羅 瑩，廖長秀，賀 珊，賴 術(shù)，黎為能

(1.右江民族醫(yī)學(xué)院機能實驗教學(xué)中心，廣西百色 533000；2.右江民族醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，廣西百色 533000；3.右江流域特色民族藥研究重點實驗室，廣西百色 533000)

原發(fā)性肝癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，每年新發(fā)病例超過50萬人，且其發(fā)病率仍不斷增長。中藥在控制肝癌病情發(fā)展、改善癥狀體征及提高生存質(zhì)量等方面具有獨特的優(yōu)勢。中藥溪黃草為民間常用草藥，主要用于治療急性黃疸型肝炎、急性膽囊炎、濕熱痢疾、腸炎、跌打瘀腫和養(yǎng)生保健等。現(xiàn)代藥理學(xué)研究溪黃草具有護(hù)肝利膽和抗腫瘤作用，作為多種抗肝癌復(fù)方組分用于肝癌的治療，也有研究報道溪黃草單方對肝癌細(xì)胞增殖有抑制作用，但其具體機制尚不清楚[1-2]。本文利用表達(dá)譜芯片技術(shù)，從系統(tǒng)藥理學(xué)角度研究溪黃草水提取物對人肝癌細(xì)胞HepG2相關(guān)基因的影響，以探討溪黃草抗肝癌的可能機制。

1 材料與方法

1.1材料 人肝癌HepG2購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所，胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，溪黃草購自廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，由右江民族醫(yī)學(xué)院覃道光副教授鑒定為溪黃草全株，Trizol為美國Invitrogen公司產(chǎn)品，總RNA提取試劑盒為美國Zymo Research公司產(chǎn)品、FastQuant RT Kit(With gDNase)、SuperReal熒光定量預(yù)混試劑增強版(SYBR Green)購自天根生化科技(北京)有限公司，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，DUSP1兔單克隆抗體購于英國Abcam公司，GAPDH鼠單克隆抗體、辣根(HRP)標(biāo)記羊抗兔IgG抗體、辣根(HRP)標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體為中杉金橋公司產(chǎn)品，其他Western blot電泳和轉(zhuǎn)膜及封閉試劑購于碧云天生物技術(shù)公司。

表1 DUSP1、IGFBP1、FXR和ALDH8A1引物

1.2方法

1.2.1溪黃草水提取物的制備 取溪黃草全株適量，加10倍量的水，煎煮2次，每次1 h，合并濾液，濃縮，經(jīng)冷凍干燥機制備成溪黃草水提取物凍干粉，-20 ℃密閉保存。臨用前用PBS溶解，高壓蒸汽滅菌，0.25 μm無菌濾器過濾后用完全培養(yǎng)基稀釋20倍(經(jīng)MTT實驗證實含該濃度的PBS對細(xì)胞生長無明顯影響)，配制成終濃度為9.54 mg/mL的溪黃草水提取物。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)及處理 HepG2細(xì)胞含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞密度為80%～90%時可進(jìn)行傳代，2～3 d傳代1次。取對數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶消化成單細(xì)胞懸液，調(diào)整至合適的細(xì)胞密度，分別接種至25 cm2培養(yǎng)瓶和6孔板，實驗分為2組：溪黃草水提取物組和陰性對照組(加含等量PBS的完全培養(yǎng)基)。細(xì)胞接種24 h后實驗組分別加入溪黃草水提取物終濃度是9.54 mg/mL的完全培養(yǎng)基，對照組加等量培養(yǎng)基，作用24 h后，25 cm2培養(yǎng)瓶加入1 mL Trizol，送至上海卓立生物科技有限公司進(jìn)行表達(dá)譜芯片檢測。6孔板細(xì)胞用總RNA提取試劑盒提取RNA。

1.2.3表達(dá)譜芯片研究 由上海卓立生物科技有限公司經(jīng)RNA提取、質(zhì)量鑒定合格后，與HOA 7.1版本的芯片進(jìn)行雜交，Cy5標(biāo)記aRNA，雜交程序為OneArray Plus，Agilent 0.1 XDR 程序掃描，分析28 266個基因的變化。

