李延華 王偉軍 陳望華 張仲慧 俞佳麗 樓錦雯

(浙江工商大學食品與生物工程學院1，杭州 310018) (浙江一鳴食品股份有限公司2，溫州 325000)

食品中涉及的脂質(zhì)氧化反應是食物腐敗變質(zhì)的重要原因之一，并影響保質(zhì)期和產(chǎn)品質(zhì)量。食物中不飽和脂質(zhì)的氧化可視為酸敗，同時蛋白質(zhì)的氧化也可能導致其他異味，且在某些情況下會導致質(zhì)地的變化。維生素和多不飽和脂肪酸的氧化會降低營養(yǎng)價值，并形成潛在的有毒氧化產(chǎn)物，同時食品中天然色素的氧化會導致食品變色。食品中不同組成成分在氧化過程中會發(fā)生一系列反應，如自動氧化、光敏氧化、酶促氧化等，自由基是一些反應的中間體[1]。自由基又稱游離基，是指外層軌道含有不成對電子的原子、原子團或特殊狀態(tài)的分子。

目前，可以采用分光光度法、高效液相色譜法、化學發(fā)光技術、電化學法、毛細管電泳技術及電子順磁共振技術等方法檢測自由基[2]。采用電子順磁共振(ElectronParamagneticResonance，EPR)可以檢測出生物材料中自由基的存在，ESR可以應用于食品氧化破壞性反應的早期階段[3]。此外，通過ESR檢測自由基所提供重要的機理信息，可用于來設計食品的抗氧化防護措施[4-5]。采用ESR檢測自由基來預測食品的氧化穩(wěn)定性，并進一步量化預測食品質(zhì)量的變化具有重要意義。

1 食品中自由基的ESR檢測

1.1 ESR檢測食品中自由基的原理

ESR也被稱為電子磁共振(Electronmagneticresonance，EMR)可在原子和自由基中檢測未成對電子。波譜學研究中，通常是把被測物質(zhì)放在靜磁場中,來控制不成對電子之間產(chǎn)生的能級分裂。ESR基本原理為電子是具有一定質(zhì)量和帶負電荷的一種基本粒子，它能進行兩種運動：一是在圍繞原子核的軌道上運動，二是通過本身中心軸所做的自旋。由于電子運動產(chǎn)生力矩，在運動中產(chǎn)生電流和磁矩，在外加磁場中，簡并的電子自旋能級將產(chǎn)生分裂。若在垂直外磁場方向加上合適頻率的電磁波，能使處于低自旋能級的電子吸收電磁波能量而躍遷到高能級，從而產(chǎn)生電子的順磁共振吸收現(xiàn)象[3,6]。

ESR光譜以G因子為特征，其與塞曼效應有關，且由公式確定。其中h是普朗克常數(shù)(6.626 075 5·10-34J·S)，υ為應用微波輻射的頻率，β為Bohr磁子(9.274 015 4·10-24J·T-1)，B為磁場。

hυ=gβB

順磁核往往可以引起ESR線超精細分裂，所形成的未成對電子相互作用，提供有用的結構信息使自由基被識別。大多數(shù)商業(yè)ESR儀器操作的微波頻率約為10GHz(X波段)。固體和液體可用寬溫度范圍內(nèi)的ESR研究，且樣品不需要透明，這使得該技術可用于研究食物。非常高的靈敏度使得該技術可檢測出食品氧化早期階段的自由基，可采用ESR技術比較幾種食品樣品中自由基的相對濃度。在這種情況下，樣品盡可能保持一致是非常重要的。因此，當必須計算自由基的絕對濃度時，使用具有盡可能與樣品相同的已知濃度的穩(wěn)定自由基作為參考樣品至關重要。1.2ESR在不同食品中存在的自由基的檢測中的應用

在食物氧化過程中形成的基團通常是高度反應性物質(zhì)，因此，在大多數(shù)情況下僅作為具有非常低的穩(wěn)態(tài)濃度的短壽命中間體被遇到。自由基的壽命往往在固體樣品中急劇增加，例如干燥或冷凍的食物，其中的分子成分被物理捕獲，從而防止或減緩化學反應，否則將迅速淬滅自由基的形成[7]。通?？梢詫崿F(xiàn)：在室溫下采用ESR直接檢測干燥食物中的持續(xù)性自由基，其中ESR可檢測的物理捕獲自由基濃度可在生產(chǎn)和儲存期間累積。在干燥食品的ESR光譜中僅觀察到G值范圍在2.003～2.006的一條單線和總振幅寬度為4～12高斯(圖1)。此外，由于Mn2+的存在，在很多情況下生物組織的ESR譜中可以觀察到到六重線(圖1)[8]。

