率持續(xù)增加，且處理2 h后受試菌體細(xì)胞的相對(duì)滲透率變化的速率明顯升高，說(shuō)明經(jīng)過(guò)異葒草素處理的菌體細(xì)胞隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)K+，Na+等電解質(zhì)的滲出量不斷增大，這些離子的丟失導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定的環(huán)境被破壞、細(xì)胞膜的流動(dòng)性降低、多種代謝途徑受阻和多種酶的活性受到影響，以及細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的調(diào)節(jié)能力下降，使細(xì)胞失水或吸脹，從而起到抑菌作用[25]。8 h后相對(duì)滲透率逐漸持平，達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。

AO-EB熒光染色結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 AO-EB熒光染色結(jié)果

吖啶橙（AO）能透過(guò)胞膜完整的細(xì)胞，嵌入細(xì)胞核DNA，使之發(fā)出明亮的綠色熒光。溴乙錠（EB） 僅能透過(guò)胞膜受損的細(xì)胞，嵌入核DNA，發(fā)橘紅色熒光。因此，可以根據(jù)AO/EB熒光標(biāo)記觀察細(xì)胞形態(tài)和膜完整性。異葒草素對(duì)鼠傷寒沙門氏菌形態(tài)的影響如圖6所示。對(duì)照組菌體呈綠色，具有完整的膜結(jié)構(gòu)；異葒草素處理組部分菌體呈橘紅色熒光，該結(jié)果可進(jìn)一步證明，異葒草素處理可通過(guò)破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜完整性，進(jìn)而抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。

2.4 異葒草素對(duì)鼠傷寒沙門氏菌菌體可溶性蛋白質(zhì)的影響測(cè)定結(jié)果

按照考馬斯G250法測(cè)定，異葒草素對(duì)菌體可溶性蛋白質(zhì)的影響測(cè)定結(jié)果。

異葒草素對(duì)鼠傷寒沙門氏菌蛋白的影響見(jiàn)圖7。

圖7 異葒草素對(duì)鼠傷寒沙門氏菌蛋白的影響

菌體內(nèi)的可溶性蛋白主要是參與代謝的各種酶類，菌體在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生分泌性蛋白，這些蛋白會(huì)通過(guò)滲透作用穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入到菌液中，測(cè)量其含量可了解菌體細(xì)胞內(nèi)總代謝的變化[26-27]。由圖7可知，經(jīng)異葒草素處理后，受試菌液中可溶性蛋白質(zhì)含量下降。處理2 h后可溶性蛋白質(zhì)含量下降較為明顯，處理8 h后，受試菌液中可溶性蛋白質(zhì)含量基本保持不變，其原因可能為隨著處理時(shí)間的增加異葒草素的抑菌效果降低，同時(shí)有部分菌體繼續(xù)生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生可溶性蛋白。研究表明，異葒草素可抑制受試菌體中蛋白質(zhì)的合成，進(jìn)而產(chǎn)生抑菌作用，當(dāng)處理時(shí)間為8 h時(shí)抑制效果最為明顯。

2.5 異葒草素對(duì)鼠傷寒沙門氏菌總核酸泄露的影響測(cè)定結(jié)果

異葒草素對(duì)鼠傷寒沙門氏菌總核酸的影響見(jiàn)圖8。

圖8 異葒草素對(duì)鼠傷寒沙門氏菌總核酸的影響

由圖8可以看出，空白組菌液中核酸含量相當(dāng)且始終保持不變，而異葒草素處理組菌液中吸光度值逐漸增加，且在作用后2 h達(dá)到最大值，之后趨于穩(wěn)定。結(jié)果表明，異葒草素作用可嚴(yán)重破壞細(xì)菌細(xì)胞膜通透性和完整性，使細(xì)菌內(nèi)部的核酸穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入到細(xì)菌外部菌液中。

3 結(jié)論

濾紙片法試驗(yàn)結(jié)果表明，異葒草素鼠傷寒沙門氏菌有較強(qiáng)的抑制效果，且異葒草素濃度與對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的抑菌效果有正相關(guān)關(guān)系。通過(guò)測(cè)定菌體生長(zhǎng)曲線、電導(dǎo)率、生長(zhǎng)代謝、細(xì)胞膜通透性、菌體蛋白質(zhì)含量和菌體總核酸的泄露，初步弄清了異葒草素對(duì)菌體細(xì)胞的抑制機(jī)制。異葒草素不僅使菌體蛋白質(zhì)合成的速度受到抑制，菌體總核酸泄露嚴(yán)重，還使菌體細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，最終導(dǎo)致受試菌體內(nèi)電解質(zhì)滲漏，細(xì)菌增殖被抑制，菌體死亡。

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