1.2.4RT-PCR驗證表達(dá)芯片的結(jié)果 6孔板細(xì)胞(每組重復(fù)3個復(fù)孔)提取細(xì)胞總RNA，用紫外分光光度法檢測總RNA純度和濃度，取1 μg RNA按試劑盒說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，取合成的cDNA進(jìn)行實時熒光定量PCR，引物由Primer Premier 5.0軟件設(shè)計，引物序列、產(chǎn)物大小見表1。反應(yīng)體系按試劑盒說明，GAPDH、DUSP1和IGFBP1反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃ 15 min；變性95 ℃ 10 s，退火/延伸60 ℃ 20 s，共40個循環(huán)(Roche Lightcycler96熒光定量PCR儀擴(kuò)增)；ALDH8A1和FXR反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃ 15 min；變性95 ℃ 10 s，退火60 ℃ 20 s，延伸72 ℃ 20 s，共40個循環(huán)(Bio-rad IQ5熒光定量PCR儀擴(kuò)增)，結(jié)果分析采用2-△△Ct法分析。

1.2.5Western blot驗證表達(dá)芯片的結(jié)果 6孔板細(xì)胞(每組重復(fù)3個復(fù)孔)提取細(xì)胞總蛋白，用BCA法檢測總蛋白濃度，取15 μg 蛋白與6×十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上樣緩沖液按5∶1比例混勻煮沸變性5 min，SDS-PAGE電泳，濕法轉(zhuǎn)膜，5% BSA封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜、洗膜，二抗室溫孵育2 h、洗膜，化學(xué)發(fā)光法顯色，膠片曝光適當(dāng)時間，經(jīng)顯影、定影后，掃描后用Image J軟件讀取各組條帶灰度值。

2 結(jié) 果

2.1相差顯微鏡觀察溪黃草水提取物對HepG2細(xì)胞的影響 相差顯微鏡下觀察，溪黃草水提取物9.54 mg/mL處理24 h后，細(xì)胞形態(tài)皺縮，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，見圖1。

A：陰性對照組；B：溪黃草水提取物組(9.54 mg/mL)

圖1相差顯微鏡觀察溪黃草水提取物對HepG2細(xì)胞的影響(×400)

2.2表達(dá)譜芯片觀察溪黃草水提取物對HepG2基因的影響 溪黃草水提取物(9.54 mg/mL)作用24 h后264個基因上升2倍以上，194個基因下降2倍以上。其中增加和下降至對照組5倍以上的基因見表2。

2.3表達(dá)譜芯片分析溪黃草水提取物對HepG2功能的影響 基因本體(GO)分析發(fā)現(xiàn)溪黃草主要影響24個HepG2分子功能、167個生物進(jìn)程通路和9個細(xì)胞組成。溪黃草處理后主要的GO分析變化的通路見表3。KEGG分析溪黃草主要影響7個HepG2信號通路，見表4。

表2 溪黃草水提取物(9.54 mg/mL)處理肝癌HepG2細(xì)胞24 h后變化達(dá)5倍以上的基因

續(xù)表2 溪黃草水提取物(9.54 mg/mL)處理肝癌HepG2細(xì)胞24 h后變化達(dá)5倍以上的基因

表3 溪黃草水提取物影響HepG2的表達(dá)譜芯片GO分析結(jié)果

表4 KEGG分析溪黃草改變HepG2的信號通路

2.4RT-PCR驗證部分芯片結(jié)果 將溪黃草水提取物處理的HepG2提取總RNA，實時定量PCR檢測DUSP1、IGFBP1、ALDH8A1和FXR(NR1H4)表達(dá)發(fā)現(xiàn)，與陰性對照組相比，溪黃草水提取物處理后可明顯增加DUSP1和IGFBP1的mRNA表達(dá)，降低ALDH8A1和FXR的mRNA表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，與芯片結(jié)果基本一致。

2.5Western blot驗證部分芯片結(jié)果 將溪黃草水提取物處理的HepG2提取總蛋白，Western blot檢測DUSP1蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)，與陰性對照組相比(蛋白條帶灰度值DUSP1/GAPDH為1.15±0.19)，溪黃草水提取物處理后(蛋白條帶灰度值DUSP1/GAPDH為2.87±0.35)可明顯增加DUSP1蛋白表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖2，與芯片結(jié)果一致(溪黃草水提取物處理后DUSP1 mRNA表達(dá)增加為陰性對照組的2.18倍)。