圖1 干燥食品中自由基的典型ESR譜圖

在干燥食品或含有固體物質(zhì)，如骨或殼等固體材料的食品中，自由基的保留時間使其可能用ESR檢測和定量(劑量)輻照處理，可以形成具有特征ESR譜的穩(wěn)定自由基常數(shù)[9]。干燥食品中穩(wěn)定自由基的起源是未知的，一些來源已經(jīng)被提出，包括碳水化合物熱處理所產(chǎn)生的反應[10]，或多酚的氧化[11]和蛋白質(zhì)的氧化[4]，或美拉德產(chǎn)物的形成[12]。然而，干燥食品中的穩(wěn)定自由基已被證明是干燥產(chǎn)品氧化狀態(tài)的良好的標記，且一些研究顯示自由基的水平與脂質(zhì)氧化程度或與外部因素如熱、光和儲存時間相關，都有可能誘發(fā)氧化(見表1)。

表1 干燥食品中自由基的ESR檢測

除了干燥食品外，冷凍食品樣品中的自由基穩(wěn)定化可以直接采用ESR檢測，用于研究油脂自動氧化中涉及的自由基。Yanez等[26]和Geoffrey等[27]研究了77K下光誘導冷凍甘油三酯中脂質(zhì)自由基的形成，提出光照和提高溫度會使不飽和脂質(zhì)產(chǎn)生大量的自由基，而飽和脂質(zhì)在過氧自由基損失出現(xiàn)的情況下沒有形成新的自由基。Troup等[28]已在葡萄酒的冷凍樣品中檢測到從酚類化合物中衍生的自由基，提出葡萄酒中的自由基與酚類物質(zhì)有關，任何抑制脂質(zhì)氧化的葡萄酒中的酚類物質(zhì)在體外將產(chǎn)生自由基。

2 自旋捕獲在食品中自由基檢測方面的應用

大多數(shù)食物都含有水，這些水可以使食品中的成分擴散。因此，大多數(shù)食品中的自由基很短暫，穩(wěn)態(tài)濃度太低的不能用ESR技術直接檢測到。然而，在這些條件下的自由基間接檢測可以通過使用自旋捕獲技術進行。通過使用自旋捕獲技術，將反應性自由基引入自旋陷阱形成穩(wěn)定自由基(稱為自旋加合物)(圖2和圖3)[29]。自旋加合物的穩(wěn)定性允許ESR檢測濃度的積累。自旋捕獲技術已被用來表征在飲料中形成的自由基，如：咖啡[30]以及在啤酒氧化過程中形成的自由基(圖4)[31]。

圖2 食物中用于捕獲自由基的常見自旋捕集物質(zhì)

圖3 添加自旋引發(fā)劑形成的自旋加合物

圖4 采用旋轉阱DMPO并通過Fenton反應產(chǎn)生自由基

自旋捕集技術也被用于檢查自由基在富含魚油的蛋黃醬的形成趨勢，以評價富含魚油的蛋黃醬中不飽和脂類抗氧化的保護措施[32-33]。將自旋阱PBN混合到蛋黃醬中，并且在通過ESR檢測自由基的量之前將樣品在37 ℃下溫和加熱24～36h，自由基的量可以通過與在蛋黃醬中發(fā)現(xiàn)的穩(wěn)定氮氧自由基12-硬脂酸來量化[34]。

3 預測食品氧化穩(wěn)定性

食品的加速老化經(jīng)常被用來預測食物的長期穩(wěn)定性。通常測定氧化水平，是測量初次或二次氧化產(chǎn)物的形成。采用ESR檢測技術可以更為直接地研究參與氧化反應的自由基，這使得在強制老化實驗中，它能夠更直接地確定氧化水平。該方法已被用于釀酒行業(yè)，并取得巨大成功，可用于預測啤酒風味穩(wěn)定性[35-37]。在除去溶解的CO2之后，將自旋陷阱(PBN)添加到啤酒中，然后啤酒用進入大氣中的氧氣加熱(50～60 ℃)。啤酒中抗氧化劑的存在將在最初抑制自由基的形成，導致在實驗開始時自旋加合物水平較低?？寡趸瘎┍黄渥陨硇袨樗?，以至于當所有活性抗氧化劑被消耗完時，自由基最終會不受阻礙的形成，導致自旋加合物水平穩(wěn)步上升，圖5為有氧加熱過程中啤酒中形成PBN自旋加合物。