表5 溪黃草水提取物對HepG2中DUSP1、IGFBP1、FXR和ALDH8A1 mRNA表達(dá)的影響

*：P<0.01，與陰性對照組比較；芯片結(jié)果中倍數(shù)值是指溪黃草水提取組/陰性對照組

圖2 Western blot檢測溪黃草水提取物對HepG2細(xì)胞DUSP1蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

中藥治療疾病具有多組分、多靶點的特點。本研究采用表達(dá)譜芯片技術(shù)研究了治療肝病的經(jīng)典中藥溪黃草對肝癌HepG2細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)溪黃草水提取物可改變肝癌HepG2細(xì)胞458個基因的表達(dá)，并影響多個分子功能、生物進(jìn)程、細(xì)胞組分和相關(guān)的信號通路。

本研究發(fā)現(xiàn)溪黃草水提取物處理后促進(jìn)細(xì)胞增殖的細(xì)胞周期蛋白D(cyclin D1，CCND1)、細(xì)胞周期蛋白E(cyclin E1，CCNE1)、S期激酶相關(guān)蛋白2(S-phase kinase-associated protein 2，SKPZ2)[3]及起始識別復(fù)合物1(origin recognition complex subunit 1，ORC1)[4]均明顯降低，而抑制細(xì)胞增殖的細(xì)胞周期依賴性激酶抑制因子CDKN1A(cyclin-dependent kinase inhibitor 1A，p21)及CDKN2B(cyclin-dependent kinase inhibitor 2B，p15)則明顯升高，表明溪黃草可通過多種調(diào)控細(xì)胞周期的基因和蛋白抑制細(xì)胞增殖。

微小染色體維持蛋白(minichromosome maintenance proteins，MCM)是真核細(xì)胞DNA復(fù)制準(zhǔn)許因子中的一個重要成員，可啟動和參與DNA復(fù)制，對細(xì)胞DNA復(fù)制和周期具有調(diào)控作用[5]。其家族主要有MCM2～MCM7，已有研究表明MCM2、MCM3、MCM6、MCM7等在肝癌組織或肝癌細(xì)胞中異常表達(dá)，RNA干擾降低MCM7的表達(dá)可使肝癌細(xì)胞增殖減少、凋亡增多，細(xì)胞周期S期縮短，裸鼠移植瘤生長減慢[6-9]。本研究發(fā)現(xiàn)溪黃草水提取物處理的肝癌HepG2細(xì)胞MCM2、MCM3、MCM4、MCM5、MCM7均表達(dá)明顯降低，分別降至陰性對照組的0.35、0.32、0.41、0.39和0.40倍，提示溪黃草可能通過抑制MCM家族表達(dá)，進(jìn)一步抑制肝癌細(xì)胞增殖及使其更多處于靜止期，并促進(jìn)其凋亡。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)溪黃草水提取物處理HepG2細(xì)胞胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白超家族(insulin-like growth factor binding protein superfamily，IGFBPs)中IGFBP1、IGFBP3、IGFBP4、IGFBP6、IGFBP7、CYR61均明顯增加，分別增加至對照組的6.40、8.84、2.06、2.80、2.02和3.09倍，其中IGFBP1 mRNA表達(dá)已通過RT-PCR驗證與芯片結(jié)果一致。已知胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor，IGF)與胰島素結(jié)構(gòu)相似，是具有促進(jìn)物質(zhì)代謝、降低血糖、促進(jìn)細(xì)胞分裂等多種功能的細(xì)胞增殖調(diào)控因子。IGFBPs可與其結(jié)合，結(jié)合后IGF作用減弱[10]。有研究報道IGFBP1和IGFBP3在肝癌組織或肝癌患者血清均低于正常水平，其與肝癌的預(yù)后呈正相關(guān)[11-12]。也有研究報道IGFBP3可通過非IGF途徑抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡[13]，提示IGFBPs可能參與肝癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后。本研究結(jié)果表明溪黃草能提高部分IGFBPs表達(dá)，通過IGF和非IGF途徑抑制肝癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡。