圖5 在有氧加熱過程中啤酒中形成PBN自旋加合物

初始滯后階段(也被稱為誘導期或滯后時間)的長度主要是由抗氧化劑和氧化劑之間的競爭決定的，這也可能是啤酒常規(guī)存儲條件下氧化穩(wěn)定性的關鍵因素。鮮啤酒滯后時間的確定已被證明與貯存穩(wěn)定性相關，使該方法適合于保質(zhì)期的早期預測。ESR延遲時間法也被用于檢測潛在的抗氧化劑對啤酒氧化穩(wěn)定性的影響[38]。

ESR滯后時間法已用于脂質(zhì)體穩(wěn)定性的預測，原則上也可以使用它來判斷脂質(zhì)是否存在于更復雜的系統(tǒng)[30,39]。Velasco等[40]用ESR方法測定的植物油中脂肪氧化的延遲時間已顯示出與傳統(tǒng)量化脂質(zhì)穩(wěn)定性的方法相關。Raitio等[41]采用ESR技術檢測了在50 ℃下儲存7d的半固體棕櫚油中自由基的變化，并預測提出可以采用ESR技術分析棕櫚油在儲存過程中發(fā)生的劣變。Roman等[42]采用該技術研究了植物油中氫過氧化物降解的動力學過程，發(fā)現(xiàn)ESR技術可以識別、量化和衡量可食用植物油的氫過氧化降解反應。

采用自旋捕獲檢測熱處理過程中自由基的形成趨勢也被用來評估原料乳[43]、甘蔗酒[44]、加工豬肉[45]和干腌火腿[46]的氧化穩(wěn)定性。將肉樣品在含有旋轉陷阱POBN的緩沖液中勻漿，然后加熱漿液，再從漿料中取樣，過濾并隨后通過ESR分析。

4 ESR技術在食物氧化過程中的應用

ESR也被用來檢測單線態(tài)氧1O2的產(chǎn)生，在自由基不參與的情況下可誘導甘油二酯氧化[47]。單線態(tài)氧可氧化2,2,6,6-四甲基-4-哌啶酮為穩(wěn)定的硝酰自由基，后者可以用ESR檢測。該技術已被用于研究單線態(tài)氧的生成，這主要是通過色素，如葉綠素和肌紅蛋白發(fā)生作用產(chǎn)生。ESR和自旋捕獲自由基已被用于鑒定核黃素在光線中的特征作用，在啤酒中誘導形成自由基[48]，并確定異草酮氧化時的中間體[49]，同時異草酮的直接光降解可以用具有時間分辨的ESR(TREPR)研究[50]。

抗氧化劑的存在是影響食品氧化穩(wěn)定性的一個重要因素。測定食品中抗氧化劑有效性的許多實驗是基于測量淬滅穩(wěn)定自由基的能力，這種方法被稱為自旋清除，該方法已經(jīng)和ESR檢測一起用于穩(wěn)定自由基的檢測，如1,1-二苯基-2-苦肼基自由基、DPPH[51]、2,6-二叔丁基-(3,5-二叔丁基-4-氧代-2,5-環(huán)己二烯)-對甲苯氧自由基[52]和2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基自由基、TEMPO[23]。ESR譜證明這些研究是有效果的，因為較低濃度的自由基水平即可研究不具有光學透明的樣本。Falch等[53]采用ESR技術分析了輕度氧化的大馬哈魚內(nèi)臟油和魚肝油的氧化程度，同時測定了兩種魚油中在存放過程中過氧化值和硫代巴比妥酸值的變化。

ESR的線寬取決于Heisenberg自旋交換生成順磁性物質(zhì)的存在。氧是一個非常常見的順磁性化合物，氧的濃度會影響線的寬度。通過記錄穩(wěn)定自由基的線寬(所謂的自旋探針)可以測量氧氣濃度。這種方法已被用來測量封裝在玻璃狀的碳水化合物/蛋白質(zhì)基質(zhì)中的氧的濃度，從而研究在不同溫度下氧穿透玻璃狀食品組分的能力[54]。

5 展望

在食品科學領域，ESR是一種相對較新的分析方法，已成功檢測不同食品中存在的自由基，并用來預測食品的氧化穩(wěn)定性。同時，自旋陷阱的引入有利于形成穩(wěn)定的自由基，并提可以提高ESR在食品體系中自由基的檢測效果。然而，ESR技術測定成分較高，低成本和便于用戶使用型的新一代ESR儀器有利于食品質(zhì)量控制實驗室的引進與應用。此外，在食品體系中用于自由基形成過程成像的場梯度ESR光譜技術有待進一步發(fā)展，原因在于氧化過程的空間傳播可以在多相的食品體系中進行研究，并且可以用來鑒定促氧化物質(zhì)的結構以及優(yōu)化食品中抗氧化成分的效果。

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