已知MAPK(mitogen-activated protein kinase)是細(xì)胞內(nèi)一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可將細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞外，參與細(xì)胞的生長和分化、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和凋亡及血管的生成等[14]。目前已有研究表明MAPK相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(ERK1/2、p38、JNK和ERK5)通過調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲及轉(zhuǎn)移[15-16]，在肝癌的發(fā)生過程中起著重要的調(diào)控作用，成為肝癌防治的重要作用靶點。而雙特異性磷酸酶(dual-specificity protein phosphatases，DUSPs)則可使MAPK去磷酸化，而抑制其活性，進(jìn)一步調(diào)控肝癌的發(fā)生、發(fā)展[17]。目前已有研究證實，DUSP1在抑制肝癌發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，它的表達(dá)與ERK的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與肝癌細(xì)胞增殖指數(shù)，細(xì)胞的凋亡和存活率，以及微血管密度緊密相關(guān)[18]?？赏ㄟ^調(diào)控 p-38/MAPK磷酸化增強p-53的磷酸化水平，誘導(dǎo)其下游靶基因p21和p27的表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡[19]。研究表明DUSP5同家族中的其他成員一樣，通過調(diào)控MAPK信號通路，調(diào)控多種腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移等過程，與腫瘤的發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)[20-21]。但是對肝癌細(xì)胞的影響方面尚未見有相關(guān)研究。本研究發(fā)現(xiàn)溪黃草水提取物處理的肝癌HepG2細(xì)胞DUSP1(2.18倍，RT-PCR及Western blot結(jié)果均已證實)、DUSP5(5.92倍)、DUSP6 (2.89倍)和DUSP13(4.86倍)表達(dá)均明顯升高，而DUSP9(0.44倍)表達(dá)下降，提示溪黃草水提取物可通過升高部分DUSPs活性，抑制MAPK的細(xì)胞增殖作用，從而達(dá)到抗肝癌或其他腫瘤的作用。

本研究通過芯片和RT-PCR技術(shù)均發(fā)現(xiàn)溪黃草處理后肝癌細(xì)胞ALDH8A1(aldehyde dehydrogenase 8 family,member A1)顯著降低，ALDH8A1主要參與9-順式視黃醛轉(zhuǎn)化為9-順式視黃酸的過程[22]，目前關(guān)于其與肝癌的關(guān)系研究較少，溪黃草顯著下降A(chǔ)LDH8A1 mRNA表達(dá)(已通過RT-PCR驗證與芯片結(jié)果一致)的作用究竟對肝癌治療的是利還是弊有待進(jìn)一步研究。法尼酯X受體(farnesoid X receptor，F(xiàn)XR)調(diào)節(jié)膽汁酸代謝、膽固醇代謝、脂代謝，有研究報道FXR在肝癌組織表達(dá)高于癌旁組織，去除FXR則可自發(fā)生成肝臟腫瘤，激活FXR則可抑制肝癌細(xì)胞增殖[23-25]。本研究顯示，溪黃草水提取物可顯著降低肝癌細(xì)胞FXR的表達(dá)，是否會抑制其抗肝癌作用還有待于進(jìn)一步研究。

有研究表明溪黃草含有多種活性抗腫瘤成分如二萜類化合物、三萜類化合物、多酚類化合物及活性多糖[26]，溪黃草水提取物的抗肝癌作用可能是這多種抗腫瘤活性成分的協(xié)同作用，具體這些活性成分在溪黃草抗抗肝癌中的比重還需進(jìn)一步通過譜-效關(guān)系確定。

綜上所述，表達(dá)譜芯片表明溪黃草水提取物主要可上調(diào)IGFBPs、DUSPs及CDKNs等抑癌基因的表達(dá)，下調(diào)與腫瘤細(xì)胞增殖和DNA復(fù)制相關(guān)的MCMs等基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞增殖和DNA復(fù)制，從而發(fā)揮其抗肝癌作用。但也可能上調(diào)促肝癌發(fā)生、發(fā)展基因(如MMP3、CYP1A1等)的表達(dá)，下調(diào)抑制肝癌發(fā)生、發(fā)展基因(如FXR等)的表達(dá)，需要辨證或整體看待溪黃草對肝癌的作用，以及進(jìn)一步研究這些基因整體對肝癌的調(diào)控作用。